光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

サマリー

微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。

要約

微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。

概要

細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 ^{3 -}同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ^1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の^{3,4に影響を与える}シグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。

集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes ^2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可​​能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個....

プロトコル

分子プローブおよびフローサイトメーターの作製

1. 超純濾過H ₂ Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈
2. ^25°Cの使用まで- ^-5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。
3. フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様のための材料/機器の表を参照）をオンにします。
4. 試料注入プローブ（SIP）の空の溶血チューブ（12×75 mm）を置いて、邪魔を除く、その後FCM洗浄プロセスを開始するためにフラッシュバックをクリックします。
   注 ：SIPのためのいくつかのサンプルステージはマイクロ遠心チューブなどのチューブのいくつかのタイプを収容することができます。 FCM装置に用いられる分子プローブの希釈剤とシース液は分析グレード「タイプ1」、0.22μmのメンブレンフィルターのソースからです。
5. 場所15分と速いために、流体の速度（または> 66マイクロリットル/分の流速） - SIPの超純フィルタリング_の H 2 O 2 mlの新鮮な溶血管は、10の時間制限を設定します。
6. 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズを低減し、「実行」をクリックする蛍光および光散乱チャネルに関....

結果

対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ ​​または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定の点の間の精錬データによって行うことができます。赤色光源によって問い合わせたときフィコシアニンは、M.aeruginosa光合成装置の主要な構成は、強い信号を生成する（例：640; EM：675±12.5 nm）のFSCで行われたものと同様、さらにゲート集団に使用することができ、ゲーティングが、蛍光を発する（ 図1D）。 FSCと蛍光信号から、データは、fに対するM.aeruginosa上の特定のデータに元の出力（ 図1A）

ディスカッション

^{15,19,22,23 -}分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが^5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間^6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃度およびインキュベーション時間（表1＆3）を確立する必要性を示しています。このプロトコルを使用するときに見られるように、オレンジ色の核酸プローブの最適な濃度及びインキュベーション時間は緑、核酸プローブは、半分の濃度を必要とするのに対し、1μMで10分間であるが、3倍の時間（ 図5および6）をとります。 1.0μM以上の濃度でこれらの細胞非透過性シアニンモノマーの両方が非膜損傷細胞とスペクトル排出量の重複を生成するために始めました。 SIのこの重なりgnalsは「ライブ」細胞は分子プローブを取っている場合は.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シアノバクテリア培地	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 淡水濃縮溶液 (x50希釈)
除染液	BD Biosciences 653155		出力が高速または流量66 & マイクロで毎秒12イベントを超える場合、2分間実行します。l/min. 続いて、シース H2O を 2 分間使用します。
フローサイトメーター	BD Biosciences	ご要望に応じて	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	核酸染色剤 – DMSO 中の 5 mM 溶液
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	核酸染色剤 – DMSO 中の 5 mM 溶液