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方法論記事

新生児げっ歯類から単離された脳幹・脊髄調製物の電気生理学は、ニューラルネットワーク呼吸器の出力の記録を可能にします

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DOI:

10.3791/53071

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2015年11月19日

 , 
1Department of Pediatrics, Laval University

この記事について

サマリー

中枢呼吸ドライブは脳幹にあります。孤立した脳幹-脊髄からの自発的な呼吸運動出力は、4番目の腹側ルートに電極を配置することによって記録されます。この実験的アプローチは、薬理学的研究や呼吸器の課題の評価、およびリズミカルな運動行動に対する遺伝子操作に有用です。

要約

中枢呼吸ドライブが脳幹に位置していることはよく知られていますが、その基本的な機能、発達、および刺激に対する反応のいくつかの側面は完全には理解されていません。動物全体の脳幹へのアクセスの難しさを克服するために、脳幹と脊髄の一部の分離が行われます。この調製物は、ガス、濃度、および温度が制御および監視される人工脳脊髄液で維持されます。呼吸器ネットワークからの出力信号は、第4腹側ルートに配置された吸引電極によって記録されます。このようにして、刺激を直接脳幹に加えることができ、その効果を直接記録することができます。記録された信号は、横隔神経を介して横隔膜に送られる吸気信号とリンクしており、バースト(毎分約8バースト)として説明できます。これらのバースト(周波数、振幅、長さ、曲線下面積)を解析することで、呼吸ネットワークに対する刺激効果を正確に評価することができます。この方法の主な制限は、出生後初期以降の製剤の実行可能性です。したがって、この方法は、新生仔ラットの末梢入力のないネットワーク全体の研究に大きく焦点を当てています。

概要

呼吸は、二原子酸素（O 2）取り込みおよび二酸化炭素（CO 2）の除去を可能にする、脳によって制御される、複雑で重要な活動です。中央呼吸ドライブは、両方の哺乳類1、両生類2、爬虫類3、鳥4と魚5に脳幹に位置する複雑なネットワークによって生成されます。呼吸の研究は、生体内で処理することができたとしても、正確なメカニズムの調査は、呼吸制御ネットワークへの直接アクセスを必要とします。この目的を達成するために、エイドリアンとBuytendijkは脳幹表面記録に鰓換気5に関連して生成されたリズムを配置された電極れる減少金魚の準備を開発しました。このアプローチは、その後、新生児げっ歯類で使用するために1984年6で鈴江によって適応されました。この準備の出現は、呼吸器、神経生物学における重要な進歩をもたらしました。それは比較的単純であるので、この技術は時間提示しましたEREは、リズミカルな運動行動や新生児げっ歯類におけるその起源の基本的な調査の幅広い影響を受けやすいです。

この方法の全体的な目標は、吸気活動の神経相関、呼吸器ネットワークによって生成される仮想の呼吸と呼ばれる呼吸のようなリズムを記録することです。この方法は、野生型7と8トランスジェニック動物の両方における呼吸変動または薬理学的に吸気応答を標的、研究目的の広い範囲で使用することができます。記録された信号の生理学的な関連性についての実験は、感覚求心性なしに、低温で行われ、およびaCSFの中でグルコースとO 2の濃度が高い条件下では、問題が提起されていることを考えます。 in vivoおよびin vitro条件の間に明確な違いがありますが（ 例えば 、吸気バーストの周波数）は実際には存在することを残っています呼吸ネットワーク6のコア要素は、それが可能な重要な恒常性維持機能9,10に関連した強固なリズムを研究することを可能にします。

開発し、この技術の使用の理論的根拠は特に新生児で、 生体内でほとんどアクセス可能な呼吸器ネットワークの脳幹要素への直接アクセスを容易にすることです。脳幹は、厳密に制御された条件の下に置かれている：記録リズムが肺や頸動脈体からの末梢の求心性入力によって変調されていない、研究では、中央呼吸ドライブ自体11に集中することができます。したがって、このアクセ​​スは、刺激を適用し、出力信号を記録するために利用されます。録音をプレチスモグラフィとは対照的に、呼吸リズムは、それが困難な正確な刺激を適用すること、身体（ 例えば 、肺の膨満、周辺化学センサー）を通じてそのすべてのコンポーネントによって変調されます。

におけるewbornラット、プロトコルは、人工脳脊髄液（aCSFの）中で維持孤立脳幹および短縮型脊髄の4番目の前根信号を、記録で構成されています。脳幹・脊髄調製物によって生成されたリズムが吸気信号 9に連結されている個々の遅いバーストで構成されています。 7 -絶縁脳幹・脊髄調製物は、簡単に4（P4 P0）に出 ​​生後0日目からラットで記録すること。このアプローチは、一般に呼吸器ネットワークの低酸素応答、また高炭酸ガス血症、アシドーシスまたは薬物に対する応答を評価するために使用されます。急性低酸素症のプロトコルがここに提示されます。この刺激は、aCSFの中のO 2の撤退によって得られます。このアプローチは、一般的に低酸素傷害に対する耐性と反応性を評価するために使用されます。プロトコルは、低酸素曝露（ 図1）12 の端まで最初の分からリズムうつ病を誘発します。この凹部が逆になります低酸素後の回復12の間。実験計画については、それは脳幹の吻側部に位置橋は、リズム発生器8に対する阻害作用を有することに注意することが重要です。このように、完全な脳幹と吻側脊髄の調製物は、下のリズムを表示します。記録のために単離されたサンプル中の橋を含めると、実験13の目標に応じて決定されます。延髄ネットワーク上の橋影響の研究結果14を比較するために橋ととせずに録音を必要とするであろう。また、この手法の利点の一つは、脳および/ ​​または間脳領域15,16を含むように製剤の吻側部分を拡張することが可能先斗、延髄呼吸ネットワーク上のこれらの領域の効果を評価することの可能性があります。

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プロトコル

この方法は、ラバル大学の動物倫理委員会（プロトコル＃2012から170）で許可されている動物対象、の使用を必要としました。

1.セットアップと準備

  1. ソリューション
    1. 以下のレシピ7,17に従ってaCSFのストック溶液を準備します。濃度の変動と他のレシピは文献で入手可能です。 1ヶ月まで4℃で保存原液。
      1. 塩溶液：塩化ナトリウム（最終129 mM）のの75.39グラムを追加します。 KCl（最終3.35ミリモル）の2.5グラム。 NaH 2 PO 4 0.81gの（最終0.58ミリモル）。 MgCl 2を2.33gの（最終1.15ミリモル）。塩化カルシウムの1.85グラム（1.26ミリモル）。蒸留水で1リットルに記入後、蒸留水800mlに溶解します。
      2. 重炭酸塩溶液：のNaHCO 3（21 mMの最終）の17.65グラムを追加します。その後、蒸留水で1リットルに記入蒸留水900mlに溶解します。重炭酸塩濃度の変動は、pHの変化をもたらします。
      3. グルコース溶液：54.06を追加グルコースのグラム（30mMの最終）。蒸留水で500ミリリットルに記入後、蒸留水400mlに溶解します。
    2. 塩溶液100ml、重炭酸塩溶液100ml、蒸留水1L中のグルコース溶液50mlを希釈することによりaCSFのを準備します。使用するまで4℃で保存します。
    3. 温暖化とそれが破断するまでガラス管を延伸してガラス電極を準備します。使用前に、先端ダウンサンド。電極は、それがきれいに留まるように多くの時間を再利用することができます。
  2. 実験のセットアップ
    注：セットアップの詳細は、図2に示されています。
    1. 平均化、データ収集システム、温度調節器とポンプを動かし、アンプの電源をオンにします。生の信号（2.5 kHzの）のデジタル変換、アナログのサンプリング・レート、信号増幅（ゲイン= 10,000）、濾過（高しきい値、5 kHzの低閾値、10 Hz）を確認してください。
    2. カルボゲンでaCSFのバブルとそれをボトルを記入した（95％のO 2 、5％CO 2）。 /分4ミリリットルで記録チャンバー（容量5ml）中のbubbled-と温め-aCSFの流れを誘導します。 ℃〜26（±1）で記録チャンバー内の温度を保持します。 pHは、これらの標準条件で7.4にする必要があります。
    3. 解剖室の近くに50ミリリットル注射器でRTとカーボゲン-バブリングaCSFの50mlのを保管してください。
    4. コンピュータの電源をオンにし、記録ソフトウェアを起動します。

2.解剖

  1. 計量し、視覚的に（女性は短い肛門性器の距離を持っている一方で男性は、長い肛門性器の距離を持っている、女性の性器はピンクですしながら、性器は、多くの場合、暗い男性）動物の性別を決定します。
  2. - 、注射（/ kgを4 mlでequitensine）19または揮発性麻酔薬（イソフルラン20またはエーテル21）の吸入cryoanesthesia（5分18完全4氷で動物を浸す）：以下のいずれかのオプションにより、新生児げっ歯類を麻酔。 ConfiRM足引っ込め反射の欠如によって麻酔の適切な面。
  3. ベンチに動物を置き、腹面を下に。セクション（皮膚や頭蓋骨を通して見える）ブレグマのレベルでメスで冠状に頭の吻側部分。動物が麻酔された直後に、この手順を実行します。
  4. 第身体冠状前方メンバー下メスで。
  5. 外科手術と薄いはさみやペンチで皮膚、筋肉、脂肪組織や臓器を削除します。骨はこの年齢でソフトであるため、神経系に損傷を与えないように注意が必要です。ベンチでこの手順を実行します。
  6. 解剖室で準備を置きます。準備に酸素シリンジに保存されているaCSFのを使用してください。この時点から、記録の最後に、顕微鏡を使用しています。
  7. 準備の背面には、外科的な薄いハサミやペンチを有する媒体軸に沿って尾の部分に吻側から頭蓋骨と脊椎骨を切りました。カット頭蓋骨を開きますおよび神経組織を露出させるために椎骨。準備に酸素するために注射器でstrored aCSFのを使用してください。
  8. ペンチで、くも膜、神経組織の表面を覆う薄い組織を除去します。神経組織に対する軟膜血管を保持します。準備に酸素シリンジに保存されているaCSFのを使用してください。
  9. 背面を下にして準備を置き、慎重に所定の位置に準備を保持しながらはさみで神経と結合組織を切断することにより、脳幹および脊髄をダウンさせます。背部アプローチも可能です。できるだけ長く根や神経をしてください。脳幹と脊髄を分離するために骨を削除します。準備に酸素シリンジに保存されているaCSFのを使用してください。
  10. 小脳を取り外し、メスでそれらを区画することにより吻側構造を残り。準備に酸素するために、針に保存されているaCSFのを使用してください。
  11. 必要に応じてexperimenに応じてタルデザイン、下小脳動脈22の冠状断面の前部によってメスで橋を削除します。全体の橋を維持することは、ラットでリズムを遅くし、完全にマウスでそれを阻害することに注意してください。橋の唯一の尾の部分を含んで準備は、C4のルートに安定した周波数での呼吸のような活性を示します。

3.録音

  1. 録音室、腹顔アップで準備を置きます。脊髄と脳幹の吻側 - 大部分の最下部にあるピンと準備を修正。
  2. 部分的にaCSFのに電極を埋めるために、注射器のピストンを引き出して - ：その針によって電極に結合された注射器を用いて、電極（225〜150μmのガラス先端直径）でうつ病を誘発します。
  3. マイクロマニピュレーターを使用して、慎重に第腹側根の1に近い電極を配置します。他の腹側根も呼吸様活性（ 電子を提示することができます。グラム。、XII脳神経、C1前根）。
  4. 優しく神経細根を吸引するためにピストンを引き抜くことにより、シリンジを介して電極槽内のうつ病を誘発します。その後、慎重に脊髄に対してそれを適用するために電極を移動します。
    注：理想的には細根の大きさは、電極開口部の大きさに一致するため、電極の内部と外部の区画の間にシールを作成します。差動増幅器は、一般に、記録のために使用されるので、電極の内部と記録チャンバーとの間の開口部は、信号の品質を低下させ、それが困難なバックグラウンドノイズを除去することができます。
  5. 記録を開始します。
  6. 正常酸素条件下で調製することによって製造さリズムを記録する（ すなわち、aCSFのは、カルボゲンを通気：95％のO 2および5％CO 2）で少なくとも20分の準備のベースラインパラメータを決定します。
  7. にカーボゲンバブリングaCSFのから灌流を切り替えます刺激aCSFの15分間（ すなわち、低酸素刺激のためのCO 2、95％N 2及び5％をバブリング）。実験プロトコルに依存した露光時間を変更します。記録と動物のデータシート上の露光時間を記録します。 aCSFのボトルやチューブの外側にガス拡散を避けるために、可能な限りチャンバとの間にステンレス鋼管を使用してください。
  8. 回収記録のために少なくとも15分間、標準カーボゲンバブリングaCSFのに戻って灌流を切り替えます。記録と動物のデータシートでこれを記録します。
  9. 録音を終了します。

4.統計分析

  1. 統合された信号から（バースト/分で表される）、毎分バースト数と周波数、及びベースライン（MVで表される）バーストのピークとの間の差として、振幅、持続時間などのバースト期間を計算します（複数で表される）、バーストの最後に始まり、CUR下の領域としてバースト領域統合された信号（S・mVので表される）（ 図3）にバーストのVEの。
  2. 各条件について録音の最後の5分間の平均値として、周波数、振幅、正常酸素下でのバースト期間およびバースト領域（ベースライン）、低酸素（刺激）および低酸素後（ポスト刺激）回復条件を計算します。記録チャンバーに潅流およびaCSFの均質化を切り替えるとの間に遅延があるため、各条件の最初の部分を分析しないでください。
  3. その後、対応する記録のためのベースライン値のパーセンテージとして、刺激（ すなわち、低酸素症）およびポスト刺激（ すなわち、低酸素後）回復値を表現。平均±SDとして結果を表現

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結果

冒頭で述べたように、この技術の最も重要な利点の一つは、脳幹への直接のアクセスは、様々な刺激を適用することです。一例として、低酸素状態は、ここで適用した。 図1。ABは両方正常酸素および低酸素条件下で、完全なプロトコルの記録を表示する。 図1.CE、すなわち酸素正常状態（に記録されたリズムを表示し、aCSFの、95％のO 2および5％でバブリング26℃でのCO 2）。以前は、この正確な調製11で示されるように、周波数は約8バースト/分であり、振幅は約0.800 mVです。振幅は、その重要な間準備変動の唯一の指標であることに注意してください。下のトレースは生の信号を表している上側のトレースが統合された信号を表している。 図1.DFが低酸素 条件 （すなわちに記録されているリズムを表示します。、aCSFのは、95％N 2および5％COで泡立て<サブ> 2）26℃で。以前に23の特徴として...

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ディスカッション

呼吸活性の正確な定量化が困難な場合があります。実際、呼吸は自動および自主両方にすることができます関数であり、それは環境、身体のニーズ、感情的な状態や行動に応じて変調されます。この技術の利点は、呼吸のコマンドを生成する原因神経要素の単離であります。したがって、脳幹・脊髄調製物とプレチスモグラフィの電気生理学的記録は、それぞれ、in vitroおよびin vivoでニューロンの呼吸全体ネットワークを研究するための補完的な技術です。脳幹・脊髄調製におけるパッチクランプ記録（ 例えば 、腹面から接近する）も考えられ、保存呼吸器ネットワーク 24内の特定の神経細胞の研究を可能にします。

このプロトコルは、主に解剖に、いくつかの重要なステップを含みます。神経組織の損傷を避けるために、すべての解剖の手順では、迅速かつ正確に実行する必要があります。神経組織が損傷するべきではなく、慎重にaCSFの中で一定の浸漬することによって保存されます。前述したように、神経細根と電極との間の接続の品質は、第二の重要なステップです。細根の吸引は、準備に近い電...

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開示事項

著者には、開示すべき競合する金銭的利益や利益相反はありません。

謝辞

著者は、研究施設の提供と財政支援に対して、カナダの衛生研究所MOP 130258とスター小児健康研究財団、そしてモリー・トーウェル財団に心から感謝します。また、原稿の校正とアドバイスをくださったキンキード・リチャード博士に心から感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SylgardSigma Aldrich761036-5EAフードの下で使用
NaClBioshopSOD002
KClBioshopPOC888
CaCl2BioshopCCL444
MgCl2BioshopMAG510
NaHCO3BioshopSOB999
NaH2PO4BioshopSPM306
D-グルコースBioshop GLU501
CarbogenLinde343-02-0006 
温度コントローラーワーナー・インスツルメンツ、ハムデン、コネチカットTC-324B
吸引電極AMシステムズ、エベレット、ワシントン州、米国モデル573000
差動ACアンプAMシステムズ、エベレット、ワシントン州、米国モデル1700
移動平均器CWE、アードモア、ペンシルベニア州、米国モデルMA-821
データ収集システムDataq Instruments、オハイオ州アクロン、米国モデル DI-720
LabChart ソフトウェアADInstruments、コロラドスプリングス、コロラド州、米国
プリズム ソフトウェア、グラフパッド、カリフォルニア州ラホーヤ、米国
解剖室プラスチック ボックス (例: ペトリ ボックス) は、
録音チャンバー自家製
ベースKanetec、イリノイ州ベンセンビル、米国MB
マイクロマニピュレーターワールド精密機器株式会社、サラソタ、フロリダ州、米国カイト-R
ベースKanetec、ベンセンビル、イリノイ州、米国MB
蠕動ポンプギルソン、ミドルトン、ウィスコンシン州、米国ミニパルス3
ファラデーケージ自家製
コンピューター
州、米国

参考文献

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