マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

サマリー

循環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍の転移において重要な役割を果たすことが示されています。ここでは、肝細胞癌(HCC)転移の同系マウス腫瘍モデルの全血からCTCを単離および増殖する方法について説明する。

要約

がんの転移は、がん関連死の主な原因です。最近の研究では、循環腫瘍細胞(CTC)ががんの転移に重要であることが示されています。実際、CTCの数は腫瘍の大きさと相関しています。ここでは、肝細胞がん(HCC)の同系マウスモデルからCTCを単離および増殖するための方法論について詳細に説明し、固形臓器腫瘍転移の潜在的に重要な分子メカニズムの下流分析を可能にします。この方法は効率的で再現性があります。これは非侵襲的な技術であるため、合併症に関連する可能性のあるヒトの組織の侵襲的な生検に取って代わる可能性があります。したがって、ここで説明する方法では、全血サンプルからのCTCの単離と増殖が可能になり、CTCを検査および特性評価できます。これは、診断や個別化標的療法などの臨床応用への将来の適応の可能性を秘めています。

概要

1869年にトーマス・アシュワースによって初めて観察されて以来、癌研究コミュニティは循環腫瘍細胞(CTC)の存在を知っ^{ていました。}それ以来、CTCは腫瘍の転移と疾患の進行に重要であることが示されています^2-5。今日、固形腫瘍は世界中の罹患率と死亡率の主な原因となっています。CTCは、原発腫瘍に由来し、血流を介してさまざまな臓器に移動するまれな細胞であり、そのうちのごく一部のみが最終的に転移に発展します^2-5。特に、腫瘍のサイズとCTC番号^3,4との間には正の相関があります。

CTCの生物学を理解することは、標的療法の探索に貢献することができます。さらに、CTCには診断アプリケーションがある場合があります。これらの潜在的な臨床応用を達成するためには、CTCの研究における現在のいくつかの課題を克服する必要があります。1つの課題は、CTCが単一細胞またはクラスターとして存在し、血液微小環境に応答して表現型を変化させることさえできるという事実に関連しています²。さらに、血液中の1ミリリットルあたり10億個の血液細胞のうちCTCの数が少ない(ミリリットルあたり数から数百)ため、検出は非常に困難になる可能性があります⁶。それにもかかわらず、近年、固形臓器癌からのCTCの潜在的な臨床応用に関する研究が激化しています。

>jove_content<これらの努力にもかかわらず、CTCの役割を研究し理解するという課題は、CTCの希少性と現在利用可能な技術ツールの不十分さのために続いています。これらの課題にもかかわらず、臨床応用の大きな可能性は、がん転移におけるCTCの役割に関する研究を追求する動機であり続けています。

私たちは最近、肝細胞癌(HCC)転移の同所性同系マウスモデルから細胞培養CTCを分離し、増殖することに成功し^{ました5。}現在の論文の目的は、成功した方法論のすべての側面を詳細に説明することです。この方法論の重要性は、ヒトCTCを培養中に成功裏に単離および増殖するためにこのアプローチを変更できるという事実にあり、したがって、CTC生物学のin vitro研究の可能性を高めることができます。

>jove_content個別化治療4に役立つ可能性があります。したがって、CTCの生物学の理解を深めることは、臨床的影響をもたらす可能性が高くなります。

プロトコル

倫理の声明：すべての動物実験は、ニューヨーク市立大学ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.前の実験手順

1. 動物施設に到着すると、最初にフィルタトップと木材チップの寝具をケージに3匹のBALB / cマウスを収容します。マウスは食品、ピュリナ齧歯類固形飼料および水を自由にアクセスできることを確認します。ケージは週に一度クリーニングする必要がありながら、寝具や食品を週に2回変更する必要があります。
2. 毎分1リットルの一定流量で酸素と一緒にイソフルラン気化器を使用して、マウスでの全身麻酔を誘導します。システムは、自立であり、精密な気化器が含まれています。
3. 精密気化器とそれに接続されたガス/麻酔システムを持っているプラ​​スチック製の箱の位置動物。動物は2に気化器を下げ、その時点で、意識不明になるまで、最初は2.5に気化器を設定します。
4. その時、スイッチバルブライン、ボックスにそれをシールし、ノーズコーンにそれを開きます。
5. ノーズコーン（メンテナンス麻酔のために）適切に配置し、接続して、準備領域に動物を移動します。
6. マウス当たりの移植のために5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を準備します。 BNL 1ME A.7R.1培地中で増殖されるべきである（10％熱不活化FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミン）空気及び5％の加湿インキュベーター中、37℃で細胞培養皿中でインキュベートCO _2。
7. シリンジ20 G針を有する、BALB / cマウスの肝臓の葉に5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌細胞を含むPBSを100μlのインプラントは、原発腫瘍を生成します。移植後、社内着床前と同じ家の要件にケージ内のBALB / cマウス。
8. 実験のエンドポイントで、肝細胞癌の臨床的証拠は、身体条件の有意な減少として観察されますスコア（通常は4週間後に検出されます）。この時点では、転移性の堆積物が肺に形成されているが、一次腫瘍は肝臓で開発している可能性があります。その後、循環腫瘍細胞の単離および増殖のプロセスを開始します。

腫瘍細胞の単離を循環させるための全血の2コレクション

注：適切に手術領域を消毒し、それが乱雑フリーであることを確認してください。すべての手術器具をオートクレーブするか、製造元の推奨に従って消毒剤に浸し

1. 実験のエンドポイントでの人道的な安楽死（腫瘍発生の臨床的証拠）によりマウスを生け贄に捧げます。マウスの安楽死は、CO _2窒息を関与させるべきです。麻酔が正しく配布されて確認するために、適切にマウスを守ってください。呼吸停止を起こし、10分 - 二酸化炭素は5かけてチャンバー内にゆっくりと放出されるべきです。心臓内放血とcervicによってフォローアル脱臼^。5
2. 全血の収集のための1mlシリンジに取り付けた25 G針を使用してください。 0.01ミリリットルヘパリンと注射器をHeparanize。約45°の角度でxyphisternumに劣る針とすぐにパンク肌。心を穿刺するために、ゆっくりと針を進め、その後、針の角度を下げます。着実な場所に針と注射器を保持し、500μlの引き出し - 心臓から全血を1000μLを。
3. 注射器と針を外し、前標識された1.5ミリリットルの発熱物質を含まないチューブに血液を移します。 5分間1167×gで1.5ミリリットルの発熱物質を含まないチューブに採取した全血を遠心分離します。
   注：遠心分離を3層に全血試料を分離：赤血球、軟膜の中間薄層、および上部血漿層からなる下部層またはヘマトクリット。
4. ピペットで慎重にプラズマを取り外し、フュルトのための独立した1.5​​ミリリットルの発熱物質を含まないチューブにそれを集めますそのような無細胞核酸の検出⁷としてER実験。
5. 循環腫瘍細胞（CTCの）を単離するために、赤血球（RBC）溶解の準備のために別々の1.5 mlの発熱物質を含まないチューブに軟膜を収集します。これは、バフィーコート層中の残留赤血球を除去する必要があります。

赤血球（RBC）溶解バッファー3.レシピ

1. RBC溶解緩衝液1 L溶液を作ります。
2. 塩化アンモニウムの500ミリリットルとトリスの500ミリリットルを行います。その後、塩化アンモニウムの155 mMのトリスと10mMの最終濃度でRBC溶解緩衝液の1リットルの溶液を作成するために混合します。
3. 7.5のpHに解決策をバッファ。 2 +8℃でのRBC溶解バッファを保存し、使用前に、すぐに室温にもたらします。

軟膜の4 RBC溶解

1. 収集したバフィーコートを含む滅菌した発熱物質を含まない1.5mlチューブにRBC溶解緩衝液1mlを追加します。
2. により、チューブの内容物を混合複数回転倒。ベンチに室温で5分間チューブの混合された内容物をインキュベートします。遠心1167×gで5分間混合した内容物。
3. 遠心分離後、白っぽいペレットが得られます。ペレットを中断することなく、ゆっくりと慎重に、10％の漂白剤に赤みを帯びた上清を捨てます。 3.5 - ペレットが白っぽくていない場合は、再doが3.1を繰り返します。 10にRBC溶解緩衝液中でインキュベーション時間を増やす - 15分することも有用であろう。
4. 10％の漂白剤での生物学的廃棄物の除染は、24時間後に完了すると、安全に生物学的廃棄物を処分します。

細胞培養物中の5伝播

注：腫瘍細胞は、通常、急速に細胞をシャーレに播種した細胞のオリジナルミックスに豊富に存在する白血球を拡大しています。媒体の繰り返し変更、CTCのその後の継代の後、全ての白血球が除去され、CTCの比較的純粋な集団が残ります。

1. 後10％の漂白剤に上清を廃棄し、少なくとも一回1 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に白っぽいペレットを洗浄し、細胞培養における増殖のための完全培地中で再懸濁します。
2. 洗浄が完了した後、ペレットに完全BNL 1ME A.7R.1培養培地1ml（FBS 10％熱不活性化、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミン）を添加し、培養液中にペレットを再懸濁します。
3. 細胞培養皿への細胞の再懸濁ミックスをシード。空気および5％CO ₂の加湿インキュベーター中で37℃で細胞培養皿をインキュベートします。
4. 2〜3日ごとに細胞培養培地を変更します。 5~7日後のCTCは、細胞培養皿に付着し、増殖し始めています。これらの細胞は25継代を超えて生存したままで繰り返し凍結融解サイクル⁵の後になります。

肝細胞癌の6検証は、腫瘍細胞株を循環します

1. APを実行しますolymerase連鎖反応（PCR）の新規確立CTCの細胞株は、元の移植BNL 1ME A.7R.1 HCC線のようなマウス細胞であることを確認するために、マウスβグロビン遺伝子の1つの特定のDNAセグメントを増幅するためのベースの方法。方法は、もともとSteube らによって記載され、検証された^。5,8
2. 特異的な抗体を用いて、タンパク質3のような3（CREB3L3）に結合する肝細胞特異的なマーカーcAMP応答要素の免疫染色を行います。これは、確立されたCTCは、肝細胞移植元のBNL 1ME A.7R.1細胞株のような実際にあるその小説を確認します^。5

結果

ここで説明する方法は、CTCを単離することができることを示しています。マウスは、人道的に、実験終了時点で安楽死させました。プロセスは、二酸化炭素窒息、心臓内瀉血、および頸椎脱臼を含みました。手順の重要なステップの概略図を図2に示した。心臓内放血により採取した全血試料は、上記のプロトコルを用いて処理しました。その後、遠心分離は、RBCの溶解に供したバフィーコート層を決定しました。次いで、これをPBS中で洗浄し、白っぽいペレットを収集するために、別の遠心分離工程が続き、細胞培養における増殖のための完全な細胞培養培地中に再懸濁しました。出てくることがあり問題が得られたペレットの色は明らかではないかもしれないということです。その追加の時間を実行することにより、おそらく15分、または - この問題は簡単に10に増加させることにより、RBC溶解緩衝液中でのインキュベーション時間を変更することによって解決することができます。三つの異なるマウス由来の培養物中で増殖されたCTCの代表的な画像は、BNL 1MEのA.7R.1細胞と比較して、 図1に示されて...

ディスカッション

この研究では、HCCの同系マウスの全血からCTCを単離して増殖させる方法が説明されました。この研究の目的は、がん転移のメカニズムに関する進行中の研究を強化することです。

多くのがんの予後不良に寄与する要因は、タイムリーな検出の欠如と、その結果としての悪性腫瘍の広範な蔓延です³。CTC は原発がんに由来し、血流を介して遠隔臓器に広がります。そのため、CTCはがん転移において重要であり、診断3^、9、10などの複数の臨床応用の可能性を秘めています。これは、CTC が膵臓、前立腺、乳房などのさまざまな種類のがんの疾患の進行と強い相関関係があることを示したいくつかの臨床研究のデータによって裏付けられています^3,11,12。 CTCはがんの診断に非常に役立つ可能性があるという事実にもかかわらず、CTCは数十億の血球の中にほとんど存在しないため、CTCの単離と特徴付けは困難です^3,7。

私たちの技術を使用して CTC を単離することの重要性は、臨床現場...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヘパリンナトリウム塩 1 g	VWR	89508-852
BTX チューブ マイクロ 1.5 ml クリア NS	VWR	89511-254	1.5 ml  パイロジェンフリー エッペンドルフ チューブ
ニードル 滅菌 ディスプ BD 25 G x 1 インチ	VWR	BD305125	25 G ニードル Slp
チップ SRNG 1 ml 200 パックあたり各	VWR	BD309659	1 ml シリンジ チップ
リンジ 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 mlシリンジ
VWR鉗子ティッシュ6	VWR	82027-446	鉗子
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
クライオットcompund 4オン	VWR	25608-930	Octコンパウンド
VWRスライドsprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703
VWRカバーガラス#2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	カバーガラス
VWRスライドボックス真北FMPU	VWR	89140-278	スライドボックス
スーパーHT PAPペン	VWR	89427-058	PAPペン
水RNASeおよびDNAseフリー2 L	VWR	101454-204	ヌクレアーゼフリーウォーター
バッファートリス超純粋グレード500 g	VWR	97061-796	スバッファー
塩化アンモニウムACSグレード2、5 Kg	VWR	97062-048	アンモニウム緩衝液
ファルコン組織培養皿60 x 15 mmスタイルポリスチレン	VWR	353002	組織培養皿
クロロックス殺菌漂白剤、通常の	VWR	89501-620	クロロックス漂白剤
PBS、1x(リン酸緩衝生理食塩水)、カルシウム&マグネシウム(500 ml)なしサー	モフィッシャーサイエンティフィック	21-040-CV	PBS、1x
DMEM、1倍 4.5 g / Lグルコース&ピルビン酸ナトリウムを含まないL-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10-017-CV	DMEM BNL 1ME A.7R.1細胞用1x培地
シ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35-010-CV	FBS
ペニシリン ストレプトマイシン溶液、100x	サーモフィッシャーサイエンティフィ	30-002-CL	ペニシリン ストレプトマイシン
ソーバル バイオフュージ ピコ	サーモフィッシャー サイエンティフィ	75002411	13,000 rpm 遠心分離機

シススライドトリ塩化 ウック ック