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方法論記事

抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

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DOI：

10.3791/52933

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2015年6月19日

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1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

この記事について

サマリー

好中球は、侵入する微生物に対する宿主防御だけでなく、腫瘍細胞の免疫監視にも重要な役割を果たしています。ここでは、抗腫瘍特性を持つ好中球の単離に関連する技術と、in vitroおよびin vivoでの抗腫瘍好中球機能のモニタリング方法について述べる。

要約

好中球は、ヒト循環中の全白血球の最も豊富な、微生物侵入に対する宿主防御において重要な役割を果たしています。さらに、好中球は、腫瘍細胞の免疫監視において中心的な役割を果たす。彼らは、腫瘍細胞を認識し、細胞接触依存性機構含む過酸化水素を介して、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を介してのいずれかで腫瘍細胞死を誘導する能力を有します。抗腫瘍活性を有する好中球は、癌患者の腫瘍を有するマウスの末梢血から単離することができます。これらの好中球は、有意な腫瘍細胞傷害活性を示さない健常者またはナイーブマウスの好中球と区別するために、腫瘍同伴好中球（TEN）と呼ばれています。他の白血球と比較して、好中球は、密度勾配にかけたときに可能> 98％純粋な好中球の集団を得ることができる別の浮力を示しています。しかし、加えて、通常高密度の好中球集団（HDN）に、癌患者において、腫瘍を有するマウスにおける、ならびに慢性炎症性条件下で、明確な低密度好中球集団（LDN）は、循環に表示されます。 LDNは、単核画分と共精製すると、正または負の選択戦略を用いて、単核細胞から分離することができます。単離された好中球の純度は、フローサイトメトリーにより決定されると、それらは、 インビトロおよびインビボ機能アッセイにおいて用いることができます。我々は、好中球の抗腫瘍活性を監視するための能力移行すると活性酸素種を生成すること、ならびにそれらの貪食能のex vivoでモニタリングする技術を説明します。我々はさらに、in vivoで追跡するための好中球を標識するための技術を説明し、そしてインビボでの抗転移能力を決定します。すべてのこれらの技術は、抗腫瘍で好中球を取得し、特徴づけるためにどのように理解するために不可欠です機能。

概要

好中球は、最初に侵入微生物に対する最初の行の防御として機能する自然免疫細胞として特徴づけられました。今日では、好中球は造血3の調節、外来抗原1,2-に対する適応免疫応答をマウントに関与している多くの広範囲の機能を有することが知られている血管新生4,5創傷治癒します。さらに、好中球は、それらのプロ及び抗腫瘍活性6,7によって腫瘍の増殖および転移の進行に影響を及ぼし得ます。好中球は、多型、セグメント化、核によって特徴付けられる（したがって、多形核（PMN）白血球と呼ばれる）と、少なくとも3顆粒の別個のサブクラスならびに分泌小胞8（ 図1A-C）を含有します。

好中球は、高い貪食能と微生物の除去のための重要な高NADPHオキシダーゼ活性を有しており、時のための重要なケモカインの広い範囲を分泌します炎症8,9の部位に付加的な好中球および他の免疫細胞の牽引。好中球は、Toll様受容体（TLR）を含む表面受容体の多量の発現を特徴とする、C型レクチン受容体（のCLR）は、受容体3（のCD11b / CD18）、および他の接着分子（ 例えば、L-セレクチンを補完しますLFA-1、VLA-4および癌胎児性抗原関連細胞接着分子3（CEACAM3 / CD66b））、ケモカイン受容体（ 例えば、CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、化学誘引物質受容体（ 例えば、PAFR、LTB 4 RとのC5aR） 、サイトカイン受容体（ 例えば、G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、ホルミルペプチド受容体（ 例えば、FPR1-3）、およびFc受容体（ 例えば、CD16（FcγRIIIをヒト好中球はのCD11b、CD15、CD16およびCD66b白血球マーカーを用いて同定されるのに対して）、CD32（のFcγRII）およびCD64（FcγRIで）10。マウスでは、好中球は通常、のCD11b + Ly6G +として同定されています。また、一般的に組織中の好中球の検出のための顆粒タンパク質のミエロペルオキシダーゼ（MPO）と好中球エラスターゼ（NE）のために染色する受け入れられています。

これは、好中球の多様な機能が同じ細胞により、または異なる細胞亜集団によって媒介されるかどうかはまだ不明です。蓄積データは、プロ炎症性刺激と微小環境11,12の影響を受けて可塑性の高度を示す異種好中球集団の存在を示唆しています。 Fridlender ら 13は、2つの主要な亜集団に癌において好中球を著しく分割しているプロ腫瘍特性を有する抗腫瘍特性を有するN1およびN2と呼ばれます。癌において、ならびに慢性炎症において、T細胞応答14を抑制顆粒骨髄由来サプレッサー細胞（G-たMDSC）からなる追加の亜集団が存在します。 G-のMDSCはのCD11b + Ly6Cによって特徴付け未熟骨髄細胞であると考えられていますマウス15で低 Ly6G こんにちは表現型、ヒト16でCD15 + / CD16 低の表現型を有しながら。 G-たMDSC通常よりもサイトカインおよびケモカインのより低いレベルは、好中球を循環させながら、アルギナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのより高いレベルを発現します。彼らはあまり食作用および移動であるが、ROS 15,17,18の高いレベルを生成します。本論文では、抗腫瘍特性を有する好中球の単離および特徴付けのためにいくつかの基本的な方法論を説明します。

（45から70までパーセント; 1,800 - 6,000 /μl）を好中球は、ヒトの循環内のすべての白血球の最大の人口を構成しているが、マウスでは、通常の条件下で、彼らは（10むしろ疎である - 15％、300から500 /μL ）。慢性炎症7の状態を示して着実に炎症時に時折癌における好中球数が増加します。好中球は多能骨髄系共通前駆体（CMP）CEから発生します骨髄中のLLS、骨髄芽球の段階を通過する分化プロセス（MB）を介して、前骨髄球（PM）、骨髄球（MC）、後骨髄球（MM）とバンド細胞（BC）8。それらは循環8に放出される前に7日-成熟した、有糸分裂後の好中球は4のための骨髄内に残ることがあります。炎症状態の下で延長することができる12時間、 - 血液中の好中球の売上高は6の平均半減期は、通常、迅速です。非刺激好中球は、ホルボールエステルホルボール12にそれらを暴露することにより、抗腫瘍形成活性、ケモカインIL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5およびCXCL5 6,19または人工的にナイーブな好中球を露出することによって取得することができる機能を制限してきました-myristate 13-アセテート（PMA）6。

一緒に好中球の数が少ないと血液の好中球の半減期が短い（〜3から5×10 5）ナイーブ6 1mlの血液から達成- 8週齢のマウス、それを作りましたin vitroでマウスの好中球を循環させる機能を探索することは困難。この困難を克服するために、他のソースが使用されています。例えば、好中球の多くは、（チオグリコレート培地またはザイモサンAの腹腔内注射後に、 例えば ）骨髄20または無菌性炎症の誘導後腹膜から得ることができます。これは、腹腔から得られた好中球は、任意の抗腫瘍形成活性（未発表の観察）を及ぼさないことに留意すべきです。

Granot ら 6 20れるよう、マウス4T1乳癌細胞株を用いて同所接種したBALB / cマウスは、腫瘍進行6（ 図2A）で悪化好中球増加症を発症することが観察- 40万人の血液好中球は容易に1ミリリットルの血液から単離することができます3から4週間後、腫瘍接種。これらの好中球は、抗腫瘍活性を獲得し、それに応じてCOIされていますナイーブ好中球6（ 図2B）と区別するために定義される腫瘍連行好中球（TEN）、。高密度の好中球（HDN、 図1（a））は非常に抗腫瘍形成であるが、癌との関連で発生した低密度の好中球（LDN、 図1B）は 21ではありません。また、腫瘍を有するマウスの骨髄および脾臓から高密度の好中球は、抗腫瘍活性（未発表データ）を有しています。これは、好中球の量が増加すると、腫瘍の進行に脾臓を徐々に拡大（脾腫）となることに留意すべきです。

これは、10にも自発的な（MMTV-PyMTおよびMMTV-Wnt1の乳腺腫瘍とのK-ras駆動肺腫瘍）の両方を含む癌の他のモデルで生成され、AT-3（MMTV-PyMT）とE0771の乳癌（注入されることに留意すべきです細胞、LLCルイス肺癌細胞およびB16-F10黒色腫細胞）。しかしながら、これらのTUMでの好中球動員の、程度3週間後に1ミリリットルの血液中の10×10 6好中球-またはモデルが5に達し、4T1-接種されたマウスのよりもはるかに少ないです。

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プロトコル

動物：5-7週齢のBALB / cマウスは、ハーラン（イスラエル）から購入します。動物に関わるすべての実験は、ヘブライ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。ヒトサンプル：がん患者と健康なボランティアからの血液の採取はハダーサ医療センター治験審査委員会（IRB）により承認されました。

乳がんマウスモデルを用いたin vivoでの抗腫瘍特性を有する好中球の1誘導。

注：すべての手順は、層流（LAF）バイオセーフティキャビネット内で無菌溶液を使用して実行する必要があります。

  1. シード5×10 10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充した4.5グラム/ LのD-グルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10ml中の100mm組織培養プレート中で5 4T1細胞を、2mMのD-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシン硫酸塩。目をインキュベート3〜4日、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中、37℃でのE細胞。実験の日に、100％コンフルエント - 細胞が50であることを確認してください。
  2. 、組織培養プレートから腫瘍細胞を剥離培地を吸引5mlのPBSで細胞を洗浄するために、PBSを吸引し、2.5グラム/ Lトリプシン溶液3mlを加えます。 37ºCでトリプシンで3分 - セル2をインキュベートします。
  3. すべてのセルが分離されるまで上下トリプシンおよびピペットを中和するために10ミリリットル血清含有培地を追加します。 15ミリリットルコニカル遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
  4. RTで5分間、200×gで細胞を遠心。細胞ペレットの上に200μlの培地を残して培地を吸引除去します。残留量で細胞を再懸濁し、10mlのPBSを追加。均一な細胞懸濁液を取得し、血球計数器で細胞をカウントする10μLを取り出すことが3回 - 管2を反転します。生細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルーを使用してください。
  5. 室温で200×gで5分間、細胞懸濁液を遠心します。 PBSを吸引除去し、2×10 6細胞/ mlの最終濃度でPBS中に細胞を再懸濁。単一細胞懸濁液には凝集していないことを確認してください。
  6. 同所30GのX 8mmの針を0.3ミリリットル注射器を使用して、雌のBALB / cマウスの左鼠径部乳腺脂肪パッドに50μlのPBS中1×10 6 4T1細胞またはルシフェラーゼを発現する4T1細胞を注入します。
    1. 100％酸素中 - （5％3）注射の前に、イソフルランの遅い流速を受け取る誘導チャンバ内でマウスを麻酔。
    2. 無菌手術用パッドの上にマウスを置き、ヘッドが正しくイソフルランノーズコーンの内側に配置されていることを確認してください。足をつまんで、適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。注射部位の周りの毛を剃る、70％EtOHで消毒します。
    3. 小さな水平切開を行うために手術器具の滅菌セットを使用（5ミリメートル）程度鼠径部および腹部の乳首の間imately半分、脂肪パッドを露出させ、50μlの1×10 6 4T1細胞を注入します。 1週間後に除去されるべきである9ミリメートルクリップで切開を閉じます。ルシフェラーゼ発現細胞の注射は、生物発光イメージングによる腫瘍サイズおよび転移のモニタリングを可能にします。
      注：この最小侵襲法は、任意の手術後の治療を必要とせず、注射したマウスは、2以内に回復 - 3分。
    4. 彼らは意識を取り戻すまでマウスを監視し、彼らは他のマウスの会社に入社する前に、完全な意識を取り戻すことを確認してください。
  7. 3の後- 4週間、原発腫瘍2 cm 3の体積に達したとき、遅いCO 2流によってマウスを屠殺し、すぐに最後の息の後、25Gのx 5/8 "針を用いて心臓穿刺により血液を得ますヘパリンで前処理した1mlツベルクリン注射器に接続されています。挿入時に上向き針の口を保ちますゆっくりと徐々に心臓に向かって振動板を介して水平位置で注射器、および過剰な圧力（ 図3）を回避血を引きます。

2.好中球の分離

  1. 担癌マウスの血液からの細胞傷害性の好中球の単離。
    1. 6ミリリットルの最終容量まで、0.5％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSで（プロトコル1.11を参照）担癌マウスから引き出された1ミリリットルの血液を希釈します。
    2. 新たに調製された不連続ショ糖勾配に希釈した血液の分画：
      1. 15ミリリットルの円錐形のポリプロピレン遠心管の底に滅菌濾過したスクロース1.119グラム/ミリリットルの3ミリリットルを追加します。
      2. ゆっくりと慎重に、1.119グラム/ mlの層の上に滅菌濾過したスクロース1.077グラム/ミリリットルのレイヤ3ミリリットル。その後、1.077グラム/ mlの層（ 図4A）の上にゆっくりと慎重に希釈された血液（プロトコル2.1.1）の6ミリリットルを追加します。それが傾斜管を保持することを推奨され、管の下壁に向かってピペットの口を保持しながら、遅いが、連続流によって異なる成分をdding、乱流が形成されないようにします。
    3. ブレーキなしの室温で30分間、700×gで、ショ糖勾配に希釈された血液を含むチューブを遠心します。
    4. 慎重に任意の乱流を発生させることなく遠心分離機からチューブを取り外します。赤血球の大部分は、チューブの底にあります。低密度白血球がで発見されながら、高密度の好中球（HDN）は、1.119グラム/ mlおよび（3ミリリットルマークの周りに）1.077グラム/ mlの層の間の界面での白に赤リングとして見出されます1.077グラム/ mlの層およびBSA含有PBS（6ミリリットルマークの周りに、 図4B参照 ）との間の界面に白い輪。
    5. 低密度細胞層5mm上に到達するまで、PBS + 0.5％BSAを吸引除去します。ゆっくりとセルの周囲に渦巻くを通じて1ミリリットルチップ内に遅い吸引によって低密度細胞をピペット。0.5％BSAを含むPBSを30mlに細胞を移します。
    6. 高密度セル帯域5mm上に到達するまで同じ勾配管上層を吸引除去します。主に高密度の好中球である高密度の細胞を、アウトピペット、および0.5％BSAを含むPBSを30mlに細胞を移します。
    7. RTで10分間400×gで細胞を遠心。
    8. 30秒、36 mlの滅菌HPLC等級の水で細胞を再懸濁することによって、上清と溶解赤血球を吸引します。等張性は、5倍の9ミリリットルを添加することによって復元されるべきであるPBSは、2.5％（w / v）のBSAを添加し、濃縮しました。
    9. RTで10分間400×gで細胞を遠心。
    10. 上清を吸引除去し、PBS-BSAで細胞を懸濁します。血球計数器で好中球の数をカウントし、生細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルーを使用しています。
    11. RTで10分間400×gで細胞を遠心し、最終細胞密度に所望インキュベーション培地中の好中球を再懸濁。使用すぐに好中球。
    12. その後、別の遠心分離後、最終的な細胞密度まで培養培地中の好中球を再懸濁します。すぐに好中球を使用してください。
  2. 癌患者からの循環好中球の単離。
    1. 生理食塩水中の3％デキストランT500等体積のヘパリン化（20 U / ml）のヒト血液を10mlを混合し、室温で30分間インキュベートします。このインキュベーションの間、赤血球が沈降します。
    2. 10ミリリットルのスクロース1.077グラム/ mlの50mlコニカルポリプロピレンチューブを準備し、ゆっくりと1.077グラム/ mlのスクロース層（ 図4C）の上に白血球が豊富な上清をレイヤー。
    3. ブレーキなしの室温で30分間、400×gで遠心分離します。高密度の好中球（HDN）は、ペレットに表示されます。低密度の好中球（LDN）1.077グラム/ mlのスクロース層と血漿（ 図4D）の間の界面での単球およびリンパ球と共精製します。
    4. 10ミリリットル0で好中球を再懸濁します。30秒間、2％NaClを汚染赤血球を溶解し、1.6％のNaClの10ミリリットルを追加することにより、等張性を回復し、一回反転させます。
    5. 遠心分離機5室温で160×gで分、そして20ミリリットルハンクス平衡塩溶液で3回洗浄します。各洗浄後に遠心分離し、上清を吸引除去します。
    6. 好中球をカウントし、mlまたは所望に応じて2×10 6好中球/で、2％FBSを補充したRPMI-1640で細胞を再懸濁します。

磁気ビーズを用いて血液好中球の3充実

  1. 正の選択
    1. プロトコル1.8で説明したようにヘパリン化シリンジを用いて、マウスからの血液1ミリリットルを取ります。
    2. 室温で5分間、400×gで15ミリリットルコニカルチューブに血液を遠心分離します。
    3. 上清を吸引またはさらなる研究のために血漿を保持します。
    4. 溶解8ミリリットルHPLCグレードの水の中に細胞を再懸濁することにより、赤血球。 30秒後、5×conceを2mlを添加することによって、等張性を回復ntrated PBS、2.5％BSAを含みます。細胞を数えます。
    5. 室温で5分間、400×gで遠心分離します。
    6. 10 8個の細胞あたり、0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有する200μlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁します。
    7. ビオチン化抗Ly6G抗体50μlのを追加します。よく混ぜ、冷蔵庫（ない氷上）で10分間インキュベートします。
    8. 0.5％のBSAおよび2mM EDTAを含有する冷PBS 150μlを添加します。
    9. 渦抗ビオチン被覆磁性マイクロビーズ原液。細胞懸濁液に100μlのを転送します。よく混ぜ、冷蔵庫（ない氷上）で15分間インキュベートします。
    10. 0.5％BSAおよび2mM EDTA、および室温で10分間、400×gで遠心分離を含む10 mlのPBSを添加することにより細胞を洗浄します。
    11. 0.5％のBSAおよび2mM EDTAを含有する500μlの冷PBSで吸引完全に上清を、再懸濁。
    12. 磁気スタンドに取り付けられているマグネットホルダに磁気分離カラムを挿入し、500μlの0を含む冷PBSでそれをすすいでください。5％BSAおよび2mM EDTA。
    13. カラム上に細胞懸濁液を適用します。フロースルーは、非標識LyG6陰性細胞が含まれています。
    14. 500μlのPBS、0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有するカラムを洗浄。追加の非標識細胞は、フロースルーになります。
    15. 0.5％のBSAおよび2mM EDTAを含有する別の500μlのPBSでの洗浄工程を繰り返します。
    16. 磁石から列を削除し、15 mlのコレクションチューブの上に置きます。 0.5％のBSAおよび2mM EDTAを含有する1mlのPBSを追加し、しっかりと列にプランジャーを押すことにより、磁気標識された細胞を洗い流します。フロースルーはLy6G +好中球が含まれています。
  2. 陰性選択
    1. 手順3.1.5に3.1.1による血液の白血球を準備します。
    2. 再懸 ​​濁5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに、0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有する1mlのPBS中に1×10 8細胞。
    3. 50μlの正常ラット血清を追加します。
    4. 好中球の濃縮cの50μLを追加（非好中球白血球に特異的なビオチン化抗体を含む）ocktailは、十分に混合し、冷蔵庫で15分間インキュベートします。
    5. 4 mlのPBSを添加することは、10分間、0.5％BSAおよび2mM EDTA、および400×gで遠心分離を含むことにより、細胞を洗浄。
    6. 上清を捨て、0.5％のBSAおよび2mM EDTAを含有する1mlのPBSで細胞を再懸濁します。
    7. ビオチンおよびデキストランに対して向けられた四量体抗体複合体の50μlを添加します。よく混ぜ、冷蔵庫で10分間インキュベートします。
    8. 細胞懸濁液150μLを加える前に、デキストラン被覆磁性ビーズを含むよくボルテックスチューブ。よく混ぜ、冷蔵庫で10分間インキュベートします。
    9. 0.5％BSAおよび2mM EDTAを含むPBSを添加することにより2.5ミリリットルの総体積に細胞懸濁液をもたらします。均質な細胞懸濁液を得るために、穏やかに混合します。
    10. 磁石に（キャップ​​なし）チューブを挿入し、3分間放置。
    11. 連続1チューブと磁石を反転動作流体中の未結合の細胞が新しいチューブに移されるようにします。直立位置に戻り、その後、3秒 - 2に反転磁石とチューブを残します。結合していない好中球が転送流体になりながら、磁気標識不要な細胞は、元のチューブの壁に結合したままになります。

好中球の細胞学的染色4.

  1. 50μlのPBS中に1×10 5好中球を再懸濁し、このようなサイトスピンのような薄層細胞調製アダプタに細胞懸濁液を移します。 5分間、150×gで、アダプターを遠心。アダプタからの前標識されたスライドガラスを分離します。
  2. 2分間70％エタノールでガラススライドを浸漬することにより細胞を固定。アダプタからの調製物は（ステップ4.1参照）染色の前に室温で乾燥することができます。蒸留水で6回 - スライド5を浸し。
  3. マイヤーのヘマトキシリン​​液に2分 - 1を染色します。水道水で1分間洗浄します。エオシンY溶​​液に10秒を染色 。水道水で洗ってください。エタノール濃度（70％、96％及び100％）の増加でスライドをリンスすることにより脱水。ガラスがまもなく空気乾燥スライドしてみましょうと、光学顕微鏡下でスライドを検査します。
    注：エオシンはピンクで、非特異的タンパク質を染色するのに対し、ヘマトキシリン​​は、深い青紫色やシミ核酸を有しています。好中球の細胞質顆粒は「中立的であることを愛する」名の由来である酸性または塩基性染料で染色されたままです。明るい赤、ヘマトキシリンおよびエオシンとeosinophilc顆粒球と好塩基性顆粒球の染色ダークブルーのに対し、好中球は、（ 図1Aを参照してください）中立ピンク色に見えます。 5ローブ「セグメント化された好中球'（ 図1Aおよび1C） -成熟好中球を、2を持つ大規模な一般的である多形核、ことを特徴とします。未成熟好中球は、1つのローブに湾曲またはリング状核（ 図1B）によって特徴付けられます。
ve_title "> 5。フローサイトメトリーによる好中球の純度を決意。

  1. FACS緩衝液100μl（PBS、0.5％のBSA、2mMのEDTA及び0.02％のNaN 3を含有する）中で1×10 6個の細胞を再懸濁します。全血サンプルについては、溶血は（ステップ3.1.5へ3.1.1）を染色する前に必要です。 5分間のFcRブロッキング試薬を10μl加えます。
  2. 、ヒト好中球のマウスの好中球またはCD11bおよびCD66bへのLy-6Gに特異的に蛍光標識抗体0.5μgのを追加し、よく混合し、室温で15分間インキュベートします。
  3. PBS、0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有する500μlの体積を調整し、フローサイトメトリーによって染色を分析します。

生体内で 6フォロー好中球ゲート

  1. 好中球の生体内 BrdU標識で
    1. 腹腔内腫瘍を有するマウスに滅菌PBS中10 mg / mlのブロモデオキシウリジン（BrdUの）溶液100μlを注入します。
    2. 血液好中球を48時間後噴射Aを分離議定書2.1 ccording。のBrdUフローキットを用いて染色するのBrdU標識された好中球。
  2. 好中球のCFSE標識
    1. 予め温めておいたPBS 1ml中10 7好中球を再懸濁します。
    2. 10μMの最終濃度になるように懸濁し、好中球への5 mMのCFSEストック溶液2μlを添加します。よく混合し、37℃で15分間インキュベートします。 1ミリリットルDMSO中5mMのCFSEが2.8 mgのCFSE（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル - ） - 5-（及び6）を溶解することにより調製されます。 -20℃の暗所で無菌200μlのチューブとストア内の10μlのアリコートに分割します。
    3. 10％FBSを含むRPMI-1640の等量を添加することによって、過剰CFSEを中和します。 37℃で10分間インキュベートします。室温で10分間、400×gでの好中球を遠心。 10％FBSを含むRPMI-1640 10mlに二度の好中球を洗ってください。
    4. PBSの適切な量で10分間再懸濁し、400×gで遠心分離します。好中球（ 例えば、1×10 7 細胞）は、現在のレシピエントマウスに静脈内または心臓注射によって注入することができます。

7. インビトロルシフェラーゼアッセイは、単離された好中球の抗腫瘍活性を監視します。

  1. プロトコル1.1〜1.5で4T1細胞について記載したように、ルシフェラーゼ標識腫瘍細胞を培養するが、2％FBSを補充した最適化された低血清培地中のトリプシン解離細胞を懸濁します。 1mlあたり5×10 4細胞に細胞密度を調整します。
  2. 100μl中の種子5000ルシフェラーゼ標識腫瘍細胞を白色96平底組織培養ウェルプレートの各ウェルに、0.5％FBSを含む低血清培地を最適化します。
  3. 腫瘍細胞を播種後の4時間は、50μlの1×10 5好中球が最適化された0.5％FBSを含む血清培地を低減し、O / Nインキュベート追加します。 2×10 6細胞/ mlの濃度で好中球の細胞懸濁液を調製します。対照ウェルは、好中球なしに50μlの培地を取得する必要があります。行います各実験設定の複数の反復。
  4. 次の朝、静かに上清を吸引し、200μlのPBSで各ウェルを洗浄します。 PBSを吸引し、受動的溶解緩衝液50μlを添加します。簡単に（例えば、AT-3細胞）細胞を剥離するために、PBSで洗っていないとすぐに成長培地を吸引した後、細胞培養溶解バッファーを加えます。
  5. アルミホイルでプレートを覆い、室温で20分間、150 rpmでオービタルシェーカー上でインキュベートします。
  6. 発光プレートリーダーでプレートを置きます。よくワイズ50μlのルシフェラーゼアッセイ溶液を注入して、ウェル当たり10秒間化学発光を読み取ります。
  7. 次式により％の腫瘍溶解を計算する：％腫瘍溶解が=（1- [好中球の試料の発光] / [培地中のサンプルの発光]）×100％。

注：プロトコル8.1で説明したように、転移性播種に好中球の寄与を評価するために、好中球が消耗されています。効果的なDEPL用etion後7日目の腫瘍移植から始まる好中球​​枯渇抗体を投与します。

乳癌マウスモデルにおける好中球の8抗転移活性。

  1. 好中球のインビボ枯渇 。
    1. たてマウスあたり100μlの最終容量で、生理食塩水でラット抗Ly6G抗体（好中球枯渇抗体）のまたはラットアイソタイプコントロール抗体（IgGの2aと 、Κ）の12.5μgの準備をします。
    2. 後3日目の腫瘍生着に起動すると、毎日12.5μgのラット抗Ly6G抗体（100μl）を腹腔内投与量を​​注入します。と対照マウスを注入または12.5μgの（100μl）を、ラットのアイソタイプコントロール抗体（IgGの2aと 、Κ）。
    3. 4T1腫瘍が成長する際に、好中球の生産速度が劇的に増加するように14日目に開始し、1日2回の抗体を投与します。
    4. 外側尾静脈をニッキングすることにより - （3滴2）一日おきに、血液サンプルを得ます。アンチに血液を集めますチューブ（ヘパリン、クエン酸塩またはEDTA）を含む-coagulant。
    5. 議定書5に記載されているように、フローサイトメトリーを用いて好中球の枯渇を確認します。
  2. 腫瘍中和試験（改変されたウィンアッセイ）
    1. 腫瘍を有するマウスからの好中球を分離します。 （マウスあたり）50μlの生理食塩水に1×10 6個の腫瘍細胞と3×10 6好中球を混ぜます。
    2. 8週齢ナイーブBALB / cマウス - 6の脇腹に皮下細胞を注入します。腫瘍の大きさの正確な測定を可能にするために、腫瘍移植の前に逃げ面を剃ります。 5日後の生着に開始し、毎日腫瘍の大きさを測定します。
  3. 好中球の養子移入
    1. 尾静脈に200μlのPBSで2×10 4のルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を注入します。
    2. 好中球の移動は、腫瘍細胞注射後4時間に実行されるべきです。したがって、その中で計画され、約2時間前に、腫瘍を有するマウス（プロトコル2.1）からHDNの精製を開始生体内伝達。 2.5×10 7細胞/ mlの最終濃度でPBS中の好中球を再懸濁します。
    3. 腫瘍細胞を導入した後の4時間は、5分間の加熱ランプの下でマウスを置きます。制止にマウスを置き、尾静脈を介して、5×10 6 HDN（200μl）を注入します。対照マウスにはビヒクル（PBS）を注射します。
    4. 生体内撮像システムまたは免疫組織化学によって生物発光を用いて種々の時点で肺転移の形成を監視します。
  4. 肺転移性播種アッセイ
    1. 同所プロトコル1で説明したように、左鼠径部乳腺脂肪パッドに1×10 6親4T1細胞- 0.5を注入します。
    2. 10日目に、5×10 5細胞/ mlの最終濃度でPBS中のGFP発現4T1細胞を再懸濁。 5分間の加熱ランプの下でマウスを置きます。
    3. 制止にマウスを置き、4Tに静脈内1×10 5 GFP発現4T1細胞（200μl）を注入します1腫瘍を有するマウスまたは未処理マウス。
    4. 翌日、マウスを安楽死させると、残りのRBCを除去するために、20ミリリットルのPBSで肺を灌流。
    5. 免疫組織化学により、GFP陽性細胞の分析のために肺を切除。
      注：プロトコル8.1で説明したように、転移性播種に好中球の寄与を評価するために、好中球が消耗されています。効果的な枯渇のための7日後に腫瘍移植から始まる好中球​​枯渇抗体を投与します。

腫瘍を有するマウスからの好中球によるT細胞増殖の抑制9。

  1. 10mlのPBSで安楽死させ、ナイーブBALB / cマウスと場所から脾臓を取り出します。
  2. RPMI-1640で満たされたペトリ皿にフィットである40μmのセルストレーナーに脾臓を置きます。細胞はペトリ皿にストレーナーを通してシリンジのプランジャ端部を使用して、脾臓をマッシュアップ。 5ミリリットルRPMIで細胞ストレーナーを洗浄します。ストレーナーを捨てます。
  3. 10分間400×gでの50mlコニカルチューブに再懸濁した細胞を移し、遠心分離機。
  4. 上清を捨てて、20秒間純水36ミリリットルに細胞を懸濁することにより赤血球を溶解し、PBSの4ミリリットルを追加することによって、等張性に調整する別の方法として、X 10を集中し、赤血球の5ミリリットルに細胞を懸濁することにより赤血球を溶解バッファー（ACK）を溶解し、室温で5分間インキュベートします。 RPMI-1640培地10mlを加えることによってACKを中和します。室温で10分間、400×gで遠心分離します。 5ミリリットルのPBSで細胞を再懸濁し、細胞をカウントします。
  5. 4×10 7細胞/ 15mlチューブ2 mlの最終濃度になるようにPBSで脾細胞を再懸濁します。 PBS中2.5μMのCFSE溶液2mlを加えます。すぐにチューブを反転し、光から保護時々混合し（各2分）、37℃で10分間インキュベートします。
  6. 予め温めておいたFBS（100％）を4mlを添加することにより、過剰CFSEをクエンチし、室温で1分間インキュベートします。 10、400×gで3 mlのPBSと遠心を追加分。
  7. 30ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、10分間、400×gで遠心します。
  8. 40μmのセルストレーナーを通して細胞を濾過し、再びPBSで洗浄します。
  9. 2×10 7細胞/ mlの最終濃度まで、10％FBSを補充したRPMI-1640培地中で細胞を再懸濁します。
  10. シード2×10 6 /ウェル（200μl）を24ウェル組織培養プレートで。
  11. 10％FBSを含む500μlのRPMI-1640中で精製したアルメニアハムスター抗マウスCD3ε抗体1μgのを追加することによって、細胞を刺激します。
  12. CFSE標識脾臓細胞を10％FBSを300μlのRPMI-1640中で2×10 6 HDNやLDNを追加し、37℃で3日間インキュベートします。好中球のないウェルを300μlの培地を取得する必要があります。各ウェル中の総体積を1mlにする必要があります。
  13. 細胞を収集し、フローサイトメトリーのためにそれらを準備します。 100μlのFACS緩衝液（プロトコル5）で細胞を再懸濁し、FcRはブロッキング試薬の10μlを添加します。 RTで5分間インキュベートします。
  14. 追加1＆＃956; APC結合抗CD8α抗体のL、室温で15分間インキュベートします。
  15. フローサイトメトリーによるCD8 + T細胞上のCFSE蛍光強度（ 図5）を決定します。 CFSE強度は、各細胞分裂時に半分になります。したがって、細胞分裂の数をCFSE染色の強度によって決定することができます。

10.好中球遊走アッセイ

  1. 最適化された7ミリリットルのシード5×10 5 4T1細胞を、25cm 2の組織培養フラスコに、0.5％FBSを補充した無血清培地を減少させ、37℃で24時間インキュベートします。
  2. 5ミクロンの孔径を有する移行板の下部チャンバーに上清800μlのを転送します。
  3. 再懸 ​​濁し、0.5％FBSを補充した最適縮小血清培地400μlの2×10 5好中球。上部チャンバーに細胞懸濁液を適用し、37℃で2時間インキュベートします。
  4. インキュベーションの終了時に、上部チャンバを除去し、下部チャンバーに移動した好中球の数をカウントします。

活性酸素種の11モニタリング好中球の製造（ROS）。

  1. フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液中1.1×10 6好中球/ mlのを準備します。白色96平底ウェルプレートの各ウェルに2×10 5好中球を含むプレートを180μl。
  2. 発光プレートリーダーでプレートを置きます。 50μMの最終濃度を得るために各ウェルにPBS中500μMのルミノール溶液20μlを追加します。 10秒間隔で5分間の時間経過に1秒のための基礎化学発光をお読みください。
  3. （10μMの濃度で10nm以上100nm以下のfMLPの濃度で、例えば、PMA）刺激薬を追加します。フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液中の各薬剤の10倍濃縮液を調製し、各ウェルに22μlを添加します。井戸を制御するには、22μlの車両を追加します。
  4. Measuプレートリーダーで化学発光再。短い（5分毎に10秒）と長い時間経過（1時間毎分）の両方を行います。

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結果

最近の研究では、好中球6のための抗転移作用を同定しました。腫瘍を有するマウスからの好中球は、細胞傷害性表現型を獲得し、腫瘍細胞の6を殺す能力を有します。これは、有意な抗腫瘍効果6を有していないナイーブマウスからの好中球とは対照的です。プロトコルセクションに記載された技術のいくつかは、in vitroおよびin vivo 6 において抗腫瘍好中球機能を研究するために使用されています。

腫瘍細胞傷害性好中球は、腫瘍を有するマウス6から得ることができます。この目的を達成するために、マウスを、同所左鼠径部乳房脂肪パッド（プロトコル1）に4T1細胞を注射しました。 2 cm 3の（ 図3 - -腫瘍は左下腹部に明らかである）後21日目の腫瘍接種により、原発腫瘍は1のサイズに達しました。この時、マウスを安楽死させ、1mlの血液を（マウス当たり）描かれました心臓穿刺（ 図3）

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ディスカッション

好中球は、すべての白血球の最も豊富であり、感染症や炎症の場合には最初の対応です。そのようなものとして、それらは、外部の合図に非常に敏感であり、容易に活性化されます。また、好中球は非常に短い半減期および迅速なターンオーバーを持っています。一緒に、これらの特性は、ユニークな実験的な戦略が必要とされるように、好中球での作業のいくつかの困難を、上げます。例えば、いくつかの好中球の精製戦略は、独自の長所と短所とのそれぞれは、存在します。

好中球での作業における重要なステップは、全血からの精製です。好中球は、効率的に密度勾配または抗体ベースの戦略（正または負の選択）のいずれかを用いて精製することができます。選択の私たちの方法は、最小限の非特異的活性化と高度に精製された好中球の高い数を得られるので、密度勾配を使用することです。しかし、我々は最近の研究21に示すように、ウィット時間腫瘍進行好中球、単核、低密度画分に高い数値に蓄積します。これらの条件下での密度勾配の使用は、全体の循環好中球のレパートリー、及び高他の単核細胞（リンパ球および単球）で汚染された低密度の好中球の割合を...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ZGはイスラエル科学財団（助成金番号11分の41）のI-COREプログラムからの助成金によってサポートされ、Abisch·フレンケル財団、Rosetrees信託、イスラエル癌研究財団（ICRF - 研究キャリア開発賞）とCONCERNファンデーション。 ZGFはイスラエル癌研究財団（ICRF - 研究キャリア開発賞）からの助成金によってサポートされ、保健のイスラエル省イスラエル肺協会のチーフサイエンティスト。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞株
マウス 4T1 乳がん細胞ADCCCRL-2539増殖培地: DMEM + 10% 熱不活化 FBS
プラスチック製品および機器
24 ウェル組織培養プレート Falcon353047滅菌
100 mm 組織培養プレート コーニング430167滅菌
25 cm2 組織培養フラスコNunc156340滅菌
90 mm 細菌グレード培養皿 Miniplast, Ein Shemer, Israel20090-01-017滅菌
15 ml 滅菌円錐形遠心分離チューブ Miniplast、Ein Shemer、イスラエル835015-40-111
50ml滅菌円錐形遠心分離チューブ Miniplast, Ein Shemer, Israel835050-21-111Sterile
Falcon 12 x 75 mm 丸底ポリスチレンチューブ Becton Dickinson352058Sterile
Millicell 24 マイグレーションプレート、孔径 5μ;m Merck MilliporePSMT010R1滅菌
ホワイト 96 平底ウェルプレート Costar3917滅菌
セルストレーナー (40 mm) BD Falcon352340滅菌
20G x 1.5" ニードルBD Microlance 3 301300滅菌
23G x 1インチ針 BD Microlance 4300800滅菌
25G x 5/8" 針 BD Microlance 5300600滅菌
0.3 ml シリンジ 30G x 8mm ニードル付きBD Micro-Fine Plus Demi320829滅菌
9 mm クリップ BD、オートクリップ 427631滅菌済み
EasySepマグネット STEMCELL Technologies18000
MACS LS 分離カラム Miltenyi Biotech130-042-201滅菌
MidiMACS セパレーター マグネットMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
顕微鏡スライドガラス メンゼル-GLäserスーパーフロスト Plus ThermoJ1800AMNZ
Orbital Shaker スカイライン ELMIS-3.02.10L
プレートリーダー TECANInfiniteF200Pro
POWDER
ウシ血清アルブミン (BSA), フラクション VSigmaA7906
ブロモデオキシウリジン (BrdU) BD Pharmingen550891 滅菌
CFSE (5-(および 6-)-カルボキシフルオレセイン ジアセテート、スクシンイミジルエステル)Molecular ProbesC1157
Dextran T500Sigma31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa SigmaH3149
アジ化ナトリウム (NaN3)SigmaS8032毒性が高く、取り扱いには注意が必要です
チオグリコール酸粉末 Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
メディアとサプリメント
ダルベッコの修正イーグル培地 (DMEM)シグマD5796滅菌
Opti-MEM®減らした血清中 Life Technologies31985062Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758Sterile
Foetal ウシ血清 (FBS), 熱不活性化SigmaF9665Sterile
L-GlutamineBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-020-1ASterile
Sodium pyruvateBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-042-1B滅菌ペ
ニシリン ストレプトマイシン x 1000 溶液Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-031-5
Mg2+ および Ca2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-1
Ca2+ および Mg2+ バイオロジカルインダストリーズ、ベス・ハエメク、イスラエル02-023-5A滅菌
HPLCグレードの水 J.T.ベイカー4218-03オートクレーブ
ソリューション
ACK–塩化アンモニウム・カリウムライフテクノロジーズ A10492-01
PBS中のブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(10 mg / ml)BrdU10 mgを1 mLのPBSおよび滅菌フィルターに溶解します。
CFSE、DMSO2.8 mgのCFSEを1 mLのDMSOに溶解します。滅菌済みの200mlチューブで10mlのアリコートに分け、-20oCで暗所で保存します。
Eosin Y solutionSigmaHT110-2-32
Hanks' balanced salt solutionBiological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1A滅菌
ヘパリン、PBSパリン100mgを5mlの滅菌PBSに溶解し、0.2mmフィルターに滅菌フィルターを通します。 
Histopaque-1119 シグマ111910.2mmフィルターを通した滅菌フィルター。
Histopaque-1077 シグマ107710.2mmフィルターを通した滅菌フィルター。
ルシフェラーゼ細胞培養溶解バッファー x5PromegaE153A使用直前に滅菌水で1:5に希釈してください。
ルシフェラーゼアッセイ溶液プロメガE1501ルシフェラーゼアッセイ基質粉末(E151A)とルシフェラーゼアッセイバッファー(E152A)メ
イヤーのヘマトキシリン溶液が含まれています シグマMHS-32
PBS + 0.5% BSA2.5 g BSAを500 ml PBSに溶解し、0.2 mmフィルターで滅菌フィルターを通します。
PBS + 1% BSA1g BSAを100mlのPBSに溶解し、0.2mmフィルターで滅菌フィルターを通します。
2.5% BSA12.5g BSAを250mlの滅菌HPLCグレードの水と250mlのPBSx10の混合物に溶解し、滅菌フィルターを0.2mmフィルターに通します。
0.5% BSAと2 mM EDTA250 mg BSAを50 mlの滅菌PBSに溶解し、0.5 mLの0.5M EDTA pH 8.0の200 mlを0.2 mmフィルターを通して滅菌フィルターに加えます。
FACS緩衝液(0.5%BSA、2mM EDTAおよび0.02%NaN3)250 mg BSAを50 mlの滅菌PBS に溶解し、200 mlの0.5M EDTA pH 8.0および500 mlの2%NaN3、0.2 mmフィルターを通して滅菌フィルターを加えます。
生理食塩水(0.9%NaCl)9 gのNaClを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ
0.2%NaCl溶液2 gを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ
1.6%NaCl溶液16 gのNaClを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ
2%アジ1gを50 mlの滅菌ddwに溶解し、4oC.で保存します。
3%チオグリコール酸溶液                                      3 gのチオグリコール酸粉末を100 mlddwに溶解します。                                      溶液が黄色になり、オートクレーブになるまで煮沸します。
トリパンブルー溶液(0.4%)シグマT8154PBSで1:10に希釈して、0.04%溶液を得ます。
トリプシン溶液B Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-046-1滅菌済み
1 mg/ml Zymosan AEppendorf チューブ内の 1 ml 滅菌 PBS 中に 1 mg の Zymosan A を再懸濁します。激しくボルテックスし、チューブを37oCで30分間インキュベートします。オートクレーブはしないでください。使用前に溶液を新たに調製してください。
EasySep PEセレクションキットSTEMCELL Technologies18557
EasySep PEセレクションカクテル STEMCELL Technologies18151
EasySep磁性ナノ粒子 STEMCELL Technologies18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead KitMiltenyi Biotec130-092-332
EasySep マウス好中球濃縮キットSTEMCELL Technologies19762
EasySep ヒト好中球濃縮キットSTEMCELL Technologies19257
FITC BrdU フローキットBD Pharmingen 
MACS 好中球単離キットMiltenyi Biotec130-097-658
食作用アッセイキット ケイマン・ケミカル・カンパニー 500290
抗体
FcR ブロッキング抗体 Biolegend101302
精製ラット抗Ly6G抗体 BDファーミンゲン 551459クローン1A8
PE標識ラット抗マウスLy6G抗体 Biolegend127608Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6GBD Pharmingen 551460クローン 1A8
PerCP-Cy5.5 ラット抗マウス Ly6G TONBO Biosciences65-1276クローン 1A8
バイオレットフルーア 450-標識ラット抗マウス Ly6G TONBO Biosciences75-1276クローン 1A8
FITC 標識ラット 抗マウス CD11bBD Pharmingen 553310クローン M1/70
FITC 標識ラット抗マウス Ly-6G および Ly-6C (GR-1)BD Pharmingen 553127クローンRB6-8C5
PE標識ラット抗マウスCD45BD Pharmingen 553081クローン30-F11
FITC標識ラット抗マウスF4/80 アブカムab60343クローン BM8
FITC 標識マウス 抗ヒト CD66b Biolegend305103Clone G10F5
精製ラットアイソタイプコントロール抗体 (IgG2a, k) BDファーミンゲン 553927クローンR35-95
葉精製アルメニアハムスター抗マウスCD3e抗体BioLegend100314クローン145-2C11
滅菌中の5 mM に20mg/ml ヘ入り5x PBS を含むPBS 化ナトリウムをキット559619

参考文献

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