ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法インビトロ感受性試験

Summary

ここでは、ブロス微量希釈参照法を用いて、臨床的に関連するグラム陽性菌のダルババンシン感受性を決定するためのプロトコルを提示します。

Abstract

抗菌剤感受性試験（AST）は、様々な細菌に対する抗菌剤のin vitro活性を評価するために行われます。最小阻止濃度（MIC）として表されるAST結果は、耐性の発達の抗菌剤の開発および監視のための研究及び抗菌療法の指導のための臨床設定において使用されています。ダルババンシンは、グラム陽性菌によって引き起こされる急性細菌性皮膚及び皮膚構造感染症の治療のための食品医薬品局（FDA）によって2014年5月に承認された半合成lipoglycopeptide抗菌剤です。現在の抗ブドウ球菌の治療法を超えるダルババンシンの利点は、週1回投与を可能にし、その長い半減期、です。ダルババンシンは、 黄色ブドウ球菌 （メチシリン感受性黄色ブドウ球菌 [MSSA]およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 [MRSA]の両方を含む）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に対する活性を有しますストレプトコッカス・anginosusグループ 、β溶血性連鎖球菌およびバンコマイシン感受性の腸球菌。他の最近のlipoglycopeptide剤と同様に、CLSIおよびISOブロス感受性試験法の最適化は、プラスチックへの薬剤の付着を軽減するためにストック溶液およびポリソルベート80（P80）を調製する溶媒としてジメチルスルホキシド（DMSO）の使用を含みます。臨床試験へとダルババンシンの初期開発時に先立ち、感受性試験は、P-80を使用して行い、MICの結果が​​2-4倍高いと同様に高いMICの結果は寒天希釈感受性法で得られた傾向にあっていませんでした。ダルババンシンは、2005年に初めてCLSIブロス微量の方法論テーブルに含まれており、DMSOとP-80の使用を明確にするため、2006年に改正されました。微量液体希釈ここに示されている（BMD）の手順では、ダルババンシンに固有であり、ステップ・バイ・ステップの詳細やFOCで、CLSIおよびISO方法によるものです重要なステップの私たちは、明確にするために追加されました。

Introduction

ダルババンシンは、グラム陽性菌¹によって引き起こされる急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の治療のために2014年5月にFDAにより承認された半合成lipoglycopeptideです。ビデオフォーマットでは、この方法を詳述の主な目的は、正確で再現性のダルババンシン感受性結果の検査と報告のための臨床検査室や研究科学者に明確な指針を提供することです。

商業的方法による抗菌剤のMICの決意を日常的に病原性細菌に対する薬剤のインビトロ活性の評価のための臨床検査室で行われます。 CLSIとISO ^2,3,4により推奨されるように、ここで説明する方法は、微量液体希釈法です。ディスク拡散および寒天希釈法（本書の発行時点で）商業感受性方法が現在利用可能ではないので、ダルババンシン現在Fが推奨されていませんまたはダルババンシン、参照ブロス希釈法は^、12,14利用できる現在のオプションです。この参照方法は、商業やFDAはインビトロ診断法をクリアされないように、患者のテストのために、この手順を使用し、米国での臨床検査室、実験室開発テスト（LDT）のための規制要件を遵守しなければなりません。これは、ダルババンシンの使用が増加するにつれて、より多くの研究室は、この化合物をテストする必要があろうことが予想されます。 Sのダルババンシン感受性の決意の代理としてバンコマイシンのテスト黄色ブドウ球菌^は 5確認されています。しかし、ダルババンシンは、バンコマイシン中間S.に対して活性であり黄色ブドウ球菌 （VISA）、したがって、臨床医は、ダルババンシンのMICの結果を要求することができます。加えて、他の細菌種に対するMIC結果を要求することができます。

S.に対するダルババンシンのためのFDAの影響を受けやすいのブレークポイント黄色ブドウ球菌は ≤0.12/ mlの時に確立されています。 FDAの割り当てのみsusceptiなぜなら耐性分離株に関するデータの欠如のBLEカテゴリ。野生型S.間の通常のMIC分布黄色ブドウ球菌は 0.06μgの/ mlの明確なモーダルMICと、0.03から0.12μgの/ mlの間で分離します。方法の違いにMICの結果に若干のばらつきは、±1希釈の固有のBMD変化に加えて、潜在的に感受性率に大きな影響を与える可能性があります。他のlipoglycopeptideの薬剤と同様に^{図6に示すように、}ダルババンシンの感受性試験は、結果として挑戦することができます溶解性および^7,8,9分子およびその結合特性の比較的大きな。本明細書に記載の参照BMD法は、不溶性剤および/またはlipoglycopeptideエージェントに固有の2つの特定の工程を含む：（1）最終MICパネルでストック溶液の製造及び0.002％P-80の（2）追加のためのDMSOの使用希釈液。このビデオ公開の目的は、ダルババンシンBMD方法と書または仕様書に明確さを提供することですLLY、正確で再現性のMICの結果を保証するために、これらの重要なステップに焦点を当てています。

Protocol

注：抗菌薬感受性^2、3、4のための基準ブロス微量希釈法の完全な詳細についてはCLSI文書M7-A10とM100-S25および/ ​​またはISO / FDIS 20776から1を参照してください参照方法はいくつかのオプションが可能になります。同じ最終結果を達成するために、接種材料の調製およびMICパネルの生産に固有の手順。ここで具体的な方法は、一つの抗菌剤、ダルババンシンに関し、ステップの一部は、参照手順を行うことができ、潜在的にいくつかの方法のいずれかを表します。適切な安全措置（バイオセーフティーレベル2と一致して^）10を利用すべきです。このビデオ公開の目的のために使用されるMICパネルのフォーマットを表1に示します。

1.ストアダルババンシンパウダー

1. 診断グレードのダルババンシン粉末を受信すると、非解凍冷凍庫で乾燥環境で-20 ^{O Cで}保存します。使用前に、粉末が平衡にすべきです開口部の前に室温に達します。

2. MICパネル希釈液を調製します

1. 滅菌ガラスやプラスチックチューブできちんと（純粋）DMSO中のダルババンシンの1,600μgの/ mlのより高くないストック溶液を調製し^、-60の C以下での将来の使用のために-20℃での準備や店舗の同じ日に使用します非解凍冷凍庫。粉末を計量する際に粉末に付属の資料に提供されるように考慮ダルババンシンの効力を取り、（例えば、800μgの/ mlのストックを調製するため、式1参照）。
2. 滅菌ガラスやプラスチックチューブできちんとしたDMSOを表2に列1（「源濃度」）に示されるように方式と同様の株式希薄化を希釈します。第1のチューブに最初のダルババンシンの株式を追加するための希釈剤および他のピペットを測定するための1つのピペットを使用してください。後続の各ダルババンシンのストック濃度の場合は、新しいピペットを使用しています。
3. 100X最終MICパネルコンセントを準備きちんとしたDMSOで配給希釈液（中間濃度）。 表2の列2-4に示されているように、（使用されるボリュームがなされるべきMICパネルの数に依存する）、所望の中間体の濃度を達成するために、ソースおよびDMSOの適切な量を組み合わせます。
4. 0.004パーセントのP80を準備：4.9ミリリットルのdH ₂ Oに0.1ミリリットルのP80を追加することで、2％のP80の新鮮な作業用ストック溶液を調製します準備の同じ日に0.22ミクロンフィルターと使用可能な溶液を通過させることにより滅菌します。 （CAMHBの149.7ミリリットルに例えば2％のP80の0.3ミリリットル）の2％P80の1：500希釈を行うことで、0.004パーセントのP80の希釈液を準備します。
5. さらなるステップ2.2 1で調製した中間濃度希釈：カチオン100は、（連鎖球菌用）（v / v）のポリソルベート80（P-80）、P-80および/またはLHBが追加された0.004パーセントで補充ミューラーヒントンブロス（CAMHB）を調整しました2希釈：ダブル最終濃度で接種物（ステップ4.3）の添加は、1になりますので。 表2の列6および7を参照してください栄。

3. MICパネルを準備します

1. MICパネルの適切なウェルにステップ2.3で調製した各ダルババンシン溶液50μlを分注し、（よく成長制御）のみ1つのウェル内のメディアを含みます。無菌の先端を有するマルチチャンネルピペットは、このステップのために使用することができます。
2. すぐにパネルを使用するか、ビニール袋プラスチックフィルム、場所で密封し、直ちに^≤-20°Cの （好ましく^≤-60°Cの時に）必要になるまでに非除霜冷凍庫に入れます。冷凍パネルが使用されている場合（よく内容が解凍されるまで）、パネルの接種に進む前に、シールを削除して、15〜30分間実験台の上に個々のパネルを配置します。

4. MICパネルを接種純度とセットアップコロニー数を実行します

1. 18〜24時間の血液寒天培地または他の非選択寒天プレートからいくつかのよく分離したコロニーを選択します。滅菌ループまたは綿棒で各コロニーの上部をタッチ1-5ミリリットルCAMHBまたはsへの転送濁度までアリーンは、0.5マクファーランド標準と同等です。 0.5マクファーランドまたは測光装置と視覚的に比較することによって濁度を評価します。
2. CAMHB中（10ミリリットルCAMHBに100μl）を100：準備の15〜30分以内に、接種物1を希釈します。 Sの例外を除いて、ダルババンシンに対してテストほとんどの細菌については、 ニューモニエ 、この希釈は、（許容範囲は2-8×10 ⁵ CFU / mlである）、5×10 ⁵ CFU / mlの最終ウェル濃度を提供します。 S.について肺炎連鎖球菌は 、0.5マクファーランド濁度の比較に基づいて、細菌濃度は、したがって、（10ミリリットルCAMHB + 10％+ LHBに400μl）を接種物を1:25に希釈し、かなり少ない一般的にあります。
3. 接種調製後15分以内に、滅菌チップを用いたマルチチャンネルピペットは、この工程のために使用することができますステップ3で作成したMICパネルの（無菌性制御の例外もあり）を各ウェルに最終接種の50μLを転送します。
4. 純度のチェックを実行転送しても非選択寒天（5％ヒツジ血液と例えば 、トリプチケースソイ寒天培地）に滅菌ループを使用してプラス成長制御1から10μlのアリコートを広げることもできます。
5. （：1,000希釈1）シングルチャネルピペットと滅菌チップと生理食塩水10mlのへの転送とよく成長コントロールから10μLを除去することにより、セットアップコロニー数。異なる方向に2回繰り返し、滅菌ループで混合し、転送を100μlシングルチャンネルピ ​​ペットと滅菌チップを用いて、適切な、非選択的寒天培地（5％ヒツジ血液と例えば 、トリプチケースソイ寒天培地）に、全寒天表面に広がります接種物（1:10希釈）の均一な分布を保証します。

5.インキュベートMICパネル、コロニー数と純度プレート

1. プラスチックテープまたはインキュベーションの前にぴったりプラスチックカバーで、ビニール袋に超えない4つのパネルの各MICパネルまたはスタックをシール。あるいは、Tの空のMICパネルを配置せいぜい4 MICパネルのスタックのopが、プラスチック容器に湿らせたペーパータオルを置き、プラスチック容器、しっかりと蓋との密接なコンテナ内の場所のMICパネル。
2. 接種の30分以内に16〜20時間（ブドウ球菌および腸球菌）、および20〜24時間（連鎖球菌）、35℃±2℃の周囲の空気のインキュベーター中でMICパネルをインキュベートします。 5％CO _{2インキュベーター}でインキュベート連鎖球菌以外は同様の条件でコロニー数と純度のプレートをインキュベートします。

6.プレートをカウントしたMICとコロニーを読みます。純度のプレートをチェック

1. 肉眼によって検出されるように完全にウェル中の細菌の増殖を阻害する最低濃度としてMICをお読みください。
2. コロニー数のプレート上のコロニーをカウントします。希釈率（1：10,000）により各コロニーを掛け（例えば、50個のコロニーは、5×10 ⁵ CFU / mLに相当します）。許容範囲は20〜80個のコロニーである（2-8×10 ⁵ CFU / ml）およびアプロとして使用されていますximateガイドライン。
3. 純度のプレートを確認してください。全てのコロニーが、ステップ4.1で使用されるコロニーに似ている場合には、接種材料は、純粋なと考えることができます。存在する任意の他のコロニーが存在する場合、MICパネル中に存在すると、汚染物質の可能性があるとテストが繰り返されるべきです。

7.品質管理の結果を確認してください。

1. CLSI品質管理株の予想の範囲については、表3を参照してください 。試験の結果のみを報告する品質管理生物（単数または複数）のためのダルババンシンMICの結果が​​予想される範囲内にある場合に分離します。
2. ≥0.25/ mlのMICは、任意の臨床S.について得られている場合黄色ブドウ球菌は、ダルババンシンのMICのテストを繰り返し、および/ ​​または検証するための基準検査室に送る、隔離します。

Results

標準化されたMIC法は、耐性の発生を監視するために、様々な抗菌サーベイランスプログラムの重要な目的で必要です。 2011-2013にヨーロッパやアメリカで集め分離株のためのダルババンシンMIC結果は、 黄色ブドウ球菌の99.9％と連鎖球菌の100％（ 表4）のための<0.25μgの/ mlでした。

QC株S.のためのダルババンシンBMDのMICの新鮮な（密封された）DMSO、三重の試験を使用することの重要性を評価するために、 黄色ブドウ球菌 ATCC 29213、及びE.フェカリス ATCC 29212 および Sのテストを複製ニューモニエ ATCC 49619は、有効期限内であり、2年のために以前に使用されていた1 Lボトルから密封アンプルから（1）DMSO、（2）DMSOを用いて行った（3）同じ1 LのDMSOのアリコート使用前に72時間オープンビーカーに放置したボトル（サンプル2）。すべての3つのDMSO試料を用いて作られたパネルを使用して、ダルババンシンMICの結果は類似しており、ワットました許容できるQC範囲をithin（ 表5）。

プラスチックへとP-80を添加していない原液の曝露後のダルババンシン活性の喪失は、 ^ウェル 7 ^を文書化されています。 2つの追加の研究は、初期および中間の原液（ 表6）に、P-80のほかに、初期および中間の原液（ 表7）を製造するためのガラスやプラスチック管の使用は、上の影響はありませんでしたダルババンシンのMICの結果。 3社からポリプロピレン、ポリスチレンプレート（表7）を用いた場合、ダルババンシンMIC結果には何の影響もありませんでした。

連鎖球菌の試験のためのブロス培地中の溶解したウマ血液の存在は、P-80 ^7,8に匹敵する界面活性剤様活性を有することが示されている。連鎖球菌のためのダルババンシンの参照方法は、両方のP-80、溶解ウマ血液を含みません、しかし、ブドウ球菌および腸球菌とは異なり、連鎖球菌のためのダルババンシンのMICの結果が​​でとP-80を添加せずに（+/- 1希釈以内）に類似しています。

先に提示し、図1に示されているように、ダルババンシン寒天希釈液（AD）のMICは、現在のBMD基準^12、13、14と比較して2-8倍高い、典型的である。BMDとは異なり、0.002％P-80の添加はありませんMICが^12を結果ダルババンシンADに影響を与えます。

式1：800 / mlのダルババンシン溶液25mlためのダルババンシン原液準備準備段階の例 。

ADへのダルババンシン及びバンコマイシンBMDの図1の比較。dalbavaを比較した研究の結果ncinとバンコマイシンBMDを選択し、グラム陽性細菌単離するAD MIC結果。平均（A）ダルババンシン及び（B）15、黄色ブドウ球菌 、8コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CNS）、5 エンテロコッカスフェカリスと14連鎖球菌のための/ mlの中バンコマイシンブロス微量希釈および寒天希釈MIC結果（グループA、B、およびC）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

DAL 0.002

DAL 0.004

DAL 0.008

DAL 0.015

ダル0.03

DAL; 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0.5

DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

B

DAL 0.002

DAL 0.004

DAL 0.008

DAL 0.015

ダル0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0.5

DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

C言語

DAL 0.002

DAL 0.004

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ダル0.03

DAL 0.06

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DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

D

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DAL 0.004

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ダル0.03

DAL 0.06

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DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

E

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ダル0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

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DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

F

DAL 0.002

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ダル0.03

DAL 0.06

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DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

G

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ダル0.03

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DAL 1

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H

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DAL 0.004

DAL 0.008

DAL 0.015

ダル0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0.5

DAL 1

DAL 2

順位Ctrlキー。

DAL

ダルババンシン

濃度は50μL/ウェル接種後/ mlの中で述べられています

DAL 0.5

表1 MICプレートフォーマット。ダルババンシン希釈し、この映像公報に例として使用される陽性対照ウェルの位置を示す、96ウェルプレートフォーマット

1	2	3	4	5	6	7	8
ソースコンク。濃度（μg/ ​​ml）を	ボリュームソース（ミリリットル）	ボリュームDMSO（ミリリットル）	中級コンク。 DMSO中濃度（μg/ ​​ml）を	ボリューム中級コンク。 （ミリリットル）	ボリュームCAMHB + 0.004％のP80の*（ミリリットル）	2Xコンク。 1後：CAMHBで100希釈濃度（μg/ ​​ml）を	最後のパネルコンク。ポスト接種（/ mlの）
800	1.0	1.0	400	0.02	1.98	4	2
400	0.5	0.5	200	0.02	1.98	2	1
400	0.5	1.5	100	0.02	1.98	1	0.5
400	0.5	3.5	50	0.02	1.98	0.5	0.25
50	0.5	0.5	25	0.02	1.98	0.25	0.125
50	0.5	1.5	12.5	0.02	1.98	0.125	0.06
50	0.5	3.5	6.25	0.02	1.98	0.06	0.03
6.25	0.5	0.5	3.13	0.02	1.98	0.03	0.015
6.25	0.5	1.5	1.5	0.02	1.98	0.015	0.008
6.25	0.5	3.5	0.8	0.02	1.98	0.008	0.004
0.8	0.5	0.5	0.4	0.02	1.98	0.004	0.002
この表は、CLSI M100-S25、表8B 3から変更されています

ブロス希釈感受性試験に使用される水不溶性抗菌剤の希釈液を調製するための表2のスキーム。最終MICの製造のためのダルババンシン作業溶液および希釈剤のボリューム0.002から2 / mlのダルババンシンのソリューションを提供しています。

品質管理のひずみ	期待ダルババンシンMIC（μgの/ ml）を
黄色ブドウ球菌ATCC 29213	0.03から0.12
フェカリスATCC 29212	0.03から0.12
肺炎球菌ATCC 49619	0.008から0.03

提案した株についての品質管理株^{3、11。CLSI}精度管理結果表3.期待ダルババンシンMIC結果は、適切な方法論を検証するために、臨床分離株と一緒に試験します

米国と欧州2011-2013 Surveillから（各MICでナンバー）ダルババンシンMIC結果の表4.配布ンス研究^15。 in vitro活性現在のダルババンシンの指標として最近の臨床分離株の発表された研究から、ダルババンシンMIC結果。

＃を分離	ダルババンシンMIC（μgの/ ml）を
	DMSO 1	DMSO 2	DMSO 3
黄色ブドウ球菌 ATCC 29213	0.12	0.06	0.06
	0.12	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
フェカリス ATCC 29212	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
	0.015	0.015	0.015
	0.03	0.015	0.015
DMSO 1 =未開封の炎が10ミリリットルのアンプルを密封し
DMSO 2 =頻繁に開かれた1Lボトル
DMSOは3 =よく1Lボトルを開けた - 72時間覆われていないビーカー中でベンチに座っていました

表5.ダルババンシンMIC結果3のソースからDMSOでDMSO株式及び中間希釈調製物を用いて濃度（μg/ ml）を。ダルババンシンストックとの中間希釈液の製造において異なるDMSO溶剤を使用した場合の結果を比較したダルババンシンのMIC試験の結果。

番号を分離	番号を複製	ダルババンシンMIC（μgの/ ml）を
		DMSO中のP80 / W DALB	DMSO中/ O P80ワットDALB
黄色ブドウ球菌 ATCC 29213	1	0.06	0.06
	2	0.06	0.06
	3	0.06	0.06
	4	0.06	0.06
黄色ブドウ球菌の臨床DP80-002SA	1	0.03	0.03
黄色ブドウ球菌 ATCC 700699	1	0.5	0.5
肺炎球菌 ATCC 49619	1	0.03	0.015
	2	0.03	0.015
	3	0.03	0.015
	4	0.03	0.015
化膿連鎖球菌の臨床：
DP80-004PY	1	0.015	0.015
DP80-005PY	1	0.03	0.03
DP80-006PY	1	0.03	0.015
DP80-007PY	1	0.06	0.03
DP80-008PY	1	0.03	0.015
臨床アガラクティエS.：
DP80-009AG	1	0.06	0.12
DP80-010AG	1	0.06	0.03
DP80-011AG	1	0.06	0.06
DP80-012AG	1	0.06	0.06
S. dysgalactiae cliniCAL DP80-013DY	1	0.03	0.03
S.は、臨床肺炎 ：
DP80-014SP	1	0.06	0.06
DP80-015SP	1	0.03	0.03
DP80-016SP	1	0.03	0.03
DP80-017SP	1	0.06	0.06

表P-80とし、0.002％なしのDMSOストック＆中間希釈調製物を用いて6ダルババンシンMIC結果。株式と中間希釈をダルババンシン0.002％のP-80の添加効果を比較したダルババンシンのMIC試験の結果。

分離します	番号を複製	マイクロタイタープレート（プラスチックタイプ）
		ポリプロピレン、グライナー	ポリスチレン
			グラス	プラスチック	プラスチック1時間	プラスチック1時間/中級1時間	グレイナー	コー​​ニング	ヌンク
黄色ブドウ球菌ATCC 29213	1	0.06	0.03	0.03	0.03	0.06	0.03	0.06	0.03
	2	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.06
	3	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03
フェカリスATCC 29212		0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
	2	0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
	3	0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
肺炎球菌ATCC 49619	1	0.015	0.015	0.015	0.015	0.008	0.008	0.008	0.008
	2	0.015	0.015	0.015	0.015	0.008	0.015	0.008	0.008
ガラス瓶にガラス製=初期ストックを、中間濃度を作るために直ちに使用プラスチックチューブ中のSは、培養液の希釈液を作るためにすぐに使用。
プラスチック製遠心管で作られたプラスチック=初期在庫は、プラスチックチューブ内の中間濃度を作るためにすぐに使用、ブロス希釈液を作るためにすぐに使用。
プラスチック製遠心管で作られたプラスチック製の1時間=初期ストック、1時間ベンチに座らせ、その後培養液中での濃度を作るためにすぐに使用し、プラスチックチューブ内の中間濃度を作るために使用されます。
プラスチック製遠心管で作られたプラスチック製の1時間/中級1時間=初期ストック、1時間ベンチに座らせてプラスチックチューブ内の中間濃度を作るために使用、その後、その後、培養液中の濃度を作るために使用される1時間ベンチに座らせて。

ストック希釈チューブ

プラスチックとガラス管とMICプレートプラスチックの種類の株式の希釈調製物を用いて表7ダルババンシンMIC結果は O結果FAダルババンシンもマイクロタイタープレートのために、さまざまなソースとプラスチックの種類を使用した場合の結果をストック溶液を調製したときに、プラスチックやガラス管を使用した場合の結果を比較したMICの調査。

Discussion

ダルババンシンのMIC試験のための準備をするときは、次の方法の詳細は、追加の考慮事項については提示されています。 MICパネルの設計は、試験される抗菌剤の数（ すなわち 、単独でダルババンシンまたは複数のエージェント）と試験される細菌の種類に依存するであろう。ダルババンシン濃度は、試験されるすべての細菌種及び少なくとも一つのQC株について期待される希釈液の全範囲のための解釈のブレークポイントを含むべきです。抗菌希釈系列は、抗菌剤および/または/プレートと接種方法を分離するの数に応じて行または列のいずれかで編成することができます。ダルババンシン粉末及び培養液の量は、最適な量が生産されることを保証するように計算されるべきであり、廃棄物が最小です。このマニュアルで使用されている例えば、ボリュームは2 MICパネルの準備に基づいています。陽イオン調整ミューラーヒントンブロスは男に従って調製し、オートクレーブ処理する必要がありますufacturerの指示とメディアの無菌性を検証しました。 MICのパネルを作製し、使用する準備の同じ日に、またはそれらは、適切な品質管理生物、将来の使用のために凍結保存された検証済みのパネルを用いて試験することができることができます。これは、作業中の滅菌技術を使用することが重要です。

コロニー数と接種濃度の検証のための厳密な基準はありません。コロニー数は、ステップ4.2で実行希釈工程を検証するために定期的にテストおよび/またはそれぞれの種のために最初にチェックすることができます。これは、0.5マクファーランド標準の妥当性もEで日常的にチェックされていることが重要です4.5ステップと同様の手順を使用して大腸菌 ATCC 25922。結果は1〜2×10 ⁸ CFU / mLに等価でない場合は、新しい0.5マクファーランド標準が得られるはずです。 MICウェルからのコロニー数が許容範囲の外にある場合（臨床分離株（複数可）2-8×10 ⁵ CFU / mlであり、MICの結果は目から変わります電子期待正規分布（例えば、 黄色ブドウ球菌のための0.03から0.12 UG / mlで）、および/ ​​または品質管理単離物（複数可）のMICの結果は、予想される範囲外で、検証テストが必要でありされ、方法の変更を保証することができます。これは、検証0.5マクファーランド標準のコロニー数（S）を繰り返すために使用されることが示唆されているとの結果が期待される結果の外に再度ある場合、ステップ4.2において実行される接種物の希釈は、それに応じて調整されるべきであり、MICを繰り返します。コロニー数手順は必ずしも汚染生物のより低い濃度が検出されない場合があり希釈ボリュームを使用するため、コロニー数を行っても純度のチェックが必要であることに注意してください。

MIC試験が有効と見なされるためには、許容可能な成長がよく増殖制御で実行する必要があります。ダルババンシン（すなわち、ブドウ球菌、連鎖球菌および腸球菌に対してテストされますほとんどの細菌は、成長がボタン（通常は> 2mm）を、より少ないFRとして見られますequently、成長がよくで濁度として表示されることがあります。濃度が増加するような効果を示すことができるいくつかの末尾の抗菌剤とは異なり、ダルババンシンのエンドポイントは、通常、十分に定義されています。限り井戸の成長を識別する能力には妥協がないようダルババンシン含むプレートを読み取るために使用することができる読み取り微量希釈試験を容易にするために意図された種々の観察装置があります。

プロトコル内の重要なステップは、ダルババンシン及びP80の追加の溶解性に関連する手順の一部に関連しています。前のブロス希釈液を作製するために使用されるダルババンシンの最大濃度は、DMSOを溶媒として使用することが、大きくない1600よりμgの/ mlであることが重要であり、中間の濃度はDMSO中で調製されるMICでのDMSOの最終濃度となるようパネルのウェルは、1％以下です。 DMSOは吸湿性であり、従って、DMSOの古いボトルの使用はconsideratましたダルババンシンの溶解性に関してイオン。品質管理株を持つ小さなBMDの研究は、（結果のセクションを参照）重要な変数ではないことが、これを示しているがしかし、それは、DMSOの新規または最近開いたボトルを使用することをお勧めします。それは、P80は、薬物希釈調製の最終段階で培養液に添加されることも重要であるとよくMICにおける0.002％の最終濃度です。

BMDの手順は、ここに含ま/ウェルの最終容量は100μlでなるように50μl/ウェルで50μL/ウェルダルババンシンでとP-80濃度の2倍の最終濃度と接種物の追加を使用してMICパネルの製造を利用しています。この方法は、両方のSのテストのために生成される1つのMICパネル形式を可能にします黄色ブドウ球菌およびS.肺炎溶解したウマ血液を接種物に添加することができるからです。最大10μL/ウェルを添加した100μl/ウェルを用いて、MICパネルを製造するための別の方法は、に記載されていますCLSIおよびISO手順。

S.のためのダルババンシン影響を受けやすいのブレークポイント黄色ブドウ球菌は ≤0.12/ mlの（FDAの添付文書）です。最近のサーベイランスに示すように、単離物の大部分は、0.06 / mlの¹⁵のレベルでのダルババンシンによって阻害されます。近くモーダルMICの影響を受けやすく、ブレークポイントでは、方法の違いの結果として、MICの変動は、感受性率に影響を与えることができます。ダルババンシンのためのBMD手順は（いくつかのユニークなステップを含んでいるので、特に、よくMICの株式と中間薬物希釈液0.002％のP80の準備中のDMSOの使用は、この方法は正確に続いていることが不可欠です。 黄色ブドウ球菌 QC生物0.06μgの/ mlの非常に明確なダルババンシンモーダルMICと（ATCC 29213）、メソッド変化の良好な指標となっているとBMD法を検証するために日常的に使用されるべきである。MICの結果は0.03から0.12μgのの予想範囲としている場合/ mlのが、低またはHIGのいずれかに傾向にありますこの範囲のH側には、この方法の更なる検証が保証されます。

0.002％のP80の添加は、関連するすべてのグラム陽性菌のために推奨される（staphylococcci、腸球菌、および連鎖球菌）。しかし、それは溶解したウマ血液が抗結合にP-80の相対的に類似作用することが示されたことは注目に値します能力とCAMHB + LHBにP-80の添加は、ダルババンシン連鎖球菌のMICの結果に何の付加的な効果を持っていないこと。

そこの試験ダルババンシンのためのディスク拡散法は、現在ではありませんし、悪いため、BMDの相関およびAD結果、AD法を用いて、ダルババンシンの感受性試験の^12、14をお勧めしません。BMD法は、ダルババンシン感受性の今後の評価に使用されるべきです商業抗菌薬感受性試験の開発のためのゴールドスタンダードとして。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダルババンシン	メトリクス株式会社	ノースカロライナ州グリーンビル	BI-397
バンコマイシン	シグマ-アルドリッチ	ミズーリ州セントルイス	C5793
陽イオン調整ミューラー ヒントン ブロス	ベクトン ディキンソン	スパークス、MD
212322 溶解した馬の血液	クリーブランド サイエンティフィック	バス、オハイオ州
Dose-it 蠕動ポンプ	インテグラ バイオサイエンス	ハドソン、ニューハンプシャー
マルチチャンネル ピペット (Viaflo II)	インテグラ	・ハドソン、NH	4164
12チャンネルピペット(マトリックス)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
シングルチャンネルピペット(Ovation 10 µL-100&マイクロ;l)	VistaLab	Brewster, NY
96 well microplate	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 ml フラットキャップ 円錐底遠心分離管	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16x125 mm 使い捨てガラス管	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
12x17 mm スナップキャップ, ポリスチレンチューブ	ThermoFisher Scientific	マサチューセッツ州
16 ml 遠心分離管	BioExpress	ユタ州ケイズビル	C-3394-2
試薬リザーバー	インテグラ バイオサイエンス	ハドソン、NH	4312
使い捨て滅菌ループ (1 & マイクロ;L&10 µl)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
トリプチン大豆寒天 + 5% 羊の血液	Becton Dickinson	Sparks, MD
Incubator (ambient)	Sanyo
Incubator (5% CO2)	Sanyo
Analytical balance	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
グローブ	Kimberly-Clark		52817
白衣