非対称遊歩道：非対称歩行研究のための新しい行動アッセイ

サマリー

ここでは、げっ歯類の正確なステッピングを定量化するためのプロトコルを提示します。皮質および脊椎中枢パターンジェネレータ信号は、閉塞した移動中に正確な足の配置に必要です。ここでは、正確なステップ行動を直接調べる新しい制約付き歩行タスクについて報告します。

要約

行動アッセイは、一般的に中枢神経系（CNS）における感覚運動障害の評価のために使用されます。げっ歯類で運動障害を定量化するための最も洗練された方法は、制約のない歩行地上の微小擾乱を測定することである（ 例えば 、手動のBBBスコアまたは自動キャットウォーク）。しかし、皮質の入力は脊髄中枢パターン発生器（CPG）によって生成される基本的な運動の生成に必要とされません。このように、制約のない歩行タスクは間接的にしかによる運動皮質の障害に運動障害をテストします。本研究では、小説、脊髄CPGに皮質の入力を評価し、正確な足の配置運動タスクを提案します。計装ペグ方が左右で非対称に運動障害を模倣対称および非対称運動タスクを課すために使用されました。私たちは、県と歩行時の前肢スタンス位相特性の20％農産物の変更の等距離間ストライドの長さからずれることを示しています歩幅を誤りました。さらに、我々は非対称の歩道は、皮質の制御信号によって生成された行動の結果の測定を可能にすることを提案します。これらの措置は、皮質損傷後の機能障害の評価に関連しています。

概要

生き残った個体群における脳卒中後の罹患率は、両方のヒトでの定量的評価のための課題を提起する神経学的障害¹のストロークと動物モデルを投稿粗大運動機能障害が含まれます。臨床の現場では、これらの運動障害は、大多数の患者が示す厳しいのではなく、中程度の障害に対してより敏感である主観的な基準を用いて測定されます。同様に、動物における損傷後の運動行動のような主観的評価は共通であり、 例えば 、バッソ、ビーティー、とブレスナハン（BBB）運動スケール法^2,3。これらの主観的な評価方法は、四足動物モデルおよびヒトにおける歩行リハビリテーション研究間の変換を支援しているが、個別の筋肉群の活性に関連する運動障害の詳細は、評価されていません。また、脳血管障害における運動障害の推定犯人として運動に運動皮質の貢献の評価、彼らはオープンフィールドまたはリニア歩行タスクに依存しているとしてだけで、間接的にも、最も新しい自動化された定量的方法^{4,5を使用して得ることができます} 。これらのタスクは、皮質の貢献を必要とせず、脊髄の神経機構、 すなわち 、神経損傷のほとんどの動物モデルで倹約された中枢パターン発生器（CPG）ネットワーク、 例えば 、spinalized動物⁶によって行うことができる^{- 。。8} 。これらの脊髄のメカニズムに不可欠な皮質の貢献は、実験的に予想される姿勢調整⁹および^{10に到達する}だけでなく、正確なステッピング^{10が必要なタスク}に関与しています。

さらに、ほとんどの神経損傷は非対称です。例えば、ストロークは、片麻痺の原因となる、すなわち 、非対称歩行¹¹につながる体の片側の弱さ^{- 。14。}片麻痺歩行の非対称性は非対称spatiotemporによって生成されます最も重要な伸筋関連立脚相の短縮と麻痺側^15,16のステップサイクルの屈筋関連遊脚相の延長で明らかにアル筋肉の活性化。この傾向は、まだ健康や麻痺の動物における運動速度の範囲で検討されていません。現在の研究では、各工程におけるサイクル持続時間の関数としてのスイングやスタンス相の持続時間との関係を説明した位相期間特性¹⁷の分析を採用しました。得られた線形回帰モデルは、その後、さらに、すべての四肢を横切る非対称性の分析を説明しました。

私たちは、正確なステッピング運動タスクに基づいて、四足動物の運動系に皮質入力を降順の活性を評価するための新規な低コストの方法を報告しています。このタスクは、歩行速度の自然な範囲での足の配置の要求を課すことによって運動野に挑戦するように設計されています。加えて、足配置の要件を優先的運動系の左側または右側に挑戦するために操作されています。同様の運動タスクでは、メッツ＆ウィショー（2009）は、ラットにおいて、不規則なラング歩道上で逃したステップ数を故障率を調べました。私たちの方法は、これまでの研究と相補的であり、それは「成功」に位相制御の品質を詳細に^18を繰り返します。

プロトコル

次のトレーニングパラダイムは、平均的な成人のスプラーグドーリーラットの位相調整の分析を採用しています。本明細書に記載されたプロトコルは、あなたの機関の動物のケアのガイドラインに従っていることを確認してください。本研究におけるすべての手順は、医学のウェストバージニア大学での実験動物福祉（OLAW）のための制度的動物実験委員会（IACUC）およびOfficeに基づいて行われた実験の使用のための国立衛生研究所のガイドラインを遵守していました動物。

1.機器のセットアップ

1. アルミニウムとブレースオープントップのプラスチックの箱は155センチメートルX 104センチメートル（ 図1）を測定し 、各コーナーにサポートとして、非対称歩道を構築します。同じ側​​に連続する各ペグは歩幅を定義するように、ボックスの周囲に沿って、別のペグの配置を可能にするために、両側の溝付きアルミバー付きのボックスの上部エッジを引き締めます。
2. それぞれの側に表さ条件を分離し、各コーナーに20センチメートル×20センチプラットフォーム（合計4）を配置します。この距離は、1匹のラットのステップサイクルによって横断距離を含めるために十分であるべきです。
   1. 20センチメートルX 1センチメートル×0.5センチ寸法のアルミ製のペグを使用してください。ベンドそれぞれの上部には、足配置プラットフォームを生成するために先端から2.5センチメートルペグ。
   2. レベルの水平配置を確実にするために、同じ距離で機械加工穴を通ってスライドする内側ブラケットを使用して、溝付きのバーにペグを固定します。ドライバーと定規を使って位置を調整します。平均ラットの足の大きさにほぼ対応1cmのペグ幅を使用します。シンナーや幅広ペグのいずれか不快であるか、足配置の変動を増加させます。
3. 3正確なステッピングチャレンジのいずれかの条件を生成するためにそれぞれの側にペグの配置を操作します。
   1. 左の私を設定することで、15cmのストライド長（SL15）対称運動タスクを生成しますNTER-歩幅（ リットル ISL）と歩幅（7.5センチ）の半分に右間のストライド長（r個の ISL）。
   2. 6.0センチメートルにリットルの ISLおよびR ISLの長さを変更することにより、追加の対称条件（SL12）を課しています。
   3. 左右にペグの間の距離を変化させることにより、非対称なタスクを生成する、インター歩幅と呼ばれます。非対称モータシステムに挑戦するには、左側（L6R9条件）または右（L9R6）側のいずれか短い間ストライド長を課すことを20％Lの ISL と r の ISLを変更します。 1.5センチメートル摂動を6cm の L ISLおよび9 L6R9条件のCM、または9センチの L ISLおよびL9R6条件で6センチの R ISL の R ISLを課します
4. ラットでは、好ましい15センチメートルでSL12を除くすべての条件に歩幅を保ちます。
5. 便宜上、歩道の長辺を左またはrのどちらかに有利な非対称の条件を割り当てます対象のIGHT側、対称制御条件のための2つの短辺を確保しています。
6. ようにセットアップは、少なくとも60ヘルツのサンプリングレートでの高精細カメラペグの手足の配置は、カメラは約7手順をカバーする視野と歩道に垂直に指しで遮られていません。プラットフォームに近接した最初と最後のステップは無視されます。

装置2.トレーニング

1. 例えば 、標準的なトレーニングリソースを使用してください。基本BiomethodologyでNIHのトレーニング実験用ラットのために、げっ歯類の一般的な行動訓練を理解します。
2. トレーニングの初めに、少なくとも5分間、20×20センチのプラットフォーム上に配置し、報いることにより、被験者を順応させます。その後、食品の報酬を提示することによって、次のプラットフォームに1センチメートル間歩幅でペグ配置全体の動物を導きます。口頭およびプラットフォームに到達するためのふれあいを動物に報います。
3. AFTER 5のトレーニングを実行すると、スペースの余分な1ペグ - 2センチメートル離れて、次の5トレーニングランを行います。 （ - 35ステップ20）、本明細書に記載された繰り返し数は、統計学的に適切なサンプルサイズを生成するのに十分です。
   1. 動物がよりゆっくりと足踏み（無停止）と姿勢（バックアーチ）の一貫性によって判断されるようにタスクを取得した場合、（長いストライドでトレーニングを再開する前に、短いストライド長（S12）で、これらのスキルの強化に関する訓練を集中最終的に希望の歩幅に近づいS15）。
   2. 新しい間隔はタスクに不安や不快感を誘発する場合、以前の設定にペグを再調整し、訓練パラダイムを繰り返します。
   3. 適切なインターストライドの長さが4つの条件と運動基準が満たされているために達成されるまで、このトレーニングを続行します。我々の経験では、ラットは、トライアルを開始するための手がかりとして、ボーカル励ましによく反応します。トレーニングが提供されるテストは、同じ日に行うことができます被験者は、タスクを実行するために動機づけられています。
      注：次のように運動の基準は以下の通りです。ウォーキングは一貫しており、停止または失策を必要としません。ヘッドボビングは最小です。バックはアーチ型で、尾が運動中に発生します。各肢は明らかに発症時の歩道の直交ビューから見えると立脚期のオフセットです。本研究は、他の織り付けの動作ではなく、歩くだけに焦点を当てて、この選択プロセスが不可欠です。

3.テストとデータ分析

1. 無作為化セッションのデザインを使用して（セクション1.3で説明）、S12、S15、L9R6およびL6R9タスクの試験動物。タスク内の適応を回避するために改行を使用します。
2. 少なくとも60ヘルツのサンプリングレートでの高精細カメラで録音セッション。ビデオ編集ソフトウェアに再サンプリングして、さらなる分析のための唯一の歩行発作を選択せず​​にインポートビデオ録画。
3. マークが発症し、運動学的相のオフセット各被験者からのビデオ録画インチ
4. ここでは、手動でスタンスの開始時間を特定し、スタンス開始が上の手足の配置に関連したモーションブラーの損失によって示されているフレーム単位で各肢のために相殺するためにMATLABで書かれたカスタムソフトウェアと呼ばれるvideoaを使用四肢リフトオフの開始時に発生するオフセットペグ、及び姿勢は、モーションブラーの最初の証拠によって示されています。
5. 二つの連続動スタンスオンセット間の残り時間として遊脚相の持続時間を計算します。歩行は、ダブルスイング相（地面からの両方前肢や後肢）が含まれている場合例えば 、地上四足歩行と一致していない任意の動作を除外します。、進むから分析します。
6. 対応するステップのサイクル持続時間の関数として、各フェーズの期間をプロットします。線形回帰モデル（TPHASE = B1 + B2 * TC）との関係はTPHASEが電子である、Tcはサイクル期間で各肢のために取得したキャプチャither テ伸筋関連スタンスまたはTfと 、屈筋関連のスイングで、B1、B2が回帰モデルの実験定数（オフセットとスロープ）です。
   注：傾き（B2）は、移動速度の変化に伴う位相持続時間の変化量を表します。
7. 非対称性指数（AI）を計算するために、各肢のための式1および2（ 図2C）を使用します。どちらの式はそれらの合計の2つの値の違いを正規化し、単純な比率の同じ形を持っています。
   1. 式1を用いて、左スタンス変調（L）と右（R）の手足の傾きの差を使用して水平方向の差（AI _H）を算出します。同様に、フロント/前方（a）とバック/後方（P）手足からスロープを使って上下非対称（AIの_{V）を算出します} 。これらの二つの式を適用した結果を<1に対応するXY 4 点 ）前肢の非対称のデータセットでありますem>のAAIの_時間; 2）後肢非対称、 パイの _H; 3）前肢・後肢非対称性を残し、 ライ _V; 4）右前肢・後肢非対称、RAIの _V。
   2. すべての四肢全体の非対称性を視覚的に表現するためのパッチ（ 図2B）としてこれらの値をプロットします。
8. 前肢のパラメータとその反対側の後肢（式3、 図2C）との間に斜めの結合を評価するために、対角指数（DI）を計算します。
9. 手段分析¹⁹の事後比較で一方向ANOVAを用いて統計的有意性について| - |（AIL6R9 AIL9R6ΔAI=）、DIと同様に非対称性を、対向の条件との間に4のAIの違いをテスト

結果

図2は 、単一の代表的な主題のための運動の作業中に非対称性の分析を示します。 （ - 400 gで、 図3 250）の値は、個々に全ての被験者から（ 図2）式1および2を使用して、すべての条件について、図8の雌Sprague-Dawleyラットの複合データから計算しました。一般的に、前肢立脚相の変調は、歩行状態が好まれたために側（短いISL）の優先側（長いISL）上の立脚相がのより大きな部分を占める傾向にあったという概念と一致少ないました歩行減少の速度として好ま手足に比べてステップサイクル。

条件L9R6及びL6R9（ΔAI）から得られた対応する非対称性指数との差はconservativで一方向ANOVA（α= 0.05）、事後t検定を用いて試験しました MATLABでanova1とmultcompare

ディスカッション

この研究の理論的根拠は、非対称運動行動の正確な制御の変化を定量的に評価する行動タスクを開発することでした。脊髄CPGの存在は、しばらくの間機能的に実証されてきましたが、²⁰、そのメカニズム、および下行または感覚フィードバック経路からの調節入力を説明する解剖学的および機能的特徴は、過去10年まで特徴付けられていません^6,21,22。現在のコンセンサスは、固有の脊髄、感覚フィードバック、および下降コマンドが自発運動行動の生成に緊密に統合されているということです¹

本明細書に提示された非対称の正確な足の配置タスクは、皮質入力を必要とすることが知られているステッピングの器用な非対称制御に関与する制御システムに機能的に挑戦するように設計されています^23,24。このパフォーマンスは、下行皮質および脳幹制御への依存度が低い対称タスクと比較して評価されました。したがって、脊椎経路と下行経路の寄与を識別する機会があります。運動皮質は、移動、到達、姿勢調整中の筋肉相の調節に直接関与しているため9^、10、2...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MATLAB®R2013a	MathWorks		デザインプラットフォーム、カスタムビデオ、ビデオ注釈ソフトウェア
、Sony HDR-CX380/B High Definition Handycam	、Sony	27-HDRCX330/B	ビデオ取得デバイス。
Jifクリーミーピーナッツバター - グルテンフリー454 g	JMスマッカーカンパニー		食品報酬刺激。
ショ糖錠剤 - チョコレート 1800 g	TestDiet	1811256	食品報酬刺激。
マンザニータウッドかじりスティックBioServe		W0016	食品報酬刺激のプレゼンテーション用。