原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Summary

私たちは、原子間力顕微鏡と力分光法を使用して、支持脂質二重膜の調製とその特性評価のためのプロトコルを記述します。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、生体膜の可視化を可能にする多用途で高解像度のイメージング技術です。膜の下部構造や個々の分子を調べるのに十分な倍率を備えています。AFMは、膜の相互作用と機械的特性を測定するための力プローブとして機能します。担持脂質二重膜は、従来、AFM研究の膜モデルとして使用されています。このプロトコルでは、AFMを使用して、支持された二重膜を調製し、その構造と機械的特性を特徴付ける方法を示します。これらには、二重層の厚さとブレークスルーフォースが含まれます。

AFMイメージングと力分光法によって提供される情報は、膜の機械的および化学的特性を定義するのに役立ちます。これらの特性は、環境ストレスからの細胞止血の維持、膜タンパク質の結合、タンパク質複合体の安定化などの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。

Introduction

原子間力顕微鏡（AFM）は、非常に鋭い先端を有するカンチレバー¹を用いて、試料の領域を横切って走査することにより、表面の画像を生成します。カンチレバーの動きは、試料の表面形状をプローブ。液体^2-5に空気やネイティブに近い状態で固定したサンプルを分析することで、その汎用性のために、タンパク質、DNA、および膜を含む- AFMは、広く生体分子に適用されています。

別にナノメートルの範囲内の高解像度の撮像能力から、AFMカンチレバーは、相互作用力（粘着力と反発力）と、試料^5,6の機械的特性を調べるために、ばねとして作用します。これは、力分光法として知られています。このモードでは、プローブは、最初のサンプルに近づき、それに力を及ぼし、それはサンプル（ 図1A）との接触を失うまで、後退します。生成された曲線は、アプリの両方のためのカンチレバーの距離の関数としての力を見せますゴキブリと後退。弾性率を含むいくつかの特性は、材料の硬さを測定し、そして接着力を導出することができます。

サポートされている脂質二重層は、固体支持体の上に横たわっている生体モデル膜である-通常マイカ、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス、またはシリコン^7を酸化しました。これらは、小胞の沈着、ラングミュア-ブロジェット法及びスピンコーティング^8,9のような様々な技術を用いて調製されます。 AFMイメージングは、これらのサポートされている二重層¹⁰の形成は、次のとおりと異なる組成物^11〜15の膜によって形成された異なる構造を探査するために使用されています。

アプローチ曲線のピークに支持された二分子層​​の結果に力分光法を行います。このピークは、二重層を貫通するのに必要な力を示しており、画期的な力と呼ばれています。二重層の厚さはまた、力曲線^6を用いて測定することができます。二重層の代表的な画期的な力NN ⁶ 1-50の範囲。これらの特性は、脂質充填（液体またはゲル相）と構造（アシル鎖長及び不飽和度）に依存し、膜活性剤¹⁶によって変更します。破裂の背後にある理論は^、17を説明したが、そのようなカンチレバー柔らかさ、先端半径と接近速度などの他の実験パラメータも画期的な力^15,16,18に影響^を与えます。力分光法は、膜²¹の安定性に、異なる脂質相^11,19、ペプチドのような組成的変化^12,20、ならびに他の生体分子の効果の特性を分析するために使用されてきました。

サポートされている二重層のオリエンテーションフラットは、より良い構造および膜の性質を特徴づけるために、表面プラズモン共鳴、蛍光顕微鏡²²と^11,19等の他の方法でAFMを組み合わせるために有利で ​​す。

この詳細なビデオプロトCOLは、小胞の沈着を使用してサポート脂質二重層を調製し、AFMおよび力分光法を用いてそれらを分析することを意図しています。様々なサイズの小胞は、二重層を調製するために使用することができるが、このプロトコルは、小規模および大単層ベシクルに焦点を当てています。相が液体注文（L _0）と液体無秩序（L _d）が相に分離支持された二分子層は^11,15を特徴づけました。 2：1の比率で膜を2にジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、スフィンゴミエリン（SM）、およびコレステロール（Cholで）から構成されています。この組成物モデルタンパク質輸送および選別、細胞シグナリングおよびその他の細胞プロセス^23,24のための重要なプラットフォームとして動作するように提案されている脂質ラフト、。

Protocol

サポートされている脂質二重層の調製^{（SLB）11,12,21}

1. 脂質混合物および多層ベシクル懸濁液の調製
   1. 事前に以下の緩衝液を準備します。
      1. 2.7ミリモルのKClの濃度でPBS緩衝液を調製し、1.5mMのKH ₂ PO _4、8ミリモルのNa ₂ HPO _4、及び137mMの塩化ナトリウム、pHは7.2。
      2. 150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHが7.4の濃度で、SLB（サポートされている脂質二重層）バッファを準備します。
      3. 1 MのCaCl ₂の溶液を調製します。
   2. 所望の濃度でクロロホルム中、次の脂質を溶解：例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）25 mg / mlの、スフィンゴミエリン（SM）で25 mg / mlのコレステロールで（チョル）に10mg / mlで。
   3. 2：1 DOPC：SM：Cholをモル比2の総脂質1mgので溶液を作るためDOPCの18.38μL、SMとのChol 11.30μlに17.10μLを取ります。 conceに基づいて、それに応じてボリュームを変化させます1.1.2で調製した脂質のntrations。 2：1 DOPC：SM：Cholを、膜²⁵の位相特性を変化さモル比の変更などが、2のモル比を維持しています。
   4. ボルテックスで完全に溶液を混合。一つは、蛍光顕微鏡によって二重層を可視化することを望む場合、0.05モル％の蛍光脂質色素を加えます。
      注：長鎖dialkylcarbocyaninesのファミリーを行ったように、DIOとのDiIは波長の広い範囲に及ぶ、理想的には脂質膜を標識するために使用することができます。あるいは、ローダミンホスファチジルエタノールアミンまたはBODIPYコレステロールのような蛍光標識脂質を使用することができます。いずれの場合も、色素の濃度は、脂質に結合した蛍光体の高濃度は、脂質の挙動^19を変更できることを念頭に置いて、顕微鏡の設定に応じて最適化する必要があります。
   5. N ₂ガ ​​ス（または例えばArやHeなどの使用可能な任意の不活性ガス）を使用して、クロロホルムをオフに乾燥させます。
   6. さらにドライT彼は、少なくとも1時間真空下で混合物を脂質を含みます。
      注：この脂質混合物を保存する場合は、不活性ガスで（N _2、ArやHeを）空気をパージし、-20℃で保存します。小さな茶色のバイアル中に過剰の脂質·イン·クロロホルムを等分。 -20℃で不活性ガスを（N _2、ArやHe）の、店舗の空気を置換する、脂質混合物と同様にして乾燥させます。
   7. 10 mg / mlの濃度にPBS緩衝液中で乾燥した脂質を溶解します。
   8. ボルテックス1分に約20秒間激しく混合物は、多層小胞を含む、濁った懸濁液を取得します。バイアルの側面に付着しない脂質膜がないことを確認します。
   9. 10μlのアリコート（脂質1mgの10アリコートを作る）にこの懸濁液を配布します。
   10. さらに使用するまで-20℃で保管してください。
2. 単層小胞の調製
   注：単層小胞のサイズは、様々な超音波処理法、押出法を用いて調製することができます。超音波処理は、Sを使用していますoundエネルギー混合物を攪拌し、多層懸濁液の層を分離します。これは濁った懸濁液の片付けで示されています。押出しは明確な孔径のメンブレンフィルターを通過する多重膜小胞を強制します。
   1. 超音波処理法
      1. 多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。
      2. （2ミリリットル）小さなキャップされたガラスバイアルに混合物を移し、パラフィルムで密封します。
      3. 10分間、またはそれは小さな単層小胞（直径50 nm以下のSUV車を）得て透明になるまで浴ソニケーター中で室温で混合物を超音波処理。
   2. 押出法
      1. 多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。
      2. 極低温チューブに懸濁液を移します。
      3. 液体窒素中で数秒間低温管を浸漬することによって脂質懸濁液をフリーズします。
      4. 解凍数分間室温または37℃の水浴中で極低温管を浸すことにより、脂質懸濁液。凍結融解工程を少なくとも10回繰り返します。
      5. 脂質懸濁液を押し出すために、200 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を使用して、商業的押出装置^26（他の孔のサイズは、100ナノメートルまたは400ナノメートルのような利用可能です）。
         注：現在、2押出機の装置は市販さがあります：マニュアル押出機は、少量（数mlに200μl）を利用可能です。この場合、サンプルは、手動で2つのシリンジ間で前後にサスペンションを押して、膜を通って押し出されます。製造業者によっては、脂質のアリコートをセットアップの最小体積に到達するために結合される必要があります。大きなボリュームの場合（最大50 ml）を、より洗練されたデバイスが使用される懸濁液は、圧縮ガスを用いてポリカーボネート膜を通して押し出されます。セットアップおよび押出条件は、MODに応じて変更することができますエル。使用前にメーカーの説明書を参照してください。このプロトコルは、小容量の手動押出機を指します。
      6. 押出機に水を通過させることにより、水中の押出機を平衡化。水に膜を浸します。
      7. 2ピストン間の膜を配置し、装置を組み立て、一方のシリンジから他に、押出機を介してバッファを通過させることにより、バッファに平衡化。このステップは、さらに、システムの漏れやすさをテストすることができます。それが漏れた場合は、メンブレンを変えるそれを再度分解して組み立て直します。
      8. 押出機（ '汚い'側）のいずれかの注射器を使用して、脂質懸濁液を取ります。
      9. 1室と対向室に空の注射器の脂質懸濁液を含む注射器を取り付けます。
      10. 一方の端部に注射器を押してください。膜を介して対向シリンジにソリューションを渡します。これは、1 ^回目のパスです。
      11. このような31回の合計のための膜を通って、それを渡します解決策は、対向するシリンジ（「クリーンサイド」）で終わること。
          注：押出成形した後、膜を確認してください。それが壊れていた場合には、押出プロセスは成功しなかったと繰り返される必要があります。
      12. 小さなチューブに注射器を空にします。大型単層小胞（LUVを）は4℃に維持した場合に1〜2日間安定です。
3. マイカとカバーガラスの作製
   1. 洗浄は、最初に水で、次いでエタノール中でカバースリップ。空気乾燥。
   2. マイカディスクを取り、粘着テープを使用して、外側の層を剥がします。
   3. カバーガラス上にマイカディスクを取り付けます。一つは蛍光顕微鏡で二重層を確認できるように透明な光学接着剤が最適です。
   4. 光学接着剤/グリースを使用したプラスチック製のシリンダーインチ（2.5cm、外径、2センチメートル内径、及び0.5センチ高さ）を取り付けます。すべてが封入されていることと、漏れがないことを確認します。それらは容易に目から取り外すことができるように、シリンダを再利用したいときにグリースを使用Eのカバーガラスと洗浄。プラスチックシリンダーの寸法は、AFMのカンチレバーホルダーの大きさに依存し、それに応じて調整されるべきです。
4. 固体支持体上の単層小胞の沈着
   1. ピペットでマイカ上に直接全体リポソーム溶液。 300μLの体積に到達するために、よりSLBバッファを追加します。
   2. 3ミリモルのCa ²⁺の最終濃度に達するように1 M塩化カルシウム溶液の0.9μLを加えます。
   3. 少なくとも10分間、2分間37℃でインキュベートし、次いで65℃で。常に緩衝液で二重層をカバーしています。空気と気泡との接触は、それを破壊します。必要に応じてインキュベーションの間に、より高い温度でインキュベートする場合は特に、より多くのバッファを追加します。
      注：インキュベーション温度は、必要な脂質混合物との相に応じて変化します。少なくとも10分間のインキュベーション時間が支持された二分子層​​を形成するために必要とされるが、それは、温度及び組成に応じて、長くなる可能性があります。
   4. ウォッシュカルシウムと融合していない小胞を除去するためのホット（65°C）SLBバッファーで二重層15-20回。バッファの下に二重層を維持するために、洗浄工程の間に特別な注意を取り、そっと二重層を壊さないように洗浄溶液をピペット。
   5. AFM測定前に室温に支持された二分子層​​を冷却します。これは、膜の異なる相を形成するだけでなく、機器の熱ドリフトを最小化するために必要とされます。

2.原子間力顕微鏡の測定^11,12

1. イメージング
   注意：接触モードまたはタッピングモードで原子間力顕微鏡イメージングを実行します。溶液中の画像支持された二分子層​​;これが二重層を破壊するように溶液が完全に蒸発することはできません。一つは、バッファで作業されるように、任意のAFM部が液体流出から保護されていることを確認することで安全上の注意事項を守ってください。
   1. 柔らかいカンチレバーを選択します（N 0.2以下/ m個のばね定数をお勧めします）とtにマウント彼AFM。カンチレバー剛性の選択は、力分光法のためのより重要である（これについては後述します）。
   2. AFMステージにサンプルをマウントし、すべての振動分離モジュールがオンになっていることを確認してください。平衡化し、システムの熱ドリフトを低減するために、少なくとも15分間待ちます。 AFMのセットアップに応じて、チューニングおよびイメージング仕様が異なる場合があります。メーカーのハンドブックを参照してください。
   3. 接触するまで、AFMチップを試料にアプローチ。
   4. 脂質二重層は、通常、高さが4 nmであるため、最高のz解像度（例えば1.5μm）を与える器具のZ範囲を使用しています。
   5. 画像の領域を選択します。脂質二重層の概要を取得するには、50ミクロン×50ミクロンまたは25ミクロン×25​​ミクロンの領域は、画像への良い出発点になります。小さい特徴が表示された場合は、小さな領域内の1つの缶の画像（10ミクロン×10ミクロン、または2ミクロン×2ミクロン）。撮像領域の選択は、作業rに依存します圧電スキャナのアンジュ。このため、機器のマニュアルを参照してください。
   6. 二重層は非常に壊れやすいように、試料との接触を維持しながら、熱ドリフトを最小限にし、正しい力を維持するために撮像中にAFMチップのセットポイントを調整します。接触モードでは、設定値を最小にします。タッピングモードでは、設定値を最大化します。
   7. 多項式レベリング機能への各走査線に当てはめることにより、プロセスイメージ。 AFM製造会社の独自のソフトウェアを使用して膜との接触を失うスキャンの行の削除を実行します。
2. フォーススペクトロスコピー
   1. 製造業者のプロトコルに従って指示に従って、カンチレバーを校正。キャリブレーションは、フォトダイオードの電気信号の変換は（ 図1B）を強制することができます。
      1. ボルトのZピエゾ（長さの単位）の移動の代わりに電気信号としてたわみを測定するために、先端の感度を調整します。
         注：AFMは、カンチレバーの背面で反射されたレーザを用いて、カンチレバーのたわみの変化を検出します。レーザは、空間的にレーザスポットの位置を検出することができるフォトダイオードに達します。それは、サンプルとの接触時に曲がるようにカンチレバーのたわみの変化は、「垂直偏向」としてこのフォトダイオードによって検出され、これは電圧の単位です。カンチレバーは、Zピエゾによって移動されるので、垂直偏向をzピエゾの動きに関連しています。垂直偏向およびZ移動の間の比率は、感度と呼ばれ、距離に電圧を変換します。
      2. 通常、AFMソフトウェアに組み込まれた熱雑音周波数法を用いてカンチレバーのバネ定数を計算します。この方法では、パワースペクトル密度のプロットを作成する、発振周波数に対するノイズの振動の振幅をプロットします。このプロットは、共振周波数付近のピークが表示されます。周波数、振幅I最大の共振周波数であるです。自動的にソフトウェアによってバネ定数を計算するために、ピークの周りにローレンツ関数を取り付けます。熱雑音の方法論のためにいくつかの有用なリソースを参照^27-30に示されています。
   2. 二層の領域を画像化した後、力分光法を実行するために二層に5ミクロン×5ミクロン領域を選択します。
   3. それは、その領域の16×16のグリッドに力曲線となるように、AFMを設定します。これは、地域ごとに256の力曲線になります。隣接する二つの点の間の空間は、1ポイントプローブさの膜面積は次のポイントと一致することを回避するのに十分であるべきです。これは、先端半径に依存しています。 2点間の100 nmの距離が理想的であろう。 16×16のグリッドに5ミクロン×5ミクロンの領域に分割します。相の大きさに応じて、1つは、より小さなまたは大きな領域を選択し、それに応じてグリッドサイズを調整することができます。
   4. に設定し、Zピエゾ変位400 nmの。これは、zピエゾの最大移動範囲を決定します。それは、カンチレバーが完全に測定値間にサンプルから離れて後退していることを確認してくださいするのに十分な大きさでなければなりません。
   5. 800 nmの/秒にアプローチ速度を設定し、200 nmの/秒の速度を撤回。二層組成物及び^6,16を検討する脂質相に応じて400〜6,000 nmの/秒の間の接近速度を使用します。
   6. すべてのパラメータを設定した後、AFMソフトウェアの「実行」ボタンを押すことによって、力曲線を取得します。
   7. 高さ曲線（Zピエゾの動きの測定値）対力として力曲線を保存します。これは、アカウントにするとき、試料と接触しているカンチレバーの曲がりを取ることはありません。データ処理ステップの間、AFMソフトウェアは、二層の厚さのために適切な値を与えるチップと試料の分離曲線（ 図1C）、対力を得るために曲げカンチレバーの補正を可能にします。補正値は、通常calibrに組み込まれています各力曲線と一緒に保存されているエーション、。ある時点で、ピエゾ動きから垂直偏向を減算することにより、先端と試料との分離を計算します。
      注：アプローチ力​​曲線のピークは（カンチレバーの動きがアプローチサイクルに残っている場合でも、力の値がダウンする）膜の画期的な力である、このピークの位置と点の位置との差ながら、力が再び上昇し始めるところ、膜の厚さを提供します。
   8. 良好な統計情報を取得する条件ごとに、少なくとも500の力曲線を取得します。起源か、MATLABなどのプログラムを使用して値のヒストグラムをプロットし、分布のピークと幅を取得するためにガウス分布にヒストグラムをフィット。

Results

DOPCからなるサポートされている脂質二重層：SM：チョル（2：2：1）AFMで画像化した（ 図2 AC）。ための脂質組成物、SM / CholをリッチL _oおよび DOPCリッチL d _の相が観察されました。 AFM画像から高さプロファイルは、膜構造に関する重要な情報を提供することができます。高さプロファイルを見ることによって、二層の厚さを提供することができる膜（ 図2B）、またはL _O / Lが_D相の高さの差の欠陥の存在下で測定することができます。また、AFMは、具体的には、これらのフェーズを表す領域を選択し、力分光法（ - F図2 D）を使用して、その機械的性質を分析することができます。力分光法モード由来力曲線力曲線（ 図2DおよびE）のピーク力値を見つけることによって画期的な力を測定するために使用され、そしてmembr力曲線が再び（ 図2D...

Discussion

DOPCから成るのSLB：SM：Cholを（2：2：1）塩化カルシウムにより誘導される小胞の吸着および破裂後雲母上に形成されました。この脂質組成物は、L _dとLの_O相に分離しました。 Lの_O相は、スフィンゴミエリンとコレステロールに富むとL _D相 ¹¹未満の流体/より粘性（ 図1A）です。 Lの_D相からL _Oの分離は、周囲（ 図1B、C）の上に上昇として円形の構造を明示する。プラットフォームは_、L、D相に囲まれたL個の_Oの相です。膜の欠陥（または膜内の穴）にも見られている（ 図1B、青い矢印）、この欠陥全体の高さプロファイルは、二層の厚さを示しています。 Lの_D / Lの_Oの高さの差はまた、AFMの高さプロファイル（ 図1C）を調べることによって調べることができま...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	は、密封されたバイアルに凍結乾燥粉末として入っています。開封時にすべての粉末をクロロホルムに溶解します。乾燥脂質フィルムとして、不活性雰囲気下で-20°Cで余分に保管してください。°C. 訪問 ここ 保管と取り扱いの詳細については、こちらをご覧ください。
スフィンゴミエリン(脳、ブタ)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	は、大型の密封プラスチック容器に凍結乾燥粉末として入っています。開封時に粉末粉末のスパチュラポイントをクロロホルムに溶かします。乾燥脂質フィルムとして、不活性雰囲気下で-20°Cで余分に保管してください。°C. 訪問 ここ 保管と取り扱いの詳細については、こちらをご覧ください。
コレステロール	アバンティポーラーリピッド株式会社	700000P	は、大型の密閉プラスチック容器に凍結乾燥粉末として入っています。開封時に粉末粉末のスパチュラポイントをクロロホルムに溶かします。乾燥脂質フィルムとして、不活性雰囲気下で-20°Cで余分に保管してください。°C. 訪問 ここ 保管と取り扱いの詳細については、こちらをご覧ください。
塩化ナトリウム(NaCl)、99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
カリウム(KCl)、88%	Sigma	P9541
水素ナトリウム(Na2HPO4)、>99%	AppliChem GmbH	A1046
二水素カリウム(KH2PO4)、 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
カルシウム二水和物(CaCl2)、分子生物学グレード	AppliChem GmbH	A4689
HEPES、分子生物学グレード	AppliChem GmbH	A3724
ガラスカバースリップ、24 x 60 ん、1 mmの厚さ	デュラングループ	2355036
パンチとダイセット	精密ブランド製品、株式会社	40105
光学接着剤	ノーランドプロダクツ株式会社	NOA 88	長波長紫外線で硬化すると硬化する液体接着剤です。
[header]
マイカ	NSC Mica Exports Ltd.		これらは、面積が少なくとも1平方インチで、厚さが0.006インチから0.016インチの範囲の雲母片です。それらは出荷のために会社によって特定のサイズにカットされます。小さなマイカディスクは、パンチとダイセットを使用してマイカブロックから打ち抜くことができます。 マイカは常に手袋またはピンセットで取り扱ってください。
実験装置 グリース	ボーラー Chemie AG	Glisseal N
リポソーム押出機	Avestin	LiposoFast-Basic	別の方法として、Northern Lipids, Inc.からのオファーも見ることができます。
粘着テープ	3M	スコッチ(R) マジック (TM) テープ 810 (1インチ)
バスソニケーター	バンデリン ソノレックス Digitec	DT-31	加熱なし、周波数: 35 kHz、超音波ピーク出力: 160 W、HF 電力: 40 W. (データシート)
窒化ケイ素 AFM カンチレバー	ブルカーAFMプローブ	DNP-10	各カンチレバーには4つの先端があり、その公称先端半径は20nmです(最大は60°C;nm)です。仕様に基づき、共振周波数18kHz、公称ばね定数0.06N/mのチップDを使用しています。
AFM	JPK	JPK Nanowizard IIをZeiss Axiovert 200