脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測エクスビボ

サマリー

この研究では、詳細な光顕微鏡技術が、CPEC in vivoの運動のリアルタイム観察と分析のために最適化され、超微細構造分析のための電子顕微鏡的手法が最適化されました。

要約

脈絡叢は脳の心室壁に位置しており、その主な機能は脳脊髄液の生成であると考えられています。脈絡叢組織の表面を覆う脈絡叢上皮細胞(CPEC)は、複数のユニークな繊毛を保有していますが、これらの繊毛の機能のほとんどはまだ調査されていません。CPEC繊毛の機能を特にその運動性に関連して明らかにするために、胚期、周産期、および出生後の期間における毛様体運動性を監視するためのex vivo観察システムが開発されました。脈絡叢を脳室から解剖し、微分干渉コントラスト光学系を備えたビデオ増強造影顕微鏡で観察しました。この条件下で、CPEC繊毛の運動プロファイルをex vivoで数時間分析するための簡単で定量的な方法が開発されました。次に、発生過程における繊毛の形態学的変化を走査型電子顕微鏡で観察し、繊毛の形態学的成熟度と運動性との関係を解明した。興味深いことに、この方法は繊毛の数と長さの変化を描写することができ、繊毛は出生後日(P)2でピークに達し、拍動頻度はP10で最大に達し、続いてP14で突然停止しました。これらの技術により、様々な組織における繊毛の機能を解明することが可能となります。関連する技術は以前のレポート¹で発表されていますが、現在の研究では、CPEC繊毛ex vivoの運動性と形態を観察するための詳細な技術に焦点を当てています。

概要

繊毛は、ほとんどの脊椎動物細胞の表面に見られる髪の毛のような突起であり、繊毛症^2-4と呼ばれる疾患のクラスのために医学研究者の注目を集めています。オルガネラの遍在性発現にもかかわらず、運動性やバイオセンシングなど、さまざまな毛様体機能が報告されています。例えば、粘膜上皮表面上の運動性繊毛は、粘液⁵および上皮破片を管の出口に輸送し、それにより上皮の表面をきれいにすることによって疾患を予防する。また、発生初期や胚期には、繊毛は^幹細胞の増殖を制御し6、脊^{椎動物の体の}左右非対称性の決定に関与している7。

脈絡叢上皮細胞(CPEC)は、脳内の脈絡叢組織の表面を覆う神経上皮細胞の派生物であり、脳脊髄液(CSF)の産生によって頭蓋内環境の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしています。CPECは、繊毛⁸に特異的に集中するGタンパク質共役受容体を介してCSFの産生を調節する複数の非運動性繊毛を有することが以前に実証されています8。これらの繊毛は休止性の非運動性繊毛と考えられていたが、一部のCPEC繊毛は新生児期に一過性の運動性を示すことが発見され^た1。この発見は、いわゆる非運動性繊毛が発達の初めから必ずしも不動であるとは限らず、おそらく特定の生理学的要求と機能に応答して、特定の時間枠で一過性の運動性を示す可能性があることを明らかにしたため、非常に重要でした⁹。CPEC繊毛の運動性を精密に記述するためには、CPEC繊毛特有の速度論的プロファイルの解析を包含するex vivo観察系を開発する必要がある。

運動性に関しては、気管上皮^5,10、運動性単一細胞べん毛¹¹、いわゆる従来の運動繊毛¹²、およびリンパ節繊毛¹³の運動繊毛の観察に関するいくつかの技術報告が記述されていますが、脈絡叢のような比較的起伏のある構造に適用可能な詳細な分析方法は、これまで十分に文書化されていません。また、高価な高速度カメラが不可欠となるCPECの毛様体運動を解析するためには、高い時間分解能が求められます。この必要性を回避し、種々の細胞型の毛様体運動性のモニタリングを簡素化するために、低コストの高速度カメラが導入され、運動性繊毛の運動性を記録するための、特に各繊毛の運動速度および運動パターンを記述するための、容易にアクセス可能で便利な方法が開発された¹。また、ここでは独自の画像解析ソフトウェア「TI Workbench」を使用し、詳細な運動解析を行っています。全体として、この方法は、相関走査型電子顕微鏡(SEM)とともに繊毛運動を分析するための新しい簡潔な戦略を提供し、これは幅広い繊毛研究に採用できます。

プロトコル

プロトコルおよび実験動物の使用は、山梨と早稲田大学大学の制度的動物のケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。

1. CPEC準備

1. 次の装置と材料を準備します。実体顕微鏡下から照明を送信できることが好ましいです。時計屋のピンセット（デュモン＃3または＃4）、火炎滅菌し、ストレート操作はさみ、火炎滅菌。 20ミリリットルの氷冷リーボビッツL-15培地を含む2の滅菌10cmのプラスチック皿; 2ミリリットルRTリーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュ。 70％エタノールを含有する100mLのビーカー。新生児仔マウス。
2. 簡単に言えば、70％エタノールで新生児マウスを浸すとオペレーティングはさみを使用して断頭により迅速に安楽死させます。
3. 滅菌10cmのディで氷冷リーボビッツL-15培地中ですぐに頭を置きSH。
4. 脳を露出するために頭蓋骨を開いてカットし、時計屋のピンセットを使用して、頭蓋冠から肌を削除し、全脳を分離するために脳神経をカット。
5. 氷冷リーボビッツL-15培地を含む新しい皿に脳を転送し、脳が完全に媒体に浸漬されることを確認して、実体顕微鏡下で観察します。
6. 上向きに脳の背側面を設定し、嗅球（右利きの人のために）3時の位置に存在するように脳を向けます。左手にピンセットで軽く脳を持ちます。
7. 細かい解剖鉗子（デュモン＃3または＃4）右手にを使用して、大脳の縦裂に沿って、大脳半球をつなぐ脳梁と実質の下をカット。
8. 静かに側面への大脳半球を押して横断脳亀裂を公開します。
9. 目をつまんで半球を分離半球と視床間の電子の実質。
10. ゆっくりラミナaffixaによって海馬の側面に取り付けられている横心室脈絡叢を引き出します。
11. 新鮮リーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュに分離された脈絡叢を移し、重量（材料リスト）静かな場所に組織を保持するためにオーバーレイ。

CPEC繊毛の2ライブイメージング

1. 適切な紫外線（UV）と推論（IR）を確認して400nmから700nmのより長いより短い光を遮断するフィルタを切断し、その中性濃度（ND）フィルタ（25％および6％）を光路に挿入されています倒立顕微鏡の。
2. おおよその目で、対物レンズの焦点を調整し、中心となるよう冷却器を調整し、ケーラー照明に適合するように焦点を当てています。李に適切な微分干渉コントラスト（DIC）プリズム、DICの要素だけでなく、分析器と偏光子の要素を挿入しますDIC光学系に適合するGHTパス。
3. 組織表面の構造が最も認識可能であるように、DICプリズム位置によってビューのコントラストを調整します。標的細胞の全ての繊毛運動がある場合は、運動性繊毛のクリアな視界は、その動きを目では得られません。
4. ビデオカメラに光路を変更し、光パワーを増大させるためにNDフィルタを削除します。
5. ビューとフォーカスのフィールドを調整するフォーカスモードでカメラを使用してください。ビデオ画像をモニタにリアルタイムで表示される、フォーカスの際、運動性繊毛のクリアな視界は使用できません。
6. 所望の期間（数秒から数分）、0.1ミリ秒の露光時間で200 Hzでカメラを使用してください。画像スタックを取得した後、単一のフレームが明確な繊毛構造が表示されます。繊毛エッジがぼやけている場合は、フレームレートを増加させるか、より短い露光時間を使用します。
7. リーボビッツに安楽死の後、25〜60分以内にCPECの繊毛の動きを記録L-15培地。

毛様体運動の3分析

1. 手動でコンピュータのモニタ上の各繊毛のパターンを破って追跡します。各繊毛の軌跡については、組み立てられて、マウスポインタ、各フレーム内のマーク繊毛先端位置。いずれかのさらなる分析のために他のより一般的なアプリケーションに同じソフトウェアまたはエクスポートを使用して軌跡情報を分析。この分析工程の効率を議論に記載されています。
2. 目で、前後または回転、運動の二つのモードに軌道を分類します。
3. 以下の式を使用して繊毛拍動周波数（CBF）を計算する：[CBF =（秒あたりのフレーム数）/（シングルビート用フレームの平均数）]繊毛先端動作図から得ることができる^14（ 図3 ）。同じセル上の他の繊毛は、各ciliuの動きを妨げる可能性があるため、複数の繊毛運動サイクルのため、この計算を繰り返しますM、凹凸が生じます。
4. 単一セル内の軸を破って、毛様体の角度均一性を分析するために、各軌道のための鼓動角度θ（ 図4）を定義します。前後の軌道は、直線に繊毛の先端の位置に合わせて、ラインがx軸となす角度としてθを定義します。回転軌跡は、楕円に位置に合わせて、楕円の長軸がx軸となす角度としてθを定義します。フィッティングの詳細は代表的な結果のセクションに記載されています。
5. 各軌道の定量的な説明については、一般的なアスペクト比ARを計算します。簡単に言うと、によって軌道を回転させる- θとXに沿っ分布の幅の比率としてARを定義-とy -axes（ 図4B）。詳細は代表的な結果のセクションに示した、と解釈されています、重要性、およびパラメータの制限が議論に記載されています。

SEM 4.サンプル調製

注：SEMは総合的にCPECsに繊毛の状態を評価するための重要な方法です。 SEM用の試料を調製するために、標準的な手順は、以前に^15がわずかな修正で採用されていると報告しました。

1. 脳から組織を切開する前に、ポリエチレンキャップを5mLのガラスバイアル中で固定液を準備します。固定液を2％パラホルムアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液、pH 7.4中の2.5％グルタルアルデヒド（半Karnovskyの溶液^16）からなります。
2. ステップ1で説明したように、脳からの組織を解剖。
3. 簡単に言えば、新しい皿中ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で単離された組織をリンスした後、室温で1時間ガラスバイアルに固定液で組織を固定します。使い捨て転送ピペットを使用し、試験片GEを扱いますntly。 HBSSで洗浄した後、組織がべたつきます。
   1. 固定液に検体を転送するには、ゆっくりと滴としてトランスファーピペットからの組織を含む少量の溶液を排出し、固定液に加えます。
4. 固定後、固定液を廃棄し、リン酸緩衝液で3回組織をすすぎます。
5. 残りのアルデヒド類を洗浄するために、10％ショ糖溶液の組織を浸します。アルデヒドの完全な除去を確実にするために、新鮮な10％​​のスクロースを二回繰り返した後、10分間、溶液中に試料を浸漬し、。このステップは、後の工程で、適切後固定を達成することが重要です。
6. 30分間、リン酸緩衝液中の1％四酸化オスミウムの溶液に組織を浸漬した後、ポスト固定氷上に置きます。サンプル色によってオスミウム酸染色法の程度を判断する：アルデヒドが完全に除去されている場合、サンプルは黒です。
7. ダブルdistilleで広範囲に後固定した組織試料を洗浄Dの水で数回。
8. エタノールの濃度を段階的に浸漬することによって試料を脱水、通常、65％、75％、85％、95％、99％、100％、10分それぞれについて。新しく購入したボトルから99.5％エタノールにモレキュラーシーブを配置することによって無水エタノールを得ます。無水エタノールで3回脱水を繰り返します。
9. 10分間、酢酸イソアミル、臨界点乾燥の置換試薬に脱水サンプルを置きます。二回、この手順を繰り返します。この試薬は迅速に蒸発し、試料が表面張力によって破壊をもたらす、ドライになることができます。したがって、試料を完全に乾燥させません。
10. 酢酸イソアミルの最終交換の後、直ちにアルミホイルで開放ガラスバイアルをラップし、ドライアイス上にバイアルを置き、大部分の溶媒を除去します。液体二酸化炭素は、臨界点乾燥機にバイアル内に容易に流れるように、針や細かい鉗子を使用して、バイアルの口を覆うホイルにいくつかの穴を作ります。次のステップに進んでください可能な限り迅速に。
11. この工程では、乾燥機のチャンバー内に酢酸イソアミルのキャリーオーバーを最小限に抑えるが、サンプルが完全に臨界点乾燥の前に乾燥させてください。また、バイアルに霜の形成を回避するために、不必要に長い時間のために、ドライアイス上のサンプルを放置しないでください。
12. 組織に含まれる水分を除去しながら、組織の表面構造は無傷のまま確実に臨界点乾燥機に組織サンプルを含むアルミホイルにくるまれたガラスバイアルを転送します。臨界点乾燥機を動作に関する詳細情報は、製造業者の説明書から得ることができます。
13. 慎重に機械的損傷を最小限にするためにつまようじを使用してサンプルを処理します。得られた乾燥組織サンプルが壊れやすいです。イオンスパッタを用いて、金 - パラジウムの金属スタブとコート上のサンプルをマウントします。

SEMによる観察5.

1. SEMで観察し、デジタルカメラで画像を記録走査型電子顕微鏡に搭載しました。
2. 分析のためにPCにデジタル画像データを転送します。

結果

ワークフローの概要は、装置の画像を含む、 図1に示されています。

CPECsのライブの動きの観察

映画1は、周産期のマウスから単離したCPECsの映画を示しており、 ムービー2ムービー1の画像の拡大図を示している。それは、個々の繊毛の先端は映画のものと比較して、静止画ではあまり明確であることに留意すべきである。2に示す。図ビデオ1及び2に示されたデータからの移動の異なるモードを有する2つの繊毛の動きの追跡、往復回転運動、 図3は、位相差、繊毛の軌跡の単純な分析を示します二つの座標に回転運動で明らかです。

CPEC繊毛の先端の軌跡の分析

デ定量的に、各軌道を分析する方法...

ディスカッション

この方法の展望

ここに記載された技術は、以前に公開された方法よりも繊毛のより詳細な分析を提供していませんが、この技術の重要性は、簡単に繊毛運動ex vivoでのあらゆる種類のスクリーニングに適用することができるシステムと費用対効果のシンプルさにあります。具体的には、TI Workbenchは、より簡単に繊毛運動を観察し、分析する研究者を可能にシンプルでユーザーフレンドリーなインターフェイスを提供します。効果的な自動化された追跡方法は、ビデオ増強コントラストDICにおける非染色繊毛のような低コントラスト対象のために開発されていません。繊毛の動きを追跡する方法は、この技術の手動であるが、繊毛運動追跡分析における努力の量を最適に画像解析のための汎用ソフトウェアパッケージを使用して比較して低減されます。

サンプル解剖

Eを調製するためにXインビボCPECサンプル、迅速かつ穏やかな操作は、繊毛ex vivoでの運動性を保証する、組...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
必要な試薬
生細胞イメージング用
>ethanol	和光化学	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
SEM調製用
>ethanol	和光化学	057-00456
ハンクの平衡塩溶液	ライフテクノロジー	ズ 14170112
パラホルムアルデヒド	メルク	1040051000
グルタルアルデヒド	ナカライテスク	17003-05
イソアミルアセテート	ナカライテスク	02710-95
モレキュラーシーブ4A 1/8	和光ケミカルズ	130-08655	無水エタ
ノールリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
緩衝液、0.1 M			100 mlを作るには、19.0 mlの0.1 M NaH2PO4および81.0mlの0.1 M Na2HPO4
リン酸一ナトリウム(二水和物)	ナカライテスク	31718-15
リン酸二ナトリウム(無水物)	ナカライテスク	31801-05
suclose	ナカライテスク	30406-25
酸化オスミウム	清EM300
ドライアイス
[header]
解剖用のツールと材料
ライブイメージングとSEM準備の両方
stereo顕微鏡	オリンパス	SZX7
フラットペーパータオル
Φ10cmプラスチック皿
100mlビーカー
直操作ハサミ三	尚	S-2B
時計機鉗子	デュモン	No.DU-3または-4、INOX
生細胞イメージング用
ガラス底皿	松波ガラス	D110300
SEM調製用
>アルミホイル
ポリエチレンキャップ付き5mlガラスバイアル	日電リカガラス	PS-5A
トランスファーピペット	Samco Scientific	SM251-1S	トランスファー
つまようじ
金パラジウム	日立	E-1030
臨界点乾燥機	日立	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W 水銀塊ハウジングと電源	オリンパス	U-ULHおよびBH2-RFL-T3
100 W水銀ランプ	ウシオ	USH103D
DICコンデンサー、n.a. 0.55	オリンパス	IX-LWUCD
電動シャッター	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24およびVMM-D1	手動シャッターが使用できます。
バンドパスフィルタ(400-700 nm、&ファイ;45 mm)	甲信化学	C10-110621-1
NDフィルター (Φ45 mm)	オリンパス	45ND6、25	%と6%のNDフィルターの
リンパス	UApo 40XW / 340、NA、IX-DPAO40		物レンズ(水浸)
			。200Hzのフレームレートと1ミリ秒の露光時間
取得/解析ソフトウェア	TI	ワークベンチ	、高フレームレートで取得することができます。
カメラ制御/分析用PC	Apple	Mac Pro
防振テーブル	名立精機	AD0806
ティッシュ用ウェイト	ワーナーインスツルメンツ	スライスアンカーキット	U字型に接着されたナイロンメッシュで作ることができます 押しつぶされた &0.5;>mmプラチナワイヤー。
カバーガラス(ティッシュの代替ウェイト)	松波	オーダー	のカバーガラスは、ティッシュペーパーの重りとしてお使いいただけます。
SEM<用/strong
>倒立顕微鏡	オリンパス	IX81
走査型電子顕微鏡	JEOL	JSM-6510