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方法論記事

ポリマー/フラーレンナノ粒子の光増感を実施ブレンドと光線力学療法

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DOI:

10.3791/53038

⸱

2015年10月28日

 , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida, 2Department of Chemistry, University of Central Florida, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Central Florida, 4CREOL, The College of Optics and Photonics, University of Central Florida

この記事について

サマリー

このプロトコルは、フラーレンとブレンドされた導電性ポリマーナノ粒子の製造方法を説明しています。これらのナノ粒子は、光線力学療法(PDT)の次世代光増感剤としての可能性について調査されました。

要約

この記事では、フォトダイナミックセラピー(PDT)の次世代光増感剤として、フラーレンをブレンドした導電性ポリマーナノ粒子の作製と再現性のあるin-vitro評価の方法が報告されています。ナノ粒子は、半導体ポリマーMEH-PPV(ポリ[2-メトキシ-5-(2-エチルヘキシロキシ)-1,4-フェニレンジビニレン])とフラーレンPCBM(フェニル-C61-酪酸メチルエステル)との非適合溶媒の存在下での疎水性相互作用によって形成されます。MEH-PPVは、高い吸光係数を備えているため、トリプレット形成率が高く、フラーレンPCBMへの電荷とエネルギーの効率的な移動につながります。後者のプロセスは、フラーレン支援トリプレットおよびラジカル形成、およびMEH-PPVの超高速不活性化を通じてPDTシステムの効率を向上させます。今回報告した結果は、このナノ粒子PDT感作系が非常に効果的であり、がん細胞株に対して予想外の特異性を示すことを示しています。

概要

光線力学療法（PDT）は、光増感剤は、光増感剤は、活性酸素種（ROS）を生成する光に標的組織に投与し、露光時にされています。そのような一重項酸素及びスーパーオキシドなどのROS種は、酸化ストレス、細胞および組織1-4に続く構造的損傷を誘発することができます。これにより、アプリケーションが容易にこの方法が盛んに研究されており、臨床試験が行わ5,6をとっています 。しかし、そのような（縮小生物学的利用能および潜在的な急性毒性につながる）増感剤の暗い増感剤の毒性、光（による増感剤の非選択的分布に）患者の感受性、および疎水性のような重要な問題が残っています。

ここでは、製造およびPDTの次世代光増感としてフラーレンを配合したポリマーナノ粒子を行うインビトロ評価のための方法を報告しています。ナノ粒子の自己凝集によって形成されます半導体ポリマーMEH-PPV（ポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]）、これらの材料は、互換性の中に溶解させたフラーレンPCBM（フェニルC 61 -酪酸メチルエステル）と溶媒を急速に非相溶性溶媒（ 図1A）に注入されます。ホストポリマーとしてMEH-PPVの選択は、三重形成率の高さにつながる、高い吸光係数によって動機づけ、およびフラーレンPCBM 7への効率的かつ超高速充電およびエネルギー転送の両方されています。これらのプロパティは、PDT内の一重項酸素とスーパーオキシド形成の感作のために理想的です。

フラーレンは、実際には両方の分子とナノ粒子の形態8-13に 、PDTに適用されています。しかし、重度の細胞毒性がさらなる発展を妨げている12。ここでは、MEH-PPVのホストマトリックス中にフラーレンをカプセル化すると、その私PDTの増感材料に複合MEH-PPV / PCBMのナノ粒子の結果を得るためにすることを示します本質的に細胞傷害性ではないよ、ナノ粒子サイズおよび表面電荷、および前述の光物理的特性に起因する低光用量で利回りの高い効果的なPDT治療による癌細胞に対する特異性を示します。

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プロトコル

1.培養細胞株

  1. 解凍TE 71（マウス胸腺上皮細胞）、MDA-MB-231（ヒト乳癌細胞）、A549（ヒト肺癌細胞）及びOVCAR3（ヒト卵巣癌細胞）未満で2分間温水に寒剤バイアルを保持することにより。 106×gで6分間のそれぞれの細胞株および遠心分離機に、10％FBSを補充した10ミリリットルDMEM培地を追加します。
  2. サスペンションを吸引除去し、ペレットに3ミリリットルのメディアを追加します。適切に数回ピペッティングして細胞を混ぜます。この細胞溶液をT75フラスコにおいて10％FBSを補充した7 mlのDMEM培地を温め事前に加え、37℃で95％空気/ 5％CO 2の加湿雰囲気中でフラスコを保ちます。継代0として、このフラスコにラベルを付けます。
  3. 細胞の密集度が80％に達すると、10分間、0.05％トリプシンでそれらをインキュベートすることによって細胞を収穫。培地の等量を添加することによりトリプシンを中和します。遠心106×gで6分間、このソリューション。サスペンションを削除し、それに3ミリリットルに新鮮な培地を追加します。ミックスWELリットルと7ミリリットル培地を含む培養フラスコに少量（100μl）を転送します。インキュベーター内で培養フラスコをインキュベートします。継代1としてフラスコにラベルを付けます。
  4. 通路11または12まで培養細胞株。

ナノ粒子の作製2。

  1. 〜10 -6 M（調整）希釈していないMEH-PPV原液の調製
    1. バイアル中の分子量（平均Mn）は150,000-250,000 /モルと3 mlのテトラヒドロフラン（THF）に1mgのポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]（MEH-PPV）を追加。ホットプレート上で80℃で加熱しながら2時間混合物を攪拌します。
    2. 0.2μmのシリンジフィルターを使用して、新しいバイアル中の上記溶液をフィルタリングします。 「希釈されていないMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。ステップ2.1.3と2.1.4で説明したように、この溶液は濃度の微調整後のナノ粒子製剤に関与することになります。
    3. 3ミリリットルのTHFに希釈されていないMEH-PPVストック溶液50μlを追加。 「希釈したMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。 1cmの石英キュベットに移し、UV-VIS分光法により495 nmの吸光度を測定します。
    4. 希釈したMEH-PPV原液の吸光度が0.17以上である場合には、一度に1ミリリットルをより多くのTHFを加えることで希釈されていないMEH-PPVの原液を希釈し、495 nmで測定された吸光度がであるまで、ステップ2.1.3を繰り返し0.13から0.17の範囲です。
    5. 以下に示すようにランベルト・ベールの法則を用いて、希釈したMEH-PPVストック溶液のモル濃度を計算します。ここでは0.15吸光度プロトコルの残りの一例として使用されている（ すなわち、観察された吸光度に基づいて、次のすべての計算を調整する）、使用MEH-PPVの吸光係数が10 7 M -1 cm -1で、使用するパスの長さがあります1センチメートル。
      A =εxbxc（式1）
      （ε - モル吸光係数、A - 吸光度、B - 経路長、C - 溶液の濃度）
      0。15 = 10 7 M -1 cm -1で×1センチXC（式2）
      C = 1.5×10 -8 M（式3）
      次のように希釈されていないMEH-PPVストック溶液の濃度を見つけるために、この濃度を使用します。
      M 1、V 1 = M 2、V 2（式4）
      X 3050μlの0.15×10 -7 M = M 2×50μlの（式5）
      M 2 = 9.15×10 -7 M（式6）
      これは「調整希釈していないMEH-PPV原液」の濃度です。
  2. 調整希釈していないMEH-PPV原液にMEH-PPVの質量を計算します
    1. セクション2.1.4で得られたモル濃度は10 6グラム/モルであるMEH-PPVの分子量（M w）を用いて、以下のように調整し、未希釈ストック溶液1mlにMEH-PPVの質量を算出します。
      M = N / V（N - 。ノーモル、V - Lでボリューム）（式7）
      このように、1ml中のMEH-PPVの質量はウント調整しますiluted原液は9.15×10 -4 gです。
  3. MEH-PPVでブレンドPCBM
    1. PCBMは、50重量％のPCBMの質量に対して定義されたMEH-PPVの溶液を、ドープされた50重量％にするためにストックMEH-PPVの溶液に添加されるフェニル-C 61 -酪酸メチルエステル（PCBM）の質量を計算しますMEH-PPVの（ すなわち、MEH-PPVの半分質量）。 2.2節で得られたMEH-PPVの重量を使用することにより。
      MEH-PPV×100％= 50重量％のPCBMのPCBM / 9.15×10 -4グラムの質量（式8）
      PCBM = 4.57×10 -4グラムの質量（式9）
    2. バイアル中に1mgのPCBMを計量し、500μlのTHFを加えます。 910.88グラム/モルとしてPCBMの分子量を用いて、この溶液にPCBMの濃度を算出します
      PCBMのモル濃度の溶液= 0.001グラム/（* 500μlの910.88グラム/モル）（式10）
      PCBMの溶液のモル濃度= 2.19×10 -9モル/μlの（式11）
    3. PCBM溶液の体積を計算すると、調整に追加するために必要MEを原液PCBMは、ステップ2.3.2において算出モル濃度を用いて、THF中MEH-PPVの溶液をドープした50重量％を得るために、H-PPV原液
      / 910.88 GX PCBM×1モル1μL/ 2.19×10 -9モル= 229μlの（式12）の4.57×10 -4グラム
      調整希釈していないMEH-PPVストック溶液1mlにPCBM溶液を229μl加え、よく混ぜます。
  4. 再沈殿法によるナノ粒子の作製
    1. 転送、それに接続された針で1mlシリンジにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1ml。
    2. 急速1,200rpmで攪拌​​しながら脱イオン水4mlにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1mlを注入します。注射直後に攪拌を停止します。さらに処理することなく、これらのナノ粒子を使用してください。

イメージングのためのナノ粒子を有する細胞株の3インキュベーション

注：すべての画像化実験は、35mmのペトリ皿に完成しました。

  1. nanopartiの取り込み細胞株におけるクル
    1. 12 継代まで培養細胞株。 35ミリメートルのペトリ皿中の12 番目の継代培養細胞で。 24時間後に細胞を40％コンフルエントとなるように35ミリメートルのペトリ皿に添加した細胞の濃度を調整します。
    2. この段階では、ペトリ皿から、10％FBSを補充したDMEM培地を除去回1×DPBSで細胞を洗浄し、ペトリ皿に2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加えます。
    3. 24時間後、ペトリ皿からDMEM /ナノ粒子懸濁物を除去し、1×DPBSで3回細胞を洗浄します。その後、10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。
  2. ROSの検出
    1. ペトリ皿、細胞株当たり6、文化A549およびOVCAR3細胞株セクション3.1.1で説明したように。ラベルペトリ皿は、 表1に示します 。
    2. 表1に示すように、ペトリ皿の3つに2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加え、24時間インキュベートします。 、光用量を投与された24時間後に細胞を洗浄し、HBSSで細胞を懸濁しますペトリ皿（ハンクス液）のための無料メディアを染めます。
    3. 15分間のソーラーシミュレータのランプをウォームアップ。 UV光をフィルタリングするために、ランプの前にUVフィルターを置きます。ペトリ皿の表面で0.5日（50ミリワット/ cm 2）での強度を得るためにランプ電力を調整することにより、基準太陽電池を有するランプを較正します。この特定の設定では、その状態は、ランプに供給される218 Wの電力で達成されました。
    4. 以下の計算に示すように、180 J / cm 2の光投与量になる60分のためにランプ（蓋オープン）の下でペトリ皿を置きます：
      50 mWの/ cmで2×3600秒/千= 180 J / cm 2の
    5. HBSSを取り外し、洗浄することなく、さらにペトリ皿に、10％FBSを補充した2ミリリットルDMEM培地を追加します。別の2時間細胞をインキュベートします。
    6. 陽性対照のために30分間、100μMの過酸化水素（H 2 O 2）で細胞をインキュベートします。
    7. 37℃で30分間の色素で細胞を培養することによって、ROS検出試薬の最終濃度5μMですべてのペトリ皿で​​細胞を染色。
    8. 10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定します。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。
  3. PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死
    1. 5ペトリ皿で​​培養それぞれの細胞株。残りの2ペトリ皿は対照試料となりながら、これらのペトリ皿のうち3つは実験のためになります。 Eなどのナノ粒子を用いた実験のために3ペトリ皿をインキュベートセクション3.1.2でxplained。対照サンプルは、ナノ粒子とともにインキュベートしていません。
    2. 24時間インキュベートした後ステップ3.2.3に従ってください。
    3. ランプ（蓋オープン）の下で3実験ペトリ皿を置き、20分、40分で1分および60分で1で1を削除します。これは、60、120及び180の光用量J / cm 2であり、それぞれ（セクション3.2.4で計算）に曝露された三つの試料が得られます。次に、制御ペトリ皿の一つに180 J / cm 2の光投与量を管理します。これは、ナノ粒子が存在しない場合に適用される光線量とコントロールです。残りのコントロールサンプル（無ナノ粒子及び適用されていない光線量）に光線量を適用しないでください。
    4. 10％FBSを補充したDMEM培地でHBSSを交換し、4時間インキュベーターでペトリ皿を保ちます。
    5. 15分間の色素で細胞をインキュベートすることにより実験的およびアネキシンV FITC20μlのと対照ペトリ皿で​​細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。 Cを染色2分間の色素を用いてインキュベートすることにより300 nmのDAPIと同様に300 nmのPI（ヨウ化プロピジウム）でells。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。

ナノ粒子の4固有細胞毒性

  1. 96ウェルプレート中の細胞培養を数えます
    1. 培地を除去し、10分間、0.05％トリプシンで細胞をインキュベートしたDPBSで細胞を2回洗浄することにより培養フラスコから細胞を収穫します。得られた細胞溶液に、10％FBSを補充した2 mlのDMEM培地を加えます。一重に細胞クラスターを分離するために、適切に解決策を混ぜます。
    2. 100μlの細胞懸濁液を取り、10％FBSを補充した900μlのDMEM培地に加えます。よく混ぜます。血球計数器上にこの懸濁液10μlを置きます。血球計数器を用いて細胞をカウントし4.1.1 4×10 5細胞/ mlで細胞懸濁液の濃度を調整します。
    3. 0時間とラベル5 96ウェルプレートを取り、24時間R、48時間、72時間および96時間。 表2に示すようなウェル/ 2,500細胞を播種、ウェルに5×10 4細胞 / mlの細胞液（TE 71およびA549）の50μLを追加します。 OVCAR3およびMDA-MB-231細胞株について、同じ手順を実行します。
    4. 24時間後、1×DPBSでウェルを洗浄し、 表2に示すようにウェル中にナノ粒子の濃度の増加の50μLを加える。へ2.4.2からDMEMに20、100、及びナノ粒子懸濁液180μLを添加することにより、種々のナノ粒子の濃度を準備それぞれ0.4×10 -4 mg / mlで、2.0×10 -4 mg / mlで、3.6×10 -4 mg / mlの、ナノ粒子の濃度を生じる2 mlの最終容積を得ます。各細胞株は、ナノ粒子の各濃度について三つ組を有します。
  2. 暗所での細胞生存率を測定します
    1. すぐにナノ粒子を添加した後、0時間プレートに10μlのMTTを追加します。ホルマザンcryst 4時間プレートをインキュベートALSを形成します。ウェルに50μlの可溶化溶液を追加します。ホルマザン結晶を溶解するために6時間プレートをインキュベートします。
    2. マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を記録することによって、0時間プレートの細胞生存率を測定します。
    3. 24時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子を各ウェル後24時間のインキュベーションに50μlのメディアを追加。 4.2.1と4.2.2で説明したように、MTTを加え、プレートをお読みください。
    4. 48時間、72時間、および96時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子と24時間のインキュベーション後にウェルに50μlのメディアを追加。残りの期間のために細胞をインキュベートします。
    5. 4.2.5 4.2.1と4.2.2で説明したように）特定の時点での細胞生存率を測定します。
    6. （n = 3）で3回完全な実験を繰り返します

5. PDT後細胞生存率を測定

  1. 細胞を計数し、96ウェルプレートで培養します。
    1. 9のセットにラベルを付けますTE 71 + A549プレート及びOVCAR3 + MDA-MB-231プレートの両方について、表3に示すように、6ウェルプレート、。 4.1.3に示すように、プレートのレイアウトは同じです。
    2. セクション4.1.2 の表2に示したのと同様のレイアウトでセクション4.1で説明したように96ウェルプレートをシード。
    3. 4.1.4で説明したように24時間後にプレートにナノ粒子を追加します。
    4. ナノ粒子を添加した後の24時間は、1×DPBSで細胞を洗浄し、各ウェルに50μlのHBSSを追加します。
    5. 3.2.3で説明したようにそれぞれの光用量でプレートを照射します。
    6. 10％FBSを補充した50μlのDMEM培地でHBSSを交換し、PDT後の各期間のプレートをインキュベート。
    7. 4.2.1及び4.2.2で説明したように各時間期間の後、細胞生存率を測定します。

6.蛍光顕微鏡

  1. ナノ粒子の取り込み
    1. 顕微鏡Aのランプをオンにしますイメージングの前にNDレーザ30分。顕微鏡のステージ上で（セクション3.1で説明したように）固定された細胞を含むペトリ皿を置きます。
    2. 表4に示すように、フィルタを使用して、ナノ粒子およびDAPIからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子及びDAPI画像をオーバーレイ。
  2. ROSの検出
    1. 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。顕微鏡のステージ上で（セクション3.2で説明したように）細胞を含むペトリ皿を置きます。
    2. 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、およびROS検出試薬からの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで試薬画像を検出位相差、ナノ粒子、DAPIおよびROSオーバーレイ。
  3. PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死
    1. 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。で説明したように細胞を含むペトリ皿（置きます顕微鏡のステージ上のセクション3.3）。
    2. 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITCからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITC画像をオーバーレイ。

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結果

取り込みおよびナノ粒子の本質的な細胞傷害性

50重量％ブレンドMEH-PPV / PCBMのナノ粒子は、TE 71、MDA-MB-231、A549及びOVCAR3細胞株と共にインキュベートしました。 PCBMブレンドレベルは、共役ポリマーとフラーレン14の間の理想的な電荷およびエネルギー伝達特性を与えることが示されている50重量％のPCBMとして選ば ​​れました。ナノ粒子の取り込みの蛍光画像は、 図1Bに示されています。細胞は、ナノ粒子の取り込みを確実にするために、ナノ粒子と24時間インキュベートしました。次いで、細胞を画像化する前に、4％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞および核の位置を検出するためにDAPIで染色しました。画像十分に分離された細胞のために40％の集密度を維持しました。対応する位相コントラスト画像と蛍光画像をA549及びOVCAR3癌細胞株によるナノ粒子の優先的な取り込みがあることを示しています。検出可能な蛍光は、TE 71の制御に見ることができませんそしてMDA-MB-231癌細胞株、制限された取り込みを...

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ディスカッション

ナノ粒子を製造しながら、ナノ粒子の取り込みを達成するために、それはいくつかの重要な措置を維持するために必要でした。それは、この溶液の濃度は、形成されるナノ粒子のサイズを決定する上で重要な役割を果たしていることが観察されたように、THF中（50重量％のPCBMとブレンド）10 -6 M MEH-PPV溶液を、DI水に注入するように調製しました。濃度は、UV-VIS分光法により確認しました。プロトコルのステップでは、このソリューションが1よりもはるかに大きい吸光度注入の速度を有しているので、最初に第1のUV-Visスペクトルをとる前にMEH-PPV溶液（希釈していないMEH-PPV原液）を用意し希釈する必要があった2.1.3ことに注意してくださいまた、ナノ粒子のサイズを決定する際に重要な役割を果たし、激しくDI水を攪拌しながら、可能な限り速くなければなりません。ゆっくり注入は、大きなナノ粒子になります。また、撹拌をさらに凝集を回避するために、注射直後に停止する必要があります。注入しながら溶液を水では、ナノ粒子の大きさに影響を与える気泡形成を避けるために、溶液中に完全に針を挿入しながら、バイアルの内面の近くに針を維持する...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、この研究に対する財政的支援に対して、全米科学財団(NSF)がCAREER賞(CBET-0746210)および賞CBET-1159500を通じて感謝しています。細胞培養にご協力いただいたTurkson先生(ハワイ大学がんセンター)とAltomare先生(Univ. of Central Florida College of Medicine)に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリ[2-メトキシ-5-(2-エチルヘキシロキシ)-1,4-フェニレンジニレンジ](MEH-PPV)シグマエイドリッチ536512-1G平均Mn 150,000-250,000
[6,6]-フェニルC61 酪酸メチルエステル(PCBM)シグマAidrich684449-500MG>99.5%
テトラヒドロフラン(THF)EMDTX0284-6Drisolv
1 mlシリンジ国立科学会社37510-1MEH-PPV溶液
シリンジフィルターVWR28145-49525 mm、0.2 µのろ過用;m、PTFE
1 mlシリンジハミルトン社81320MEH-PPV溶液を水に注入してナノ粒子を作るため
ダルベッコのイーグルスミディアム/ハムのF-12 50/50ミックスの改良型(DMEM)コーニング(VWR)45000-350
ハンクの平衡塩溶液(フェノールレッドなし)(HBSS)品質生物学的(VWR)10128-740
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1倍(DPBS)コーニング(VWR)45000-436
シ胎児血清、レギュラー(熱不活性化)(FBS)コーニング(VWR)45000-736
トリプシンEDTA 1x 0.25%コーニング(VWR)45000-664プシン/ 2.21 mM EDTA、重炭酸ナトリウム、カルシウム、マグネシウムブタパルボウイルスを含まないHBSSで16
%パラホルムアルデヒドを試験しました電子顕微鏡科学 1571016%パラホルムアルデヒドは、PBS DAPIを添加して4%に希釈されます
 ビオチウム VWR89139-054核染色
5 ml ピペットVWR82050-478
75 cm2 培養フラスコVWR82050-856細胞培養
96 ウェルプレートVWR82050-771MTT アッセイ用
ベント付き組織培養皿グライナー バイオワン (VWR)82050-538
ヨウ化プロピジウム分子プローブP3566
アネキシン V FITCポトーシス用InvitrogenA13199
Celltiter 96 non-R 1000 アッセイプロメガ (VWR)PAG4000MTT
CellROX グリーン試薬、酸化ストレス検出用InvitrogenC10444ROS用検出
紫外可視分光器Agilent 8453
蛍光分光器NanoLog HoribaJobin Yvon
動的光散乱PD2000DLS、精密検出器
インキュベーターNuAir DH オートフロー
共焦点顕微鏡Zeiss Axioskop263X 油浸対物レンズ
エピルミネッセンス顕微鏡オリンパス IX7160X 水浸対物レンズ、Andor Zyla sCMOSカメラ
ソーラーシミュレータニューポート 67005 オリエルインスツルメンツ
リファレンス 太陽電池オリエル VLSI規格 組み込まれている
マイクロプレートリーダーBioTek Ex808
血球計算盤Hausser Scientific Partnership3200細胞数カウント用
ウトリ用 ア 色素

参考文献

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