方法論記事

生物学的液体培地中でスケーラブルな、メタリック高アスペクト比のナノコンポジットの生成

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DOI：

10.3791/52901

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2015年7月8日

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1Biophysics Department, Centenary College of Louisiana, 2Department of Chemistry, Louisiana Tech University, 3Department of Integrative Physiology, University of North Texas Health Sciences Center, 4Biomedical Engineering, Louisiana Tech University, 5Institute for Micromanufacturing, Louisiana Tech University

この記事について

サマリー

ここでは、生物学的条件下で液体培地中で小説、高アスペクト比のバイオ複合材料を合成するためのプロトコルを提示します。バイオ複合材料は、それぞれ、直径および長さにマイクロメートルのナノメートルスケール。シスチンと組み合わせた銅ナノ粒子（CNPS）および硫酸銅は、合成のための重要なコンポーネントです。

要約

このプロトコルの目的は、高アスペクト比の構造を有する2つの新規なバイオ複合材料の合成を記載することです。バイオ複合は、銅ナノ粒子（CNPS）または金属成分に寄与する硫酸銅のいずれかで、銅およびシスチンで構成されています。合成は、生物学的条件（37℃）で液体で行い、自己組織化複合体は、24時間後に形成されます。一旦形成されると、これらの複合材料は、両方の液体培地中で、乾燥した形で非常に安定しています。複合材料の長さは、数ミクロンから、直径25 nmの範囲をマイクロするナノスケールから。エネルギー分散型X線分光法（EDX）を用いて電界放出走査電子顕微鏡は、それが、最終的なナノ複合材料中の硫黄の供給源としてシスチンを確認し、出発CNP材料から不在であった硫黄は、NP由来の線状構造中に存在することを実証しました。これらの線状ナノ·マイクロ複合材料の合成、STRの長さの多様な範囲の間ucturesは、合成容器内で形成されています。合成後の液体混合物の超音波処理は、超音波処理時間の増加とともに平均の長さを減少させることにより、構造物の平均の大きさを制御するのを助けることが示されました。形成された構造は、非常に安定であり、凝集しない、液相中で形成されているので、遠心分離はまた、形成された複合物を濃縮し、分離を補助するために使用することができます。

概要

銅は、生物界では一部の酵素機能1,2に必須である高反応金属ですが、高濃度ではナノ粒子の形態3,4を含む強力な毒性があります。CNPやその他の銅ベースのナノ材料が利用されるにつれて、ナノ構造の表面積/質量が増加するため、銅の毒性に対する懸念がより重要になっています。したがって、ナノ粒子の形態の銅の小さな塊でさえ、細胞に浸透して反応性形態に分解される能力により、局所的な毒性を引き起こす可能性があります。一部の生物種は、金属イオンと複合体を形成してキレート化することができ、海洋産貝5に記載されているように、金属イオンを生物学的構造に組み込むことさえできます。ナノ材料4の潜在的な毒性影響を研究する中で、時間の経過とともに、典型的な細胞培養に使用される生物学的条件(37°Cおよび5%CO2)の下で、高アスペクト比(線形)構造を有する安定した銅バイオコンポジットを形成できることが発見された。

除去のプロセスにより、完全な細胞培養培地で行われたこれらの線状バイオコンポジットの最初の発見は、バイオコンポジットが自己組織化するために必要な必須要素の定義されたプロトコルに簡略化されました。2種類の高度に線形のバイオコンポジットの自己組織化は、2つの出発金属成分、1)CNPと2)硫酸銅で可能であることが発見されました。ナノスケールおよびマイクロスケールの特徴を持つ、いわゆる「ウニ」および「ナノフラワー」タイプの銅含有構造は以前に報告されていますが、これらは100°C以上の6〜8の温度などの非生物学的条件下で生成されました。私たちの知る限り、生物学的条件下で液相にスケーラブルな個々の線状銅含有ナノ構造の合成は、これまで説明されていませんでした。

ナノ複合材料の合成に利用される出発物質の一つ、すなわちCNPは、以前に細胞に対して非常に毒性が高いことが報告されています4。ナノ複合材料が形成された後、これらの構造は、開始NPs9よりも質量当たりの毒性が低いことが最近報告されている。したがって、ここで述べる合成は、NP型をより大きな構造に変換するという意味で、また細胞に対して毒性の低い複合材料を製造するという意味で、反応性銅種の安定化に有用性を有する生物学的および生化学的反応に由来する可能性がある。

生物学的液体媒体10,11との相互作用により凝集または凝集することが知られている他の多くのナノ材料形態とは対照的に、ここで述べられている高度に直線的な複合材料は、おそらく以前に報告された電荷の再分配9のために、凝集を避けます。現在の研究で詳述されているように、この凝集の回避は、少なくとも3つの理由で一度形成された構造で作業する目的で便利です:1)一度形成された複合構造は、遠心分離を使用して濃縮し、その後、ボルテックス混合を使用して再度容易に分散させることができます。2)形成された構造は、異なる期間の超音波処理によって平均サイズを縮小することができる。3)形成された線形構造は、最近記載された「コーヒーリング効果」12を回避するための追加のツールを提供し、したがって、材料、特に球状の微粒子を含むもののより均一に分布したコーティングを作成するためのドーパントを提供する可能性がある。

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プロトコル

実験1.計画

  1. 合成に必要な銅ナノ複合材料の量を決定します。その上、少量フラスコ（25 cm 2）で、または材料の調製において以下に示すように、より大きなフラスコの数を選択します。
  2. この合成には、5％のCO 2と少なくとも40％の湿度で37℃のインキュベーターを使用。このような培養器が利用可能であり、それは繰り返し合成（約24時間）の期間にわたって妨害されないことをことを確認してください。
    注意：インキュベーターの繰り返し開閉は確かにナノコンポジット構造の変化した合成をもたらし得る温度変動の原因となります。

材料の作製

  1. 合成が開始する直前に溶媒に固体材料を添加することにより、実験開始前に、新鮮なすべての材料を準備します。長時間Bの液体中にシスチンと銅の出発物質の原液を維持EFORE実験が推奨されていませんし、変数の結果につながる可能性があります。一度ベンダーから開く、パラフィルムで容器の上部をラップすることによって、乾燥出発材料保ちます。
    注：以下のプロトコルは、シスチンの7μlの滅菌水の6643μL、およびCNPSの350μLを使用して25cm 2の細胞培養フラスコ内の反応のための例として使用されています。
  2. CNPSの少なくとも2ミリグラムを秤量することにより銅ナノ粒子の2 mg / mlの溶液を調製します。皮膚とのCNPSの可能性の接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用してください。空の滅菌16ミリリットルのガラスバイアル中のナノ粒子を配置します。
    1. CNPSを含むバイアルに、2 mg / mlの溶液を作製し、合成を開始する前に、ナノ粒子の分散を提供するために、20秒間、溶液をボルテックスするために、適切な音量に滅菌脱イオン水を加える（少なくとも1ミリリットルの合計容量を推奨します）。これはボルテックスで混合阻害するとして水をバイアルの半分以上の方法を記入しないでください。 CNPSウィルlはすぐにバイアルの底に沈殿し、（黒に灰色）色が暗い表示されます。
    2. 合成の開始前にCNPSの最大分散を提供するために、室温で17分間、CNP液を超音波処理。定期的にCNPSは、超音波処理のために混合されていることを確認してください。成功した超音波処理後、CNPSを、少なくとも30分間、溶液中に懸濁したままで、溶液の色は暗くなります。
  3. 合成のための72.9 mg / mlの溶液を作製するためにシスチンの十分な質量を秤量します。シスチンは水に直接溶解しないので、帯電防止計量容器に秤量シスチンを配置します。
    1. シスチンが完全に溶解するようにシスチンを含む計量容器に、滅菌、1MのNaOHの十分なボリュームを追加。たとえば、72.9 mg / mlの溶液を作製するために、1 M NaOHを100μlの完全シスチンの7.29ミリグラムを溶解します。
    2. 無菌状態を維持するために、無菌のフロー組織培養フード中でこのステップを実行します。
      注意：水酸化ナトリウム1でM濃度は苛性であるため、皮膚と濃NaOHとの接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用します
  4. 滅菌組織培養フードでの作業は、まず滅菌合成フラスコに滅菌水の6643μlのシスチンの7μlを添加し、フラスコのキャップで37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートさせる効果的な提供するために、（ルーズ）通気混合。 CNPSは超音波処理工程の後に定住していますので、30秒間ボルテックスすることによって2 mg / mlのCNP液を再懸濁します。
    1. 合成を開始するために、25cm 2の細胞培養フラスコに滅菌水、50部CNPS、及び949の部品を1部品シスチンを組み合わせる次の成分比を維持するために（滅菌技術を使用して）の合成フラスコに十分なCNPの溶液を加えます。例えば、7ミリリットル合成ボリュームの、シスチン原液の7μL、CNPS350μlの、滅菌水の6643μLを兼ね備えています。それはSECURであるように、フラスコのキャップを取り付けて締めE。
    2. 合成のためのすべてのコンポーネントを組み合わせた後、静かに4〜5回旋回することによりフラスコ中で混合します。 CO 2インキュベーター中でフラスコを置き、および合成の間、フラスコのうちのガス交換が存在することになるように、キャップを緩めて、フラスコをベント。
  5. 合成は約24時間インキュベーター内で実行することができます。合成の間、一つは、顕微鏡で眼によって、高度に線形複合体の形成を観察することができます。
    注意：構造の形成のプロセスは、構造の検出が最初に困難であるという意味で突然発生する可能性があり、その外観は、高密度化に迅速に移行します。形成は、したがって、24時間前に発生することがあります。構造が大きくなると、その密度が増大したらプロセスは、目で観察することができます。構造体の生成は、後の時点で、顕微鏡下で目視により経時的に観察することができるが、連続的に合成条件を中断し、温度が低下につながります合成結果。
  6. しっかり合成フラスコをキャップし、冷蔵庫（4℃）で容器を保存することによって、バイオ複合材料の合成を終了します。一度生成構造は、少なくとも1年間はこの形で安定した状態を保ちます。利用コンポーネントを含む合成条件、合成の日付、および終了前に合成のインキュベーション時間でフラスコにラベルを付けます。

硫酸銅を使用した3合成

  1. 硫酸銅塩とCNPSを置換することによって自己組織化合成を行います。無菌技術を使用して、2 mg / mlの溶液を作製するために滅菌脱イオン水の十分な量で硫酸銅の少なくとも2ミリグラムを溶かします。硫酸銅の結晶が容易にこの濃度で溶液中に行くが、必要に応じて、バイアルをボルテックスし、全ての結晶が溶解されることを保証するために目で点検します。
  2. 前述のように硫酸銅を調製した後、合成を行うが、硫酸銅とCNPSを置き換えます。
    注：出発物質として硫酸銅を用いて自己組織化ナノコンポジットはCNPSから合成した構造に比べて、最終的な形状が、はるかに一貫性のあることが見出されました。
  3. CNPコンポジット（ステップ2.6）の場合と同様に硫酸銅のバイオ複合材料の合成を終了し、4℃でそれらを長期的に保存します。

4.特性とバイオ複合合成後の取り扱いについて

  1. CNPSから白色光顕微鏡9による硫酸銅からおよび電子顕微鏡9によって誘導されたバイオ複合材料を特徴づけます。
    1. 複合体は、フラスコが平坦敷設の数分以内に、フラスコの底面に沈降するように特性評価およびバイオ複合白色光顕微鏡による合成後の検査のために、倒立顕微鏡を使用し、次にフォーカスさせることができます。バイオ複合材料と液体媒体との間のコントラストを最大にするために顕微鏡で明視野設定を使用します。 CNPSと警官から派生複合硫酸ごとに両方の色が不透明に明確に表示されますが、未反応のCNPの凝集体は、色が非常に暗い表示されます。
      1. 複合材料の画像をキャプチャするために、顕微鏡に接続されたデジタルカメラを使用してください。個々の構造のための長さの範囲が観察されるであろう。
    2. 特性評価およびバイオ複合材料、合成後の検査のために、4℃で保存した後、フラスコを顕微鏡イメージングを行いながらフォーカス効果的な不明瞭ます冷蔵庫から取り出し、ときに最初に結露を形成するようにフラスコを少なくとも15分間、室温に来ることができます。 RTに平衡化させた後、顕微鏡の結像品質を最大にするために清潔なペーパータオルでフラスコの頂部および底部表面を拭きます。
    3. 長期的に格納されている複合材料またはイメージング作業する場合、冷蔵庫にある間に形成複合材料の塊を解離するために30秒間、フラスコをボルテックス。ボルテックスした後、反転マイクを有する構造を検査roscope凝集体が解離していることを確認し、必要に応じてボルテックスを繰り返します。
    4. CNPSを使用して、指定された実験のために、合成の有効性を評価するために、反転白色光顕微鏡を使用してください。例えば、合成時のような異なるパラメータを有するフラスコからのCNP由来のバイオ複合材料に使用される合成フラスコ中の未反応CNPSの有無を記録します。
      注：個々のCNPSを光学顕微鏡で観察するには小さすぎるが、未反応のCNPは、高アスペクト比、線形形式になります。合成に成功CNPコンポジットとは対照的に、ラウンド形状と​​暗いオブジェクトとして表示されます集約し、異なる長さの範囲を持っています。これは一旦形成された個々の構造に分散することが困難である高度に分岐した「ウニ」型構造、になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行うことは避けてください。
    5. 有効性を評価するために反転し、白色光顕微鏡を使用して硫酸銅を使用して、指定された実験の合成。硫酸銅は、このプロトコルを使用して溶液中に完全に移行しているため、溶液はCNPSを使用して、合成のソリューションよりも少ない暗い表示されます。そのような終了の前に、合成時と異なる合成条件でフラスコを比較することにより、硫酸銅複合体の大きさと範囲を文書。
      注：正常に合成された複合材料は、異なる長さの範囲が表示されます。これは複合材料の高度に分岐した集合体になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行う避け、「ウニ状」構造でなり、そのうちのいくつかと、一旦形成された個々の構造の中に分散させることは困難です。
  2. バイオ複合材料を遠心管中の複合体の合成後、遠心分離ソリューションを集中させます。 15mlの遠心管にCNP由来の構造や硫酸銅由来の構造のいずれかの6ミリリットルを追加します。 10分間遠心室温で500×gでペレットを形成します。小さいボリュームの場合、0.6ミリリットルサイズのチューブに溶液中の構造物の500μlを添加します。少なくとも10分間、室温で2000×gで遠心分離し、ペレットを形成します。
    1. 十分な時間のために（microfugesのために少なくとも10分間）遠心分離した後、構造は慎重にペレット上記上澄み液を除去することにより濃縮して、チューブの底に観察可能なペレットを保存します。硫酸銅から派生バイオ構造は、（黒にグレー）暗いCNPSから派生した色および構造で青色に見えます。
    2. この管に、より複合材料を追加し、必要に応じて、構造物を濃縮するために、同じチューブ内で処理を繰り返します。濃縮されたペレットを分散させるために、10〜30秒のための所望のチューブに溶液の容量、および渦を追加します。
  3. 超音波処理の構造はかつて​​より低い値に構造体の平均集団サイズ（長さ）を移動し、形成されました。ルでのための滅菌脱イオン水や超音波処理中の場所の構造AST 10分。このプロセスを使用して、時間をかけて、構造は（テキストの図6を参照）断片化し、平均長さが小さくなります。反転白色光顕微鏡とデジタルカメラを使用して、さまざまな超音波処理時間を有する複合サイズのドキュメントの変更。

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結果

図1は、この研究に記載の線状バイオ複合材料を形成するために、合成工程のフローチャート図を示しています。出発物質としてCNPSまたは硫酸銅を2 mg / mlの溶液を形成するために滅菌水と組み合わせて、この溶液を混合し、さらに混合物を提供するために超音波処理し、この銅溶液を合成するための以下の割合で混合される：949重量部、滅菌水：50部銅混合物：1部シスチン原液。実際のボリュームは、スケールアップまたは最終合成収率を縮小するために、これらの比率に応じて増減することができます。経時的外観の溶液の変化として、通常の白色光顕微鏡下で、または眼で観察することができる示した、線状バイオ構造が形成されるように、少なくとも2時間のインキュベーション後。

図2は、完全な細胞培養培地Oでこれら線状構造の最初の発見からの代表的な結果を示しています82時間の期間をVER。私たちの研究室では、細胞と癌細胞の正常のCNPSなど、さまざまなナノ材料の潜在的な毒性の評価を行った後、 図2に示した細胞は、AT...

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ディスカッション

CNPSを含むナノ材料の潜在的な毒性効果を評価するが、それは長期的に、CNPSが大きく、凝集形態に最初により分散微粒子分布（ 図2）から変換されたことが観察されました。いくつかの場合において、生物学的条件下で、細胞培養皿に製造されたこれらの高度に凝集形成は、「ウニ」を含む前述の銅を連想させる中央集合から非常に線状突起が形成された6。これは、ここに示す条件で、CNPSの濃度は、このように、培養中の細胞の全てを殺すことはないが、準最大であった細胞に加えることが指摘されるべきである（ 図2参照 ）。これらの初期の観察から、実験はその後、合成Oのために必要な残りの主要コンポーネントを見つけるために、連続して（最終的に細胞自体を含む）細胞培養条件の複数の構成要素を排除することにより継続しましたFリニア銅バイオ複合材料。

我々は、シスチン、元の細胞培養物の補っ成分、正しい生物学的条件下CNPSと組み合わせた場合、EDX分析によって示されるように、金属および生化学成分の両方を含有していた直線性の高いバイオ...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、ルイジアナ工科大学のマイクロマニュファクチャリング研究所での電子顕微鏡研究におけるアルフレッド・グナセカランの技術支援と、追加の顕微鏡研究におけるジム・マクナマラ博士の技術支援に感謝したいと思います。記載されている作業は、ルイジアナ州理事会のPKSFI契約番号によって部分的にサポートされました。LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 およびルイジアナ工科大学のジェームズE.ワイチIII寄付教授職(医学博士へ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミニボルテクサーVWR(https://us.vwr.com)58816-121
CO2 インキュベーター モデル # 2425-2VWR (https://us.vwr.com)ベンダーに問い合わせ現在のモデルcalalog # 98000-360
エッペンドルフ遠心分離機 (冷蔵マイクロ遠心分離機)Labnet (http://labnetinternational.com/)C2500-Rモデル プリズムR
細胞培養遠心分離機 モデル Z323KLabnet (http://labnetinternational.com/)ベンダーに問い合わせる現行モデル Z206A カタログ # C0206-A
ソニケーター (超音波洗浄機)ブランソン超音波 (http://www.bransonic.com/)1510R-MTH
天秤ザルトリウス (http://dataweigh.com)Model CP225D 類似モデル CPA225D
オリンパス IX51 倒立光学顕微鏡オリンパス (http://olympusamerica.comベンダー
Olympus DP71 顕微鏡デジタルカメラOlympus (http://olympusamerica.comベンダーへのお問い合わせ先
外部電源ユニット - オリンパス顕微鏡用白色光Olympus (http://olympusamerica.comTH4-100
10X、20X、40X 顕微鏡対物レンズOlympus (http://olympusamerica.comベンダー
走査型電子顕微鏡日立 (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)model S-4800
透過型電子顕微鏡ツァイス (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)model Libra 120
テーブルトップワークステーション 一方向フロー クリーンベンチEnvirco (http://envirco-hvac.com)model PNG62675無菌細胞培養に使用技術
る へのお問い合わせへのお問い合わせ

参考文献

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