タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます

サマリー

タンパク質発現の制御は、生きているすべての生物にとって不可欠であるだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質機能を調査するための重要な戦略でもあります。提示されたプロトコルは、初代海馬ニューロンを含む哺乳類細胞における抗体干渉の適用を示し、タンパク質機能の研究における三次元再構成の使用を示しています。

要約

タンパク質発現の厳格な管理は、生きているすべての生物に不可欠なだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質の機能を調査するための重要な戦略だけではありません。したがって、最近の研究は、RNAおよび抗体干渉を含む哺乳動物細胞系、あるいは動物モデルにおいて、タンパク質の発現を標的とするさまざまなツールを発明しました。最初の戦略は、過去20年間に多くの注目を集めているが、細胞膜を横切って細胞に抗体貨物の転位を媒介するペプチドは、はるかに少ない関心を得ました。この公報では、抗体の干渉実験を行うために、ヒト胚性腎細胞ならびに初代海馬ニューロンにおけるチャリオットという名前のペプチドキャリアを利用し、さらにタンパク質の機能を解析する際に3次元再構成の適用を説明するためにどのように詳細なプロトコルを提供します。我々の調査結果は、チャリオットはparticula、おそらく、その核局在化シグナルによるものであることを示唆していますRLY相馬と核内に存在するタンパク質を標的とするためによく適しています。初代海馬培養にチャリオットを適用する際に注目すべき、試薬は驚くほどよく解離したニューロンによって受け入れられるようになりました。

概要

すべての生物が独自の開発を指揮するだけでなく、環境シグナルに反応するためのタンパク質発現の厳密な制御が不可欠です。したがって、機構の多くは、正確にアプリケーションによってコードされる各タンパク質の発現量を調節するために進化の過程で発明されました。 2万遺伝子は、その寿命の任意の時点で任意の真核生物の細胞内に存在します。タンパク質生産のさまざまな段階で行われて、調節機構は、翻訳後タンパク質修飾、輸送及び劣化の方向に取り扱うクロマチン構造、転写およびRNAの管理の範囲です。

基礎となる分子機械と変化したタ​​ンパク質の発現レベルの機能不全は、癌や知的障害などの多様な疾患と関連していることは驚くべきことではありません。実際、神経発達および哺乳動物の脳機能の優れた複雑さを見て、センシタンパク質の発現の変化にこれらの高度なシステムのtivityは、脆弱X症候群（FXS）のようないくつかのよく知られている知的アルツハイマー病やパーキンソン病（ADおよびPD）などの赤字だけでなく、自閉症スペクトラム障害（ASD）となって現れます。後者の疾患は、単一の翻訳調節タンパク質、FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質^）1-4の損失に起因する種々のタンパク質の大規模な誤発現によって特徴付けられます。また、変数の充電に影響を与える染色体再配列は、点突然変異が認知障害のある患者で同定されなかった一方で連結されたタンパク質^{A（VCXA）、5を}キャッピングするmRNAを変更することにより、mRNAの安定性および翻訳を管理するタンパク質が、最近では、知的障害と関連しているxは今のところ^6、7、観察された精神的な障害が変更されたVCXA式とその標的proteの調節不全の発現に由来することを示唆していますイン。これらの知見と一致して、遺伝子のデノボコピー数の変動がASDに関連しているかどうかを調査する研究では、新規遺伝子重複および欠失は、このように上昇または低下したタンパク質の発現レベルが引き起こす可能性があるという考えを支持し、ASD ⁸のための重要な危険因子である確立しました知的障害。

注目すべきことに、最近の研究は、さらに、所定のタンパク質の発現量を正確にほとんど安全マージン⁹と高タンパク質量の結果としての凝集を防止するように調節されるという証拠を提供しました。したがって、小さな増分は、ADおよびPD ⁹のような疾患を誘発するのに十分であることが提案されています。タンパク質の発現制御に貢献する分子機械の様々なこれらの知見に照らして、複雑なレギュレーション方式を示唆しているが、5,000以上の哺乳動物遺伝子の発現レベルを調査する研究が¹⁰ということを実証しました性質がより倹約スキームを好ん：タンパク質の細胞存在量は、主に翻訳¹⁰のレベルで調節されることが示された、このようにRNAの可用性の管理は、主に微調整タンパク質発現に役立つことを説明します。

目的のタンパク質の用量を学ぶ（ランドマーク）は、したがってのみタンパク質の内因性機能の理解に重要なだけでなく、多くの疾患の調査と治療法の開発にではありません。このように、最後の数十年は、POIの投与量を操作するためにRNA干渉を用いて、いくつかの戦略の進歩を見てきました。 RNA干渉は、広くタンパク質機能を研究するために使用され、さらには癌または眼疾患を治療するだけでなく、患者^11から13に抗ウイルス療法を追求するために臨床試験に適用されているが、いくつかの困難が不可能な戦略をレンダリングする可能性があります発生する可能性があります。例えば、相同性によってノックダウンを駆動シード配列は、comparaありますしたがって、オフターゲット効果を促進し、BLE短いです。高効率の配列はまれであり^、（14に概説されている）オプションの数千人の中から発見される必要があるので、右の配列を同定することは、時間とコストがかかることができますが、結果はまだ失望してもよいです。

別の戦略は、直接抗体によるPOIを標的とすることです。ここでは、細胞タンパク質の利用可能性を減らすために（アクティブモチーフ社製）タンパク質担体チャリオットの使用を説明し、3次元再構成の雇用はノックダウンを以下のタンパク質の機能を研究します。

チャリオット、自身2.8 kDaのペプチドの活性モチーフは、哺乳動物細胞¹⁵の膜を横切ってシャトルペプチド、タンパク質および抗体に使用されます。チャリオット-POIの複合体がエンドソーム-INDに細胞内に内在化されるところ疎水性相互作用を利用した非共有結合した高分子複合体を形成することによりPOIを有するペプチド会合し、ependent方法。重要なことには、チャリオットは往復タンパク質の細胞内局在に影響を与えない、また細胞毒性効果を発揮するか、積荷¹⁵の生物学的活性に影響を与えることもないことが示されました。

プロトコル

1.在庫ソリューション

1. /μlの終濃度2μgに滅菌H ₂ O中で凍結乾燥アクティブモチーフ粉末を再懸濁します。混合するために慎重にタップします。
2. （ 例えば、12μlのそれぞれは、2μlの反応ごとに必要とされる）少量のアリコートを調製し、-20℃で保管してください。

細胞の調製

1. 抗生物質を含む500μlの増殖培地中で24ウェルプレートに、このようなHEK293細胞または一次ニューロンなどの哺乳動物細胞をシード。
   注：ニューロンを使用する場合は、低密度で細胞を播種すると、24ウェルプレートの2つだけ真ん中の行を使用します。各ウェルは、このように、インキュベーション（ステップ4.2）の間にメディアを保有する空の相手を持つことになります。ニューロンを取り扱う際は、常に細胞が数分以上インキュベーターの外に保たれていないことを確認してください。
2. 細胞アプリなるまで培養に適切な条件で細胞が（、加湿5％CO _{2、37℃）。} 50％コンフルエント。
   注：ニューロンを使用する場合は、 文化希望の発達段階までの細胞が到達したアプリを変更されています。二回培地の百分の25から50週。ミディアム：Neurobasal培地（1×B27、5 mMのL-グルタミンおよび1×ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む; REF 16と比較）。

3.チャリオット複合体形成

1. 反応あたり、50μlのPBSで、それぞれPOIまたは対応する抗体ならびに対照タンパク質、または対照抗体の0.1〜2μgのを薄めます。
   注：技術はまた予め結合一次および二次抗体からなる高分子複合体と連携（CP「代表的な結果」、 図1）。混合し、スピン。
2. 各サンプルについて、チャリオットの自己会合を避けるために、別々のチューブを使用して50μlのPBSで2μlのチャリオットストック溶液を希釈します。混合し、スピン。
3. ピペットでチャリオット希釈に希釈したPOIまたは抗体（ステップ3.1）を転送ティン。混合し、スピン。
4. 室温で30分間混合物をインキュベート（チャリオット-POIの複合体が形成されます）。

細胞のトランスフェクション4。

1. 100μlの予め温めた成長培地（37℃、無添加）でチャリオット錯体（ステップ3.4）に希釈します。培地を除去し、予め温めた1×PBSを用いて細胞を1回洗浄します。
   注：ニューロンを使用する場合は、メディアを破棄することはありません、それが再利用されます。 37°Cで保管してください。洗浄には、0.5のMgCl ₂とのCaCl _2を含むPBSを使用しています。
   提案：プレート（ステップ4.5）をインキュベートしながら、空のウェルに培地を維持します。
2. 細胞へのチャリオット複雑なソリューション（ステップ4.1）を適用し、溶液の均一な分布を確実にするために、細胞を穏やかに揺すります。 1時間の標準的な条件（ステップ2.2）の下で細胞を増殖させます。 10％の最終濃度に血清を加えます。ニューロンを使用する場合、 ステップ4.1からメディアを追加します。 1〜2時間以上細胞を増殖させます。
   注記：最適なインキュベーション時間は、貨物の大きさと性質に依存し、経験的に調整される必要があり得ます。次の提案は、ガイドラインとして役立ち得る：ペプチドに関して、1時間で通常は十分である、タンパク質1-2時間、抗体2時間、および抗体4時間と神経細胞のトランスフェクションのために、推奨されています。
3. いつものように、分析のためのプロセス細胞。ご注意：技術は、固定プロトコルだけでなく、ライブイメージングを用いた実験と互換性があります。

5.イメージング

1. レーザ走査顕微鏡を使用して、約0.25〜0.5ミクロンの距離を用いて細胞および/または対象の細胞区画のZスタックを取ります。正確な層の距離を再構成する構造体の大きさに依存し、個別に決定する必要があります。

6.復興

1. 次の手順では、Oをクリックすることで、複数のオブジェクトを選択するために選択して移動し、CNTRを切り替えるには、Escキー底を使用nはそれらとシフトキーは、オブジェクト（CPを。6.10ステップ）を切断します。
2. IMARISでLSM-ファイルを開きます。
3. 明るい構造が飽和状態に達するまで、各チャンネルの表示調整を使用して、画像をコントラスト。この調整は、表面の構造に影響を与えないだろう、それが唯一の画像を閾値に実験者を支援するために提供していますのでご注意ください。
4. 新しいサーフェスを追加アイコンをクリックします。ウィザードが開きます。
5. 選択：セグメント関心の領域のみ。次のステップに進みます。
6. 興味のある対象物に合わせて選択ボックスの余白を調整します。画像は、3次元を持っており、選択は同様にz平面で調整する必要があることをことを心に留めておいてください。選択ボックスの長方形の形状を適切に関心のオブジェクトと一致していなければならない場合は、オブジェクトをオンおよび/または必要なすべての構造が埋め込まれるまでボックスを拡大。望ましくないオブジェクトは、（CP。ステップ6.10）に、後に除去することができます。進みます。
7. 適切なCHを選択annel。表面積の詳細レベルや球の直径は、再構成されている構造と一致するように設定する必要があります。信号特性に応じて、絶対強度または局所的なコントラストのいずれかを使用することができます。一般的に、局所的なコントラストは、拡散信号のためのより良い動作します。いずれの場合も、設定がそれぞれ、各注目信号または構造のために個別に調整する必要があります。
8. しきい値処理ツールを用いて、関心の構造を再構築します。
9. 緑の矢印の下のをクリックして再構築を完了します。
10. カットし、必要に応じて表面を除去するために、鉛筆ツールを使って、別の目的を調整します。所望の物体を切断するために、画像を、従って、南北方向に切断傾斜することのみが可能です。
11. 統計、詳細な統計情報、および平均値を選択することで、ボリューム、面積と各サーフェスの強度の測定値を得ます。
12. （CP。 図2E色分けされた統計情報を観察するには（オプションの手順） およびF）は 、対応する表面の色]タブを選択し、代わりに「基本」の「統計符号化」をマークします。いくつかのオプションが表示されます。

結果

以下の段落では、チャリオット試薬と抗体の干渉を用いて^{、POI（16、17を}参照^してください詳細についてはSimiate、）の機能的ノックダウンを示す典型的な結果が提示されています。所見はSimiateの減少発現は転写活性を損ない、および、用量依存的に、高い抗体量（> 1μgの抗体）が適用されている場合は99％以上の死亡率で最高潮に達する、アポトーシスを誘導することを実証している（これらの発見は、以前に掲載されました^16）。ここでは、詳細に使用される技術とプロトコルを提供し、さらに一次培養物中で解離海馬ニューロンをトランスフェクトするために使用することができる方法チャリオット試薬実証します。

これらの抗体は、処置の間に機能的なままである場合、チャリオットのペプチドは、特に、抗体の効率的なシャトリングを可能とするかどうかを調べるために、我々は、FLAGを発現しHEK293細胞で24時間-Simiate、その後チャリオットを利用する細胞はrbαSimiate-gtαrbAl...

ディスカッション

ここでは、用量駆動方法で細胞機能を制御するタンパク質の発現レベルの有意性を研究するためのプロトコルを提示します。説明されたプロトコルは、従って、細胞レベルでのタンパク質の機能の詳細な研究を促進する、海馬神経細胞を含む様々な哺乳類細胞型におけるタンパク質発現の微調整操作を可能にします。

RNA干渉は、ランドマークをダウンレギュレートするために、周知の戦略を示しているが、その欠点（CP ^14）を有しています。だけでなく、高度に特異的かつ効率的な配列の同定は、コストと時間がかかるだけでなく、細胞内の転写産物の生合成は、有毒なRNA構築物の蓄積、核輸出機械の過負荷と同様に飽和するので、予測できない結果を引き起こす可能性がありすることができます内因性RNAiの処理システムは、オフターゲット効果または非効率をもたらすことができます。また、外因性のRNAiベクターの高い量が案内を誘導することができますpecific効果だけでなく、細胞の恒常性を乱します。

抗体は、他の一方で、即時細胞プロセスの研究を、彼らは、セルを入...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
チャリオ	アクティブモチーフ	30025	ストア-20°C;C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	ウォームアップ 37 >1x
B27	Lifeテクノロジー		17504044-20°Cで保管します。C
L-グルタミン	ライフテクノロジー	25030-149	20 °C;C
ペニシリンおよびストレプトマイシン	ライフ テクノロジー	15140-122	-20 °C で保管されています。C
Imaris ソフトウェア	Bitplane	n.a.	高価だが、比類のない
レーザー走査型顕微鏡	Zeiss	n.a.