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方法論記事

直接マウストラウマ/異所性骨化のモデルバーン

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DOI:

10.3791/52880

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2015年8月6日

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1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry

この記事について

サマリー

アキレス腱切開術と火傷傷の異所性骨化モデルは、外因性因子の適用なしに、外傷誘発性異所性骨形成の信頼性の高い研究を可能にします。

要約

異所性骨化(HO)は、大きな外傷、火傷、整形外科手術の後に形成される骨格の外側の骨の形成です。 HOの研究に使用される動物モデルの大部分は、骨形態形成タンパク質(BMP)、外因性細胞構築物、またはBMPシグナル伝達における遺伝子変異などの外因性物質の適用に依存しています。 これらのモデルは有用ですが、HOの症例の大部分を引き起こす炎症状態を正確に再現するわけではありません。 ここでは、マウスの熱傷/腱切開モデルについて述べます。このモデルは、焦点を絞ったHOを確実に生成します。 このプロトコルでは、背側の皮膚に全身表面積の 30% の部分的な厚さの接触火傷を作成し、アキレス腱をその中間点で分割します。 予測可能な場所でHOを誘発するために外傷性損傷のみに依存することで、内因性の生理学的プロセスと環境のみからの軟骨内異所性骨形成の経時的な研究が可能になります。 この方法は、外傷誘発性HOに関与する炎症経路と骨形成経路を理解するのに役立つ可能性があります。 さらに、このモデルではHOが予測可能な場所と時間経過で発生するため、HO形成を防ぐための早期イメージング戦略と治療法を改善する研究が可能になります。

概要

異所性骨化(HO)は、骨優位な細胞が骨格の外側に軟骨内骨を形成するように異常に誘導される異所性骨の形成です。 HO形成経路の詳細はまだほとんどわかっていませんが、受け入れられているパラダイムには、炎症誘発事件、許容性ニッチ、および骨を形成することができる間葉系幹細胞の3つの主要な要因が含まれます。1-3 HO は、主要な火傷の 60% 以上、戦闘関連の損傷の 65%、および侵襲的な整形外科手術の症例の 10% を複雑にする一般的な併存疾患です。4,5 ただし、HOは局所的な損傷部位や、他の方法では損傷していない可能性のある遠隔地で発生する可能性があるため、HOがどこで形成されるかを予測することはしばしば困難です。 この場所のばらつきにより、局所的に標的とした反応性骨形成を防ぐための予防的介入が困難になります。 進行性骨化性線維異形成症(FOP)などの先天性HOもあり、患者は軽度の外傷や炎症性侮辱に反応して堅牢なHOを発症する傾向があります。 トランスジェニックマウスを用いた強力な動物モデルは、この表現型を再現し、外傷誘発性HO.6-9においても重要である可能性のある分子経路への洞察を提供しました。6-9 非先天性HOの病因に関するトランスレーショナル研究は、損傷のみから外因性骨誘導材料および/または細胞の移植に至るまで、さまざまな構築物を使用してきました。10-13

私たちの以前の研究では、外因性の物質の投与を必要としないマウスのHO形成のシンプルで信頼性の高いモデルを検証しました。14-17 このモデルは、HOを開始するための2つの重要な条件、すなわち局所的な外傷と全体的な炎症を作り出した。 これは、アキレス腱切開術(局所外傷)と遠隔火傷(全身炎症)を組み合わせて使用することで達成されました。 マウスは両方の治療を同時に受け、組織学的、放射線学的、および分子的手段で分析できる強力な量のHOを発症することがわかりました。 興味深いことに、同時の熱傷は、形成され、その発達の時間経過を加速するHOの量を大幅に増加させました。14-16 HOは、腱切開術を受けた肢の踵骨、足首関節、および脛骨/腓骨の周りの予測可能な部位で発生しました。 既知の場所でのHO発生の信頼性により、異所性骨化の初期段階で分子的および組織学的特徴を集中的に調べることができました。14,17 現在までに、腱切開術と同時火傷を負ったマウス(50匹以上)の100%がHOを発症しています。 さらに、HOの成長パターンと生化学的構成を調べるために、縦方向の2Dおよび3Dイメージングと分光分析が行われました15,16。

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プロトコル

倫理文：実験動物研究所から第八版（ILAR、2011）とした：全ての動物手順は、実験動物の使用およびケアのためのガイドで提供されるガイドラインで定義されているように、良好な動物の練習に厳密に従って実施しましたミシガン大学（PRO0001553）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.マウスの外科的処置

注：使用8-10週齢のC57BL / 6マウス。他の年齢、背景、およびマウスの系統は、異なる条件または遺伝的構成をテストするために使用することができます。手続きの腱切除部分については、フェイスマスク、ヘアボンネット、および滅菌ガウン、手袋、および器具を使用して無菌状態を維持します。手術部位は無菌ポビドンヨード及び滅菌ドレープで準備する必要があります。獣医の加熱パッドを使用し、前administraに37℃に蘇生ソリューションを加温することにより低体温を避けまする。

  1. 2.5％吸入イソフルランを用いてマウスを麻酔。簡単にアクセス背と後肢を残すためにノーズコーンを使用してください。粘膜の適切な呼吸数や着色を維持し、筋緊張、つま先のピンチ、および角膜反射をチェックすることにより、麻酔を確実にするために、イソフルランの投与速度を調整します。手順中にドライアイの怪我を防止するために、マウスの目に当たり障りのない眼軟膏を適用します。手術野の下の獣医の加熱パッドや温水循環装置を使用して、適切な体温を維持。
  2. 鎮痛のための手術の皮下直前に、ブプレノルフィン、0.1ミリグラム/ kgで投与します。
  3. 密接膝にかかとからバリカンを使用して、左後足に手術部位を剃ります。
  4. 密接に背骨の上に始まり、背側正中線の左に剃毛領域を拡張する、火傷に対応するために、地域に少なくとも2cm×3cmをクリアし、マウスの背部を剃ります。
  5. 3交流ポビドンヨードスクラブを使用して、膝に後足を含め、手術部位を準備します。
  6. 左アキレス腱の内側面に沿って縦切開を行います。アキレス腱を容易に可視化することができるように、切開部を拡張します。約0.5センチメートル。
  7. シャープ組織ハサミで中点で腱の鋭い解剖とアキレス腱切除術を行います。腱の下に組織面での組織のはさみの刃を挿入し、ブレードが腱中間点になるまで平面に沿って詳細に分析。急激腱を切断するはさみの刃を閉じます。
    注：腓腹筋、ヒラメ筋、および足底腱を含むすべての事後腱を含めることを確認してください。
  8. 滅菌ガーゼで圧力をかけて止血を達成（最小限の出血があるはずです）と5-0ビクリルステッチで皮膚切開を閉じます。
  9. おおよそのmeasuremenで35グラムの重さのアルミニウムブロックと背部分層熱傷を行いますTS 2センチメートル×2センチ×3センチメートル17秒間マウスの剃毛背部に適用される水浴中で60℃に加熱しました。
    注：ブロックの表面領域全体がマウスに接触している、しかし、ブロックに追加の圧力をかけることを避けることを確認して、麻酔したマウスの上にブロックを休んすることにより、適切な火傷の深さを実現、 すなわち、重力があることを可能にします所定の位置にブロックを保持する唯一の力。ブロックの一方の側に取り付けられた薄いプラスチック製のハンドルは、操作、安定化、および湯浴からの検索に便利です。これは、8〜10週齢のC57BL / 6マウスでは約30％、全体表面積の熱傷を作成します。この接触燃焼が原因で傷の上に火傷の深さの均一性と動物の間の再現に他の方法（火炎や熱傷熱傷）が選択されています。
  10. ガーゼで熱傷部位を乾燥さテガダームドレッシングを適用します。
  11. 温め蘇生液を投与：乳酸リンゲル液1ミリリットルを腹腔内注射0.5mlの皮下注射。蘇生のこの1回投与は、火傷や腱切除からの回復のために十分です。
    注：マウスを完全に回復するまでの監視の下できれいなケージに個別に、他のマウスと住宅ケージに家を麻酔したマウスを返さないでください。典型的な回復は、1-6時間以内に発生します。熱傷部位は、一般的に2〜4週間以内に治癒するときれいな住宅環境で守ればめったに創傷感染によって複雑にされていません。
  12. ブプレノルフィンを0.1mg / kgの皮下注射を手順、次の3日間ごとに12時間を管理します。適切な間隔でシリアルμCTスキャンとHOの成長を監視します。異所性骨の成長は、μCTによって術後3週間の周りに最初は明らかです。
    注：HO開発の大部分は術後9週までに完了しています。私たちは繰り返しμCTとHOボリュームまたは場所の違いは、シングルエンドポイントは15週でスキャンμCTに比べて15週間にわたって隔週をスキャン確認されていません。実験の終了時に、施設のガイドラインに従ってCO 2吸入で全てのマウスを安楽死させると、10分後に頚椎脱臼で死亡を確認。

2.μCT取得および分析

  1. 腹臥位でスキャナベッドに麻酔をかけたマウスを固定します。呼吸モーションアーチファクトを防ぐために、しっかりと床に後肢をテープで固定します。イメージキャリブレーションのためのマウスの下にファントムを含む空気、水、およびヒドロキシアパタイトを含みます。
  2. 骨解析ソフトウェアを開き、遠位後肢の先端に近位に股関節から後肢の両方を含む関心領域（ROI）を定義します。以下のパラメータを使用して、画像取得します。80 kVで、500μAと1300ミリ秒露光、48ミクロンのボクセルサイズを14,15
  3. 3ファントム室の各々にROIを描画するとの適切なフィールドに平均濃度を入力することにより、ハンスフィールド単位（HU）に画像のキャリブレーションソフトウェア。
  4. 左後肢の脛骨が同所皮質骨構造の描写とHOのための明確な解剖学的ビューを可能にするために、Z軸に沿って平行になるように、ソフトウェアで「グラバー」ツールを使用して、再配向画像。
  5. HOが発生するまで、膝で始まり、画像スライスを通って遠位方向にスクロールします。マニュアルスプラインツールを使用して、足を介して、またはHOが突破されるまで、遠位に継続ごとに5 回目のスライス上に異所性骨の周りにROIを行います。すべてのHOを含むものROIにまとめたROIを拡張し、ステッチする外挿ツールを使用します。
  6. 3D ROIを作成し、分析メニューを選択します。最高の骨窓を示す下側および上側の閾値を設定することにより骨量を計算します。すべてのスキャンに同じ固定しきい値を使用してください。

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結果

この本研究では、プロトコルは、外傷/火傷誘発されるHOの以前に公開されたマウスモデルに記載されている。14-17これはアキレス腱切除術と部分層熱傷を持つグローバル炎症侮辱と同時に、ローカライズ筋骨格傷害の作成 ​​が含まれます。これは、シリアル·イメージングで追跡することができる腱切除部位での反応性骨を確実に形成されます。現在までに、アキレス腱切除術の両方を持続し、熱傷したすべてのマウス（50以上）が腱切除部位でHOの測定可能な量を開発しました。異所性骨の形成を定量化するために、キャリブレーション画像μCTプロトコルは、所望の各時点で使用されています。アキレス腱切除術と組み合わせて、火傷の添加は重要なHOの誘導に​​おいて重要であることが証明されました。両方の怪我が同時に起こっての交流に比べ腱切除部位に形成された異所性骨の量の有意な増加がありますhillesの腱切除単独（ 図1）。17

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ディスカッション

異所性骨化は、外傷、火傷、侵襲的な筋骨格系処置を受ける患者が直面する主要な機能障害を表します。 最も危険にさらされているのは、即席爆発装置(IED)などのメカニズムによる大きな爆風による負傷を負った現代の紛争の兵士です。18 改良された防弾チョッキと前方に配置された医療ユニットにより、四肢の重大な損傷の生存率が向上します。 四肢損傷の初期安定化と修復後、これらの患者は HO を発症するリスクが高くなります.18 その有病率と医学的負担にもかかわらず、HO 発症の詳細については比較的ほとんど知られていません。 具体的には、関与する正確な受容体とシグナル伝達経路、および HO に関与する細胞系統に関する質問は、現在の重要な調査ラインです。 FOPおよび他の形態の先天性HOとの類似性が予想され、最近の報告によって裏付けられています。8,14,17 トラウマに反応して内因的に生成された HO の信頼できるモデルは、この取り組みにおける重要なツールです。

特に興味深いのは、予防的治療が実行可能な初期段階で HO が形成...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません

謝辞

μCTのイメージングと分析を支援してくださったAmanda Fair氏、CMI、そしてKathy Sweet氏とUMのORLに感謝します。 資金提供:BLは1K08GM109105-01およびPlastic Surgery Foundation全米寄付賞によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6マウスジャクソン研究所6648-10週齢
イソフルラン –FlurisoVET one、ボイジー、IDV1 501017
Buprenorphine –BuprenexReckitt Benckiser HealthcareNDC 12496-0757-10.3 mg/ml 溶液
BetadineOwens and Minor, Mechanicsville, VA2047PVP202
5-0 Vicryl suturesEthicon, Summerville, NJJ493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm3M1624W半分に切って火傷部位を適切にカバーします
µCT - GE eXplore Locus SPGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis ApplicationGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada

参考文献

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