肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

サマリー

癌の転移拡散は、癌関連死の主要な原因です。私たちは、固形臓器腫瘍で転移のメカニズムを研究するための「患者様」同所同系マウスモデル系を確立するための私たちの生存の手術方法の詳細な説明を提供します。

要約

癌関連の死亡の大部分は、原発腫瘍自体ではなく、癌の転移によって引き起こされます。しかし、がんの転移の根本的なメカニズムはまだ不明です。動物モデルは、転移性がんの治療メカニズムを解明し、新しい戦略を評価するために不可欠です。ここでは、固形臓器腫瘍の転移メカニズムを探るための「患者様」同所性同系マウスモデルについて詳しく説明します。近交系野生型免疫コンピテント実験用マウス株BALB/cの肝臓(起源器官)へのBNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌細胞の生存外科的移植が記載されている。この方法論の成功と再現性は、固形臓器がん転移の生物学的メカニズムを解明する上での広範な使用を推奨しています。

概要

肝細胞癌(HCC)は、予後が悪く、平均余命が短い、最も致命的な癌の一つです。がん関連の死亡のほぼすべては、発生元の臓器から追加の遠隔臓器への疾患の転移性転移によるものです^2-6。HCCの進行は複雑なプロセスです。したがって、動物モデルの転移性HCCに自然に見られる腫瘍微小環境をモデル化できることは、ヒトの関連メカニズムを明らかにするための成功した有用な方法であることが証明される可能性があります。⁷名残念ながら、がんの転移のメカニズムはまだほとんどわかっていません。そのため、^HCC3,5などのがんの転移の分子メカニズムを解明するための動物モデルを確立する必要があります。

マウスモデルシステムは、転移性ヒト癌の治療のためのメカニズムを描写し、新しい戦略を評価するための非常に有用なアプローチです^5,8。現在存在するさまざまなマウスモデルシステムは、疾患の複雑さを正しく描写するための研究者の努力の証です^5,8,9。

Ogunwobiらは最近、HCC³の転移を研究するための新しい同所性同系マウスモデルの確立を実証するために、生存外科的アプローチを使用しました。彼らの研究は、侵攻性および転移性HCCの特徴を再現する「患者様」マウスモデルを確立しました³。さらに、このマウスモデル系は、循環腫瘍細胞の生物学の研究に利用できること、また、がん転移のメカニズムについて新たな知見を得る可能性を秘めていることを実証しました³。

この論文の目的は、HCC転移³のこの「患者様」同所性同系マウスモデルを確立する際に使用された方法論を詳細に説明することです。近交系野生型免疫コンピテント実験用マウス系統BALB/c³の肝臓(起源器官)にBNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を直接移植する方法について、生存手術を用いて説明する。ヒト腫瘍細胞が免疫不全マウスに移植される他のマウス異種移植腫瘍モデルとは異なり、このシステムは同系であるため、腫瘍転移における免疫系の役割を研究するのに適しています^3,5,8。このアプローチは、固形臓器がんの転移メカニズムの研究に広く使用されるようになると思われます。

プロトコル

倫理ステートメント
すべての動物実験は、ニューヨーク市立大学ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

注：8 BALB / cマウスは、この実験手順で使用しました。五BALB / cマウスは、原発腫瘍を産生する5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌細胞を移植しました。無移植で三BALB / cマウスを対照として使用しました。 BNL 1ME A.7R.1は、マウス非腫瘍形成性肝細胞株BNL CL.2から化学変換によって得られたマウスの肝細胞癌細胞株です。 BNL 1ME A.7R.1は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手しました。

1.手術前

1. すべての生存の手術のためのマウスは健康であることを確認してください。マウスは健康であることを確実にするために、皮膚のテンティングによって脱水の兆候を検査します。疾患又はdのいずれかの証拠でマウスを使用しないでくださいこれらの実験でistress。
2. 彼らは低体重ではないであることを確認するために、マウスを計量。重量は少なくとも16〜20グラムであることを確認してください。
3. マウスあたりの移植のための5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を準備します。
   1. BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞の70％コンフルエント細胞培養皿 - 10ミリリットルの60％から培地を吸引。 5ミリリットルPBSで2回洗浄します。皿にトリプシンの2 mlを加え、5分間空気および5％CO ₂の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
   2. その後、ピペット10μlを10倍の倍率で顕微鏡下で細胞計数のためのマニュアル血球計数器に細胞をトリプシン処理。 4大隅の正方形で見つかったセルの合計数をカウントし、細胞の総数によって希釈係数を掛けます。そして、カウント正方形の数で割ると、細胞濃度（1ml当たり細胞）のために10 ⁶を掛け。
   3. 計算を使用して、無菌マウスあたり5万個の細胞を収集1.5mlの微小管。 1.5mlの微小管にラベルを付けます。
4. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）100μl中5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を再懸濁します。手術で移植まで氷上でこれらの細胞を保管してください。
5. このような麻酔導入と髪が汚染を避けるために、滅菌装置・材料から離れクリッピングなどの手術のためのマウスの準備のために必要な活動を行います。
6. 毎分1リットル（約2.1％）の一定濃度の流量で酸素と一緒にイソフルラン気化器を使用して、イソフルランの吸入によってマウスに全身麻酔を誘導します。注：システムは、自立で、精密気化器、酸素供給及びガス/麻酔掃気のために必要な呼吸回路にリンクされているチャコールキャニスタを含んでいます。
7. 麻酔は、手術中に痛みを受けてから動物を防ぐために十分であることを確認してください。つま先のピンチを実行し、非responために動物を観察siveness麻酔を確認しました。
8. その時、ノーズコーンにバルブライン、シールボックスに、オープンを切り替えます。
9. すぐにマウスを麻酔されると、乾燥やダメージから予防措置として角膜に眼軟膏の少量を適用します。
10. その後、適切に（メンテナンス麻酔のために）配置され、接続されたノーズコーンと、準備領域に動物を移動します。この準備エリアで脱毛することにより手術のための外科的切開部位を準備します。
11. 手術の面積は、他のすべての活動の自由位置にあることを確認してください。
12. 作業面は、手術前に頑丈かつ適切に消毒、汚れていないとすっきりであることを確認してください。リネンまたはそれ以上の外科手術用トレイの滅菌ピースを置きます。
13. 術野が手術を行う者のみに利用可能であることを確認してください。外科的な部屋は、適切なdisinfeで洗浄し、適切なクリーナーで掃引し、噴霧されていることを確認ctant。
14. 空気の流れは、サイトの汚染につながる塵を広げることができるようにそれはまた、ドアや窓から離れて配置されていることを確認してください。
15. 滅菌器具で生存手術を行います。どちらのメーカーの推奨またはオートクレーブに応じて消毒剤で楽器を浸します。使用するための準備ができている基本的な無菌の消耗品を使用してください。
16. 無菌区域の汚染を防ぐために機能に応じて個別の楽器。
17. 動物の肝臓にアクセスするために切開部位の周囲に約1インチ（正中切開）を剃ります。手術部位から離れた動物から毛を削除します。
18. シェービング後、せっけん消毒剤（ベタジン外科的スクラブ）の領域をスクラブし、滅菌PBS溶液で余分な消毒剤を洗い流します。約5分を持続全体スクラブプロセスで、この数回を実行します。削除し、使用する手袋を廃棄しました。
19. その後、このようなsurgicなどの防護服に変更アルガウン、スクラブトップ、およびフェイスマスク。次に、手術用手袋の上に置く前に、適切なスクラブ液で手を消毒します。注意：これは脱落し、潜在的な汚染物質と手術部位の汚染を防止するために必要なステップです。

2.手術

1. 麻酔の全期間を通じて暖かさのための外部熱源を提供します。麻酔は、体温調節の乱れの原因となるため、動物は、いくつかの低体温症が発生する可能性があります。従って、体温を維持します。
2. 手術を通して、その背中の上にマウスを置きます。
3. サージカルテープの作品で手術テーブルにフォア手足、後肢およびマウスの尾を修正。
4. xyphisternumにすぐに劣る直線切開を行います。
5. 肝臓を露出させ、滅菌自己保持手術用開創器を使用してください。
6. シリンジはゆっくりと慎重に、20G針を有する5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1を含む100μlのPBSを注入肝臓の右葉にマウスHCC細胞。
7. 針を除去した後、原因肝臓の高い血管分布に任意の潜在的な出血を止めるために、少なくとも1分間滅菌綿棒を適用します。
8. 外科用クリップを用いて皮膚の閉鎖に続いて吸収性縫合糸で皮下組織を閉じます。その後、ベータダインスクラブで再び傷をきれいにします。注意：これは、手術創の閉鎖を保証します。
9. 皮下に生理食塩水を100μlを与えます。

3.手術後

1. すぐに手術後、マウス条件の世話人を通知するために、手術後のIDカードできれいにケージにマウスを転送します。食料と水を提供します。注：最初の24時間の期間後に手術のためのウェットフードと水を単独で収容された場合は、当社の経験では、ちょうど手術を受けたマウスは最高の運賃になります。
2. 38ºCを超えない熱を発生する熱ランプで動物を暖かく保ちます。 Uマウスが完全に回復するまで、温度を測定する温度計をSE。
3. ハウスの快適性を確保するために、紙の寝具と好ましくはケージ内の動物。
4. 最初の回復後、不快感、出血、痛みや苦痛の徴候のために動物を監視します。痛みを和らげるためにブプレノルフィン（0.05 -0.1ミリグラム/キログラム）を与えます。密接に約2時間の活動、行動、外観だけでなく、水や食料の消費量を監視します。歩行した場合、マウスを定期的に通常の住宅のためのバックエリアに動物を移動し、24時間後に手術のために6-12時間間隔で監視し続けます。必要に応じて重量チェックを実行します。
5. しかし、動物が療養問題を抱えている場合、適切な支持療法の行動を取ります。マウスは回復できない場合は、人道的に、CO _2窒息と頸椎脱臼を経由して、マウスを安楽死させます。安楽死のために承認された機関のガイドラインに従ってください。
6. 手術後、通常observabあるHCCの臨床的証拠をチェックしますルボディコンディションスコアの大幅な削減など。注：この時点では、原発腫瘍は、おそらく肝臓で開発しており、転移性預金は、おそらく肺に開発しました。
7. この時点で、人道的な安楽死によって実験に関与し（実験及びコントロール）すべてのマウスを生け贄に捧げます。二酸化炭素窒息にマウスを件名：非常にゆっくりと5〜10分かけてチャンバー内に二酸化炭素を放出します。これは、呼吸停止の原因となります。

結果

Balb / cマウスの肝臓は、5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を移植しました。 HCC開発の臨床的証拠は63日、手術後に観察しました。これにより、マウスを人道的に安楽死させました。剖検を安楽死させたマウスで行いました。肺と肝臓を切除し、慎重な肉眼的検査は肉眼で見える腫瘍を同定するために実施しました。 1マウスでは、表在性腫瘍は腹壁（ 図1A）にはいくつかのファイルが添付された肝臓の表面に観察されました。 2番目のマウスでは、異常に見える肝臓を観察しました。異常が非常に強く表在性腫瘍（ 図1B）のように見えます。予想されるようにコントロールマウスからの肝臓（ 図1D）、肺（ 図1E）によって証明されるように、BNL 1ME A.7R.1 HCC細胞の移植なしで対照群のマウスには、何の腫瘍を発症していません。また、腫瘍を有するマウスからの肺はやや異常に見えた、ディスプレイ出血性壊死のる領域（ 図1C）。以前の経験に基づいて...

ディスカッション

この記事では、この方法の詳細な説明は、（ 図2）ことが最近OgunwobiとHCC転移の同所性同系マウスモデルの確立に成功の同僚によって報告された与えられている^3。この手順のために、腫瘍の取り込み率は、一般的に高いです。我々は以前の^100％3の腫瘍取り込み率を観察しました。しかし、テイク率は研究者の能力に応じて可変とすることができます。トレーニングの下に新しい大学院生によって行われた最近の実験では、腫瘍取り込み率は40％と低かったです。ほとんどの実験は4で終了しているが - 3週間 - ボディコンディションスコアの低下に起因する6週間、私たちは、原発腫瘍が2によって確立することができる同一のマウスに同じ細胞の皮下移植の経験から考えています。私たちは通常、成功した実験から1つの腫瘍結節を見ることを期待します。我々は肺転移が4との間に発展することを期待が、そして - 6週間、それはcon​​ceivです肝臓内の腫瘍がかなり早い時期に起こり得ることができます。

良い外科技術と無菌状態は、この生存手術方法の成...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロ解剖ピンセット	Roboz	(RS-5040)	チップ0.20 x 0.12 mm
Graefeマイクロ解剖鉗子、鋸歯状湾曲先端	Roboz	(RS-5111)	1 X 2歯、湾曲先端幅0.6 mm
マイクロ解剖リトラクター-アグリコラ(3 x 3プロング)	Roboz	(RS-6501)	鈍い3 X 3プロング、深さ4 mm、スプレッド25 mm
マイクロディスセクションリトラクター-ゴールドスタイン(3 x 3プロング)	Roboz	(RS-6503)	鈍い、3 X 3プロング、深さ4 mm、スプレッド19 mm
Jameson Caliper(腫瘍を測定)	Roboz	(RS-6466)	80 mm / 3インチスケール、クロムメッキ
マイクロ解剖はさみ、大きなリングはさみ、まっすぐで鋭い	Roboz	(RS-5852)	23 mmブレード、長さ4インチ、フラットシャンクと大きなリングブレード
付きメス、繊細な解剖手順のための	Roboz	(RS-9861-36)
メスハンドル	Roboz	(RS-9884)	ソリッド
リタウアーステッチはさみ	Roboz	(RS-7074)	長さ4.5インチ茶色の
針ホルダー、簡単に縫合できる	Roboz	(RS-7960)	凸顎、細かい鋸歯状反射7MM
創傷クリップ反射7クリップアプラ	イヤーRoboz	(RS-9262)	安全で確実な創傷閉鎖の代替方法
器具トレイと蓋	Roboz	RT-1350S
ミニクリッパー ブレード着脱	Roboz	(RS-5903)
Germinator 500 (Germ Terminator) ドライ滅菌器	Roboz	DS-400, Ds-401, DS-501	マイクロ解剖器具の迅速な除染に。 機器は15秒以内に除染します。
マイクロインジェクション針	VWR	BD305125	25G ニードル

式