げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

脳内の情報の符号化と保存は、神経科学において依然として最も重要で、熱心に追求されている課題です。長年にわたり、長期増強(LTP)と長期うつ病(LTD)は、記憶^1,2の主要な細胞相関として浮上してきました。これらの活動依存的な変化は、入力特異性と結合性を示し、ニューロンネットワーク^1,3,4の記憶トレースの安定化をもたらす。シナプス可塑性の2つの形態の維持には、可塑性関連製品(PRP)の合成が必要です^5-10。新たに合成されたタンパク質と、LTPまたはLTDを発現する特定の活性化シナプスとの相互作用のみを含むシナプスの特異性は、記憶にとって重要です。この特異性は、PRPが最近活性化された「タグ付き」シナプス^11,12と相互作用する'Synaptic Tagging and Capture'(STC)の概念によって説明される。STCプロセスは、細胞レベルでの記憶の連想特性のフレームワークを提供します。それは、短期的な可塑性の形態が、結合的かつ時間依存的な方法で、どのように長期的な形態の可塑性に変換されるかという概念的基礎を我々に与えてくれる¹³。

STCのプロセス中に、一つの入力における強い破傷的変化がタンパク質合成依存性の後期LTPへと導かれる結果となり、その結果、同じニューロン集団への別の独立した入力で誘導されたタンパク質合成非依存の早期LTPが持続的なものへと強化されます¹³。一過性の神経活動による局所シナプスタグの設定と、強い神経活動による拡散性PRPの合成は、STC^13,14の2つの重要なイベントです。最近増強された「タグ付き」シナプスによるPRPの捕捉は、長期的な増強の維持の基本です。STC現象^15-17の存在を確認し、候補の「タグ」¹⁸および「PRPs」¹⁹を特定するために、多くの研究が行われてきた。カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)および細胞外シグナル調節キナーゼ1/2(ERK1/2);CaMKIV、プロテインキナーゼM(PKM)、脳由来神経栄養因子(BDNF)は、それぞれ「タグ」および「PRP」の候補分子の一部です^19-21。シナプスタグ付けモデルはさらに拡張され、LTPとLTDの間の正の連想相互作用、つまり「シナプスクロスタグ」²²が含まれるようになりました。シナプスクロスタグでは、一方のシナプス入力における後期LTP/LTDは、独立したインプットにおける反対のタンパク質合成非依存性早期LTD/LTPをその長期持続型に、またはその逆に変換する²²。

海馬スライス調製は、長期シナプス可塑性の研究において最も広く使用されているモデルです^23,24。シナプスタグ付けとクロスタグの概念に関する理解の多くは、海馬のCA1領域で行われた研究から生じており、技術的な複雑さのために、多くの研究室はまだこれらのプロセスを研究することができません。ラット海馬スライスの調製および安定した後期LTP/LTDの長時間の記録のための実験条件は、シナプスタグ付け/クロスタグを研究するために極めて重要である^23,25,26。この記事では、ラットの急性海馬スライスからの安定した長期電界電位記録を使用して、CA1錐体ニューロンのSTCやクロスタギングなどの長期可塑性プロセスを研究するための詳細な実験手順について説明します。

すべての動物の手順は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

人工脳脊髄液の1.準備（ACSF）

1. 、124のNaCl、3.7塩化カリウム（MM）でのMgSO _{4・7H 2} O 1.0、2.5のCaCl _{2・2H 2} OからなるACSF、1.2 KH ₂ PO _4、24.6のNaHCO _3、および10 D-グルコースを準備します。解剖、スライス標本と電気生理学的記録の間の灌流のための両方のために、このACSF _95％O 2および5％CO _2混合物 （カーボゲン^）。21を使用した、飽和に泡立てたときにACSFのpHは7.2から7.4の間であることを確認してください。
   注：ACSFを測定し、保持するためのクリーンな装置を使用してください。汚れた装置を使用して、濁った溶液又は沈殿物の形成をもたらすことができます。すべての準備のために脱イオン水を使用してください。
2. NaHCO ₃を除いた2リットルの10倍のACSFの株式を準備し 、MgSO 4・7H ₂ 0（4.92グラム）、塩化カルシウム_{2・2H 2 O（7.56}グラム）、KH ₂ PO _4（3.28：次の順序で脱イオン水に試薬を追加2 Lの容積にグラム）とトップアップは、すべての試薬が溶解していることを確認するために、磁気撹拌機を用いて少なくとも30分間連続して攪拌します。 ^4°Cの中で株式を保存し、2週間以内に使用します。
3. 解剖や実験に先立ち_、NaHCO 3およびD-グルコースの必要量を加えて一緒にメスフラスコにACSFの株式を希釈します。 1 L溶液は、2.07グラムのNaHCO ₃および1.802グラムのD-グルコースを添加した後、1Lに株式の100ミリリットルを希釈。 ACSFは、沈殿物や未溶解粒子を含まない透明な溶液にする必要があります。
4. クール200〜300 mlの氷のACSFの、解剖時に使用されます。解剖のために使用ACSFは2-4℃の間であることを確認してください。 electropの残りのACSFを使用しますhysiological実験。バブルすべてACSF溶液を連続的にカルボゲン（5％CO _{2、95％O 2）}で飽和します。 ACSFを冷却するために待っている間、解剖領域とスライス室を準備します。

インターフェイス商工会議所の調製

注：スライスをインキュベートし、電気生理学的記録（ 図2B）の間にそれらを維持するために使用されるインターフェース脳切片室は、2つの区画で構成されています。下部チャンバは、温度制御装置により32℃に維持した水を蒸留し、連続的にカルボゲンを通気含ま。

1. 温度コントローラに切り替え、32℃で、それをプリセット。流入管を通して蒸留水を実行して、10〜15分間、上部チャンバーを洗浄します。上室は、ネットを配置する前にクリーンであることを確認してください。下部チャンバー内の水位が蒸留水で満たされた約70％であることを確認してください。
2. 置きスライス（ 図2C）のための休息面を提供するために、上部チャンバーの純。ソリューションレベルは十分にネットの全領域を湿潤されることを保証するために流出チューブを調整します。上部チャンバー内の加湿カルボゲン雰囲気を維持するためにネット上に蓋を置きます。
3. 1ml /分の流量を調整します。スライスのインキュベーション期間および実験を通して、この流量を維持します。新たに調製した1×ACSFをcarbogenating起動し、ACSFに流入チューブを浸します。 ACSFのための20分は、カルボゲンで、それに充填する上部チャンバーのために飽和させることができるようにします。

急性海馬スライスの調製

注：解剖プロトコルは冷たいACSFに動物由来の脳の（1）の取り外しと（2）の単離および海馬のスライスで構成されています。ニューロンは、生存したままで分離し、すぐに冷たいACSFで脳を配置し、全体を完了するために、3-5分以内にスライスを含むプロセス。

1. 風邪ACSFに脳の除去
   1. 図1（a）に示すようにして解剖ツールをレイアウト。解剖プロセスを促進するための使用のために応じてツールを配置します。開始する前に、すべての解剖ツールは準備ができていることを確認します。
   2. しっかりと固定し、カッティングエッジが均一に整列されていることを確認し、手動組織チョッパー（ 図1B）に、酢酸エチル、無水エタノール及び蒸留水で洗浄カミソリの刃を、マウントします。テストブレードがしっかりと固定されていることを保証するために、フィルター紙を細断。その開始位置にスライドバーニアマイクロメータを設定します。
   3. 誘導室中の二酸化炭素（CO _2）を用いて動物を安楽死させると、包帯はさみやギロチンで首を切ります。アイリスのはさみを使用して、頭蓋骨上の皮膚や被毛を削除します。 brainstem.Makeに目に沿って小さな切開を除去するために、後部を切断してください頭蓋骨の右側と左側に長い切開を電子。
      注意！それの損傷を防ぐために、実験のために使用された側にのみ小さな切開を行います。はさみを挿入する場合、適用される力は、脳への損傷を避けるために上向きであることを確認してください。
   4. 慎重に皮質を明らかにするために頭蓋骨の右側に左から骨鉗子骨と頭蓋骨を削除します。硬膜の薄い層は、見ることができます。慎重に骨鉗子と正面プレートを取り外します。正面プレートと一緒に硬膜の大部分を削除します。
      注意！硬膜は脳組織をスライスしないように注意してください。
   5. 特にへらの平坦な端部と皮質と小脳の間の接合部に、もしあれば、残りの硬膜を削除します。ステップ3.1.5と3.1.6の場合は、それを損傷しないように離れて脳から、上向きすなわち圧力を維持します。へらを使用して、静かに冷たいで満たされたペトリ皿に脳をスクープし、ACSF（2-4°C）をcarbogenated、ナンプラーアルミ冷却ブロック上をced。
2. 海馬の単離
   1. メスを用いて、脳（約1/4）の前方部分を削除するには、小脳、別のカットを削除するには、ストレートカットを行います。正中線に沿って浅いカットを行います。
   2. 慎重に背側海馬を明らかに正中線から開始し、鎌スケーラーと皮質を除去します。海馬上記の皮質の層を削除します。脳をサポートするために、指や角度のついたピンセットを使用してください。海馬交連に小さなカットを行います。なだらかな動きを使用して、背側海馬から始まる鎌スケーラーで海馬を削除します。
      注意！ストレッチや海馬を引き裂く避けるために穏やかなこと。
   3. 鎌スケーラーで分離された海馬の周りの任意の皮質および結合組織を除去します。
3. 海馬組織をスライスし、インターフェースチャンバー上にスライスを転送します
   1. ACSF-の作品を配置します手動スライサーのスライスステージ上浸したろ紙（グレード1、30ミリメートル）。スクープとろ紙上に海馬組織を配置します。海馬は采に約70 ^Oの角度でスライスされるように、スライサーの刃との関係で適切な方向で海馬を整列させるためにろ紙を移動します。
   2. 少し湿った海馬を残して折り畳まれたろ紙（グレード1、85ミリメートル）と海馬組織を囲む余分な溶液を吸い取ります。横方向に海馬スライス開始します。スライスとスライス形態は明らかではない海馬の先端から組織を捨てること。
   3. 厚さ400μmのスライスに残りの組織をスライス。穏やかなスワイプの動きを用いたソフト剛毛ブラシでブレードから優しく海馬スライスをピックアップし、冷たいcarbogenated ACSFで満たされた小さなビーカーにスライスを配置します。手順を実行し3.3.1-3.3.3、可能な限り迅速に海馬組織が空気に露出しているため。
      注意：一般的に海馬の3分の2がスライスされて、明確な形態​​を有する4~6切片を調製することができます。
   4. （先端2〜3センチ離れて切断することによって作られた）幅広い先端で清潔なプラス​​チック製パスツールピペットを用いて、スライス室で静かにネット上にスライスを転送します。慎重に曲がった先端で小さな注射器を使用してネット上のスライスの位置を調整します。電極の位置と記録を容易にするようにスライスを配置します。スライスが十分にACSFに囲まれているが、水没または浮動（ 図2C-D）されていないことを確認します。チャンバーをカバーし、2〜3時間のスライスをインキュベートします。
      注：健康スライスにおける錐体細胞層は、いくつかの透明性を示すべきです。

4.録音CA3-CA1シナプスの応答

注：フィールドの潜在的な記録のために使用される電気のセットアップは 、図2Aに示されています。ファーラ電気的干渉は、電気の設定を適切に接地した後に制御を超えている場合はその日のケージを強くお勧めします。沈め、インターフェース室の多くの異なる種類が市販されています。しかし、インターフェース室は、その中のスライスを呈する、より堅牢なシナプス応答として好ましいです。

1. 電極の位置決め
   1. 使用する電気機器（刺激剤およびア​​ンプ）の電源を入れます。マウントとマイクロマニピュレーターのプレキシガラスホルダーに刺激と記録電極を固定します。
      注：我々は両方の刺激と記録の目的のために5MΩ抵抗の単極、ラッカーでコーティングされた、ステンレス製の電極を使用しています。
   2. 使用前に、引っ張らガラスキャピラリーの内部でこれらの電極を挿入し、電極先端部（ 図2E）のほんの一部を露出するエポキシ接着剤で固定します。これは、そうでない場合は細い電極に強度を与え、しっかりとELEでそれらを確保するのに役立ちますctrodeホルダー。
   3. 顕微鏡下でガイド付き、フィールドEPSP（のfEPSP）応答を記録するために、シャファー側枝繊維とCA1の先端樹状領域での記録電極を刺激するためにCA1領域の放線層に刺激電極（複数可）を配置します。
      注：電極とスライス上記液面へのアプローチは、すぐにスライス（提供、アンプがスピーカに接続されている）の表面を見つけるのに役立ちますサウンドを提供します。
   4. シナプスタグおよび捕捉の実験では、実験の必要性に応じて、記録電極の両側に位置二、三刺激電極（S1、S2またはS3）は、2つ以上の独立したが、重複入力を刺激します。離れて200ミクロン程度の刺激と記録電極を配置します。
   5. 必要ならば、集合スパイク（ 図3A）を記録するための層の三角骨層内の他の記録電極を見つけ.When両方電極は適切なのfEPSP信号を確実にするために、テスト刺激を与え、取得ソフトウェアを使用して、スライスに触れています。
      注：我々はテスト刺激のための二相性、定電流パルス（インパルス持続時間0.1ミリ秒/半波）を使用します。
   6. 適切なのfEPSP信号が得られると、慎重に深いマニピュレータの微動ノブを使用して、200ミクロン程度の電極を下げます。スライスが回復するために20分を許可します。ペアのパルスの円滑プロトコル^27,28と経路独立性をテストします。
2. 入出力関係
   1. 現在の強度の範囲で傾斜値を測定することによって、入力ごとに入出力関係（のfEPSPのスロープ対求心性刺激）を決定します。 100μA〜20μAの間でこれを実行します。そして、最大のfEPSPの傾きの40％を取得するために、各入力のための刺激強度を設定します。実験を通じて、この一定に保ちます。
   2. 15〜20分後、ベースラインの記録を開始。 Fを監視この期間中に密接にEPSPスロープおよびスロープが設定値から10％以上変動し、新しいベースラインを起動した場合刺激強度をリセットします。録音先に進む前に、少なくとも30分または1時間安定したベースライン。
      注：テストまたはベースライン刺激のために、私たちは5分ごとに与えられた0.2 Hzの二相性、定電流パルスの4スイープ（極性あたり0.1ミリ秒）を使用します。これら四つの応答の平均勾配は、その後、1リピートとして考えられています。信号は、差動増幅器によってフィルタリングされ、増幅され、アナログ - デジタル変換器を用いてデジタル化し、カスタムメイドのソフトウェアを使用してオンラインでモニターしました。
3. LTP / LTDの誘導刺激プロトコルを使用して
   注：タンパク質合成の要件に基づいて、LTPとLTDの両方が早くも分類されていると後期LTP / LTD。その後半メンテナンスのため、後者が必要な翻訳および/ ​​または転写【レビュー^{4を参照してください} ]。電気刺激パラダイムの様々なspecificallことができますyは、LTPとLTDの異なる形式を誘発します。
   1. WTET：100ヘルツ、21二相性定電流パルス（相あたり0.2ミリ秒）。
   2. STET：1秒（100 Hz）で10分毎に（相あたり幅0.2ミリ秒パルス）のための100パルスの三つのバースト。
   3. 15分の期間にわたって900バースト。 1バーストは、50ミリ秒（20 Hz）との間間隔で3パルス（0.2ミリ幅）で構成されています。インターバースト間隔は1秒（パルス2700の総数）です。

スライス室と灌流システムの5.洗浄

1. 録音が終わった後、さらに生化学的解析のために海馬スライスを収集したり、他の適切に廃棄します。カーボゲンの電源電圧および温度コントローラの電源を切ります。蒸留水にカーボゲンバブラーを洗ってください。
2. ブラシと蒸留水で徹底的にネットを清掃してください。高い流量で蒸留水で15〜20分間リグを洗ってください。 3-4日に1回、蒸留水を変更また、下部チャンバの区画と真菌の増殖を避けるために、3％過酸化水素溶液で定期的にチャンバを洗浄。

記載された方法は、LTP / LTDなどのシナプスタグ付けおよび成体ラットの急性海馬スライスからのクロスキャプチャとしての連想相互作用の長期的なフォームを研究するために使用されている。23この技術は、両方のラット（Wistar系）を用いた実験のために有効であることが分かっていますマウスの様々な30,31を株。方法論は、最大8〜12時間の安定したLTP記録のために正常に使用されています。32

早期LTPの;（ 図3B、黒丸 S2）、それによって形質転換しそうでなければ減衰形（1入力（S1）の弱い強直誘発によって設定された「タグ」は、「PRPの「別の独立しているが、重複入力の強い強直誘発により誘導されるをキャプチャ長期的な1（ 図3B、白丸）にS1で-LTP）（WTETによって誘発される早期LTPの比較については20,33を参照してください ）。弱いによって捕獲のPRP強直誘発セットタグは必ずしもイキによって誘発される後期LTPから来る必要はなく、またSLFSによって誘発される後期株式会社によって提供することができます。 LTPとLTDとの間に正の連想このタイプの相互作用は、「クロスタグ付け/キャプチャ」と呼ばれています。 S1でWTET誘発性の早期LTPはS2でSLFSによって誘発される後期株式会社が提供するのPRP（ 図3C、黒丸）を捕捉することにより後期LTP（ 図3C、白丸）に強化されます。自身のベースラインと比較した場合に統計的に有意な増強またはくぼみは、両方の場合において、S1及びS2に維持された（ウィルコクソン検定、P <0.05）。

が発生するタグ-PRPの相互作用のために、2つのイベント（弱前強い/強い・ビフォア・弱）の時間的順序は、二つのイベント間の時間ウィンドウは30〜60の範囲内にある限り、重要ではありません分。それはでは、第3の独立しているが、重複シナプスを含めることが賢明だろう入れて、レコーディングの安定性を監視するために、ベースラインコントロールとして使用します。 LTP / LTDの早期及び後期のフォームを誘導するために使用される電気刺激プロトコルは、STCの実験で使用する前に、一貫性と信頼性のための単一入力の実験で検証する必要があります。また、これらの実験の成功は、スライスの品質に大きく依存しているため、プロトコルに記載スライス標本の方法論の重要性を強調したいと思います。

海馬の解剖に使用される図1（A）ツール：（a）は、包帯はさみ（b）のアイリスはさみ（C）骨骨鉗子（d）の薄いヘラ、ソフト（E）スカルペル番号11（F）鎌状スケーラー（G）シャーレやビーカーに合わせて-bristleペイントブラシ（H）プラスチックパスツールピペット（I）ろ紙（85ミリメートル）（J）ろ紙（30ミリメートル）（k）のガラスビーカー（L）アルミ冷却ブロック（m）をペトリ皿。（B）手動組織チョッパー。 （a）は、プラットフォーム（b）は、ブレードホルダー（C）バーニアマイクロメートル、解像度10ミクロンで腕を切断。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2電気生理学セットアップ（A）刺激剤からなるフィールドポテンシャルの記録のための（b）は、差動増幅器（c）は、アナログ-デジタル変換器（D）オシロスコープ（E）取得ソフトウェア（F）を有するコンピュータVibration-耐性テーブルトップ（G）> 4倍の倍率（H）インターフェイス脳スライスチャンバー（I）ACSFとカーボゲン供給のための潅流システム（J）温度コントローラ（k）は、照明源（L）電極ホルダーとマニピュレータと顕微鏡。 （B）インタフェース脳スライスガラスキャピラリーに封入されたインターフェースチャンバー内のチャンバー。（C）＆（D）海馬スライス。（E）ステンレス鋼電極 ​​。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3（A）フィールド電位記録用横断海馬スライスと電極位置の略図：この表現では、二つの刺激電極（S1及びS2）を刺激するためにCA1領域の放線状層中に配置された2つの独立したが、重複CA1錐体ニューロンへのシナプス入力。 2つの細胞外記録電極、頂端樹状コンパートメントからレコードフィールドEPSP（興奮シナプス後電位）に1と錐体細胞から体細胞集団のスパイクを記録するために別の体は、それぞれ放線層と層の三角骨に配置されています。 CA1-アンモン角領域1、CA3-アンモン角領域3、DG-歯状回、SC-シャファー側枝繊維、S1-刺激電極1、S2刺激電極2（B）弱いSTCを研究するための強力なパラダイムの前に：弱い強直誘発（WTET）は後期LTPを誘導するために30分でS2（黒丸）の強力な強直誘発（STET）に続く早期LTPを誘導するためのS1（白丸）に適用されます。 S1で初期LTPはタグ付けを示す後期LTPに強化され、クロスタグを研究するための強力なパラダイムの前に（N = 6）（C）弱相互作用をキャプチャします：早期LTPが続くS1（白丸）にWTETによって誘導されます30分後にSLFSを使用してS2の後半-LTDの誘導（黒丸）によります。 S1では、初期LTPは、クロスタグとキャプチャを示す6時間持続する後期LTPに変換された（n = 6）。シングル矢印は早期LTPを誘導するために適用される弱い強直誘発を表します。矢印のトリプレットを表します後期LTPを誘導するための強力な強直誘発。破線矢印はSLFSは後期LTDを誘導するための代表的なシナプスの入力に印加された時点を表します。エラーバーはSEMを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

このビデオの記事のためのオープンアクセスがCerebosパシフィック・リミテッドが主催しています。