Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

サマリー

マイクロ流体デバイス内での機能的な微小組織の作成には、従来の細胞培養技術をマイクロデバイスの限られた空間次元に適応させることにより、細胞表現型の安定化が必要です。コラーゲンを改質することで、肝細胞などの初代細胞をマイクロ流体組織モデルとして安定化させることができる極薄のコラーゲン集合体を層ごとに堆積させることができます。

要約

マイクロ流体工学は細胞の微小環境を絶妙に制御しますが、マイクロ流体デバイス内で細胞を培養challenging. 3Dすることは、コラーゲンI型ゲルでの細胞の培養が細胞の形態と機能を安定させるのに役立ち、これはマイクロデバイスでマイクロ流体組織モデルを作成するために必要です。組織培養プレートの従来の3D培養技術をマイクロ流体デバイスに変換することは、チャネルの寸法が限られているため、しばしば困難です。この方法では、ネイティブI型コラーゲンを修飾してポリカチオン性およびポリアニオン性コラーゲン溶液を生成し、層ごとに堆積してマイクロ流体デバイスで培養した細胞上に極薄コラーゲンアセンブリを形成できる技術について説明します。これらの薄いコラーゲン層は、初代肝細胞を例に示して示されるように、細胞の形態と機能を安定させ、マイクロ流体デバイスでの微小組織の長期培養を可能にします。

概要

マイクロ流体工学は細胞微小環境の絶妙な制御を可能にしますが、マイクロ流体デバイス内で細胞、特に初代細胞を培養することは困難な場合があります。組織培養プレートで培養する際に細胞機能を維持および安定化するために、多くの従来の細胞培養技術が開発されてきましたが、これらの技術をマイクロ流体デバイスに変換することはしばしば困難です。

そのような技術の一つは、生理学的3D細胞環境のモデルとして、コラーゲンゲル上に細胞を挟み込んだ細胞の培養です。¹ I型コラーゲンは、細胞外マトリックスに遍在し、天然存在量、堅牢な細胞接着部位、および生体適合性があるため、バイオマテリアルアプリケーションに最も頻繁に使用されるタンパク質の1つです。² コラーゲンを用いた3D培養は、がん細胞^3,45、微小血管内皮細胞⁶、肝細胞⁷など、多くの細胞が恩恵を受けています。コラーゲンゲルは、組織培養プレートなどのオープンフォーマットでは容易に使用できますが、マイクロ流体デバイスのチャネル寸法が限られており、密閉性があるため、チャネル全体をブロックせずにゲル化する液体の使用は実用的ではありません。

>jove_content<この問題を解決するために、私たちはマイクロ流体デバイスで培養された細胞の上に極薄のコラーゲン集合体を作成するために、天然のコラーゲン溶液の化学修飾と層ごとの堆積技術⁸を組み合わせました。これらの層は、細胞の形態を安定させ、コラーゲンゲルと同様に機能させることができ、重合マトリックスでチャネルを塞ぐことなく、マイクロ流体デバイスの細胞上に堆積させることができます。この方法の目標は、天然コラーゲンを修飾してポリカチオン性およびポリアニオン性コラーゲン溶液を作製し、薄いコラーゲンマトリックス集合体を細胞上に沈着させることにより、マイクロ流体培養で細胞を安定化させることです。この技術は、マイクロ流体デバイスにおける初代肝細胞の形態と機能を安定化するために使用されてきました。⁹

天然および合成の高分子電解質¹⁰を用いて、プレート培養^11,12の肝細胞を覆うための層ごとの堆積が以前に報告されており、マイクロ流体デバイス^13,14の肝細胞の播種層として報告されていますが、この方法は、3Dコラーゲン培養技術を模倣して、肝細胞の上に純粋なコラーゲン層を堆積させるものです。このプロトコルでは、3Dコラーゲン層を使用して維持できる細胞を例として肝細胞を使用します。コラーゲン中での3D培養の恩恵を受ける他の多くの種類の細胞も、極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを層ごとに堆積させた後の培養から同様に利益を得る可能性があります。

プロトコル

ネイティブ可溶性コラーゲン溶液の調製

1. 準備または私は1-3ミリグラム/などPiez らによって報告され、標準の単離プロトコルを使用してML ¹⁵でラットの尾からコラーゲン酸性化し、可溶性、タイプの200 mgの購入
2. 修正されたコラーゲン溶液の所望の最終容積に基づいて、出発物質の量をスケーリングします。約可溶性天然コラーゲンを200mgから、3 mg / mlの時に25〜30のメチル化のml及びスクシニルコラーゲン溶液の25〜30ミリリットル、それぞれを行います。

2.コラーゲンのメチル化

1. 氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液100mgを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。
2. 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。白濁するために溶液を引き起こし、コラーゲン沈殿物を観察します。
3. 25分間3000×gで沈殿したコラーゲン溶液をスピンダウン。明確な、ゲル状の沈殿物がチューブの底に表示されるはずです。吸引し、適切に上澄み液を廃棄。
4. 0.1 N HClで200mlのメタノールで沈殿コラーゲンを再懸濁し、メチル化反応を4日間室温で撹拌しながら発生することを可能にします。コラーゲンは溶解しないが、解決策は曇りになります非常に小さく見える片にばらばらにする必要があります。
5. メチル化した後、遠心分離器25分間3000×gでソリューションは、メチル化コラーゲンを沈殿させます。吸引除去は、酸性化メタノール上清を処分。
6. 繰り返しのピペッティングで約3 mg / mlでの濃度を与える、無菌PBS 25ml中のメチル化コラーゲンを溶解し、60μmの細胞ストレーナーを通して溶液を濾過します。 1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。
7. concentratioを評価商業ラットコラーゲンELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを使用して溶液をN。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。
8. 慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことにより、メチル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますメチル化コラーゲンであるトップ層、。
9. 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。

3.コラーゲンスクシニル

1. 氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液の他の100ミリグラムを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。
2. 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。コラーゲンは白濁するソリューションを引き起こして、沈殿させる必要があります。
3. SUCの40 mgの溶かします（コラーゲン溶液の体積^番目の 1/20）をアセトン10ml中cinic無水物（コラーゲン1mg当たり0.4ミリグラム）。ゆっくりと（約0.5ミリリットルずつ）を連続的にpHをモニターしながら、攪拌しながら、コラーゲン溶液に、この混合物を追加します。 pHが9.0に近づくにつれて1 NのNaOHの1または2滴を添加することにより9.0を超えるpHを維持します。
4. アセトン中の無水コハク酸のすべてを追加した後、120分間室温で撹拌し続けます。スクシニル化コラーゲンが溶解するよう明確になるために解決策を確認します。定期的にそれが9.0を超えたまま確保するためのpHを確認してください。
5. 1 N HClを20μlの刻みを4.0に溶液のpHを調整します。スクシニル化コラーゲン沈殿物として、再び濁った溶液を観察します。
6. スクシニル化した後、スクシニル化コラーゲンをペレット化するために25分間3000×gで遠心分離ソリューション。未反応の無水コハク酸を用いて酸性化上清を吸引除去し、廃棄してください。
7. スクシニル化コラーゲンを溶かします無菌PBSの25ミリリットル、60ミクロンセルストレーナーを通して溶液をピペッティングを繰り返すと、ミリリットル/約3ミリグラムの濃度を与え、フィルターインチ1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。
8. 商業コラーゲンラットELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて溶液の濃度を評価します。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。
9. 慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことによって、スクシニル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますスクシニル化コラーゲンであるトップ層、。
10. 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。

コラーゲン修正4.検証

1. 、ネイティブのメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のそれぞれから1ミリリットルのサンプルを準備し、濃に希釈します水素イオン滴定のための滅菌純水でミリリットルを0.1mg /のentration。また、少なくとも4時間ごとに、10kDaのカットオフmembraneusing 3溶液の変化を介して水に対して透析によってバッファ、少なくとも1000倍に希釈。
2. NaOHおよびHClを少量の7.3に溶液のpHを調整します。天然のメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のための滴定曲線を作成するために、タンフォード^16で説明したように任意の基準として、pHが7.3を使用して、試料のそれぞれに水素イオン滴定を行います。
3. バインドされた^H +分子当たりのイオン数に対する酸の添加量あたりのpHの変化をプロットします。高pH「アミノ」の範囲は、中性点に向かってスクシニル化コラーゲンのシフト（アミン基の損失）を示すべきであり、低pH、「カルボキシル」の範囲は、メチル化コラーゲン中左シフト（カルボキシル基の損失を示す必要があります）およびスクシニル化コラーゲンの右シフト（カルボキシル基のゲイン秒）、天然コラーゲンと比較しました。
4. 標準的なプロトコール^17,18以下、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBA）比色法を用いて、スクシニル化によって置き換え天然コラーゲンでのアミノ基の％を決定することによって、サクシニル化反応の有効性を評価します。

5.マイクロ流体デバイスの作製と細胞播種

1. 標準的な方法^{9を使用して} 、マイクロ流体デバイスを製造。 100μmで、背の高い0.4〜1.5ミリメートル幅の広い、および細胞増殖のための長いチャンネル1〜10ミリメートルで、マイクロ流体細胞培養室を作成するために、フォトリソグラフィを使用して定義されたシリコン上にSU-8マスターからPDMSのレプリカ成形を使​​用してください。
2. デバイスとスライドガラスの表面を酸化するためにプラズマクリーナーを使用し、さらに結合を一緒に押します。少なくとも30分間、UV光に露光することによって、デバイスを滅菌した後、滅菌PBS中の50μg/ mlのフィブロネクチンでチャンバを充填し、45分間37℃でインキュベートします。
3. 表現型または分化状態の安定化のためのコラーゲンゲルを必要とするような初代ラットやヒト肝細胞などの細胞、を備えたデバイスをシード。私たちは、デバイスあたり14×10 ⁶細胞/ mlで播種新たに単離した初代ラット肝細胞^7,19または市販の凍結保存された初代ヒト肝細胞の20μLを使用しています。
4. 細胞は4-6時間アタッチした後、付着していない細胞を洗い流すと、増殖培地でメッキメディアを交換できるようにします。拡散フルセルを確保し、細胞のコンフルエントな単層を作成するために、O / Nインキュベートします。

6.レイヤー・バイ・レイヤーコラーゲン沈着

1. 層流の組織培養フードでは、デバイスごとに各溶液の10アプリケーションのためのメチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液の十分なボリュームだけでなく、メディアのいくつかのMLSを準備します。氷の上で解決策をしてください。私たちは、デバイスごとに1層当たりのコラーゲンの20μlの（10〜15回総デバイス・ボリューム）を使用します。
2. うメチル化された20μlのデバイスをフラッシュメチル（ポリカチオン）溶液に、代替と綿繰りし、各アプリケーションとの間で1分を待って、コラーゲン溶液をスクシニル。デバイスに約20分を取る必要があります解決策につき10回、の合計をフラッシュします。細胞は、培地なしている時間の量を最小にするためにすぐに働きます。
3. ゆっくりとその大きさに応じて、入口/出口に蓄積コラーゲンを守ってください。流体の流れが増加に対する耐性は、メディアに一度か二度のデバイスをフラッシュし、場合には、階層化を続けます。
4. 全ての層を適用した後、新鮮な培地で二回デバイスをすすぎ、インキュベーターに戻します。細胞の種類に応じて、そのような肝細胞で強化された偏光のような細胞外マトリックスにより誘導される形態学的変化は、数時間以内に表示されるはずです。
5. コラーゲンマトリックスの存在を確認するために、標準的な方法^{9を用いて} 、透過型電子顕微鏡のための代表的な装置を準備培養細胞の上に組み立て。

細胞の表現型および機能の安定化7

1. 画像の細胞型のための標準的な方法を用いて細胞の形態、生存率、および極性。肝細胞は、コラーゲン沈着の効果を実証するために、頂端の偏光に対する位相顕微鏡、生存のためにLIVE / DEAD染色し、CMFDA色素を使用して、14日間に渡って画像を収集。
2. 細胞形態学のために、リンス20μlのPBS、及び画像位相差顕微鏡を使用してデバイスを注入するためにPBS20μlをピペットで注入口を介してデバイスを洗い流します。
3. LIVE / DEAD染色のために、すすぎ、製造元の指示に従って調製し、DAPIでLIVE / DEAD染色溶液20μlを注入する20μlのPBSでピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュし、37℃で30分間インキュベートし、すすぎデバイスを再び20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を用いた装置です。
4. 胆汁カナリについてCuLi等の染色、DAPIで2μMCMFDA染色溶液20μlを注入、すすぐために20μlのPBSをピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュするには、製造元の指示に従って調製し、37℃で30分間インキュベートし、再びデバイスをすすぎます20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を使用してデバイス。
5. 使用済み培地を収集し、細胞機能を決定するための培養期間にわたって、適切な時点での細胞代謝産物を測定します。肝細胞の場合は、使用済み培地中のアルブミンおよび尿素の量を測定します。
6. このような酵素活性レベル、抗体染色、またはRNA分析を評価するように細胞自体上のエンドポイント機能解析を実行します。肝細胞は、誘導し、シトクロムP450酵素活性または第II相抱合酵素グルタチオンSトランスフェラーゼを測定します。

結果

天然コラーゲンは、層ごとの堆積に使用するためのポリカチオンおよびポリアニオンコラーゲン溶液を作成するために、メチル化及びスクシニルを使用して変更することができます。サクシニル化は、スクシニル基を有する天然コラーゲンのεアミノ基を変更して、メチル化は、メチル基（ 図1A）と天然コラーゲンのカルボキシル基を修飾します。コラーゲンタンパク質のアミノ酸側鎖のこれらの修飾は、ソリューションのpH滴定曲線を変化させます。メチル化は、アミノ基に影響を及ぼさないし、カルボキシル基の数を減少させながら、スクシニル化は、天然コラーゲン（ 図1B）と比較して、アミノ基の数を減少させ、カルボキシル基の数を増加させます。これらの修飾は、コラーゲン分子の電荷特性を変化させます。サクシニル化は、正に荷電した基を除去し、負に帯電した基に置き換え、およびメチル化は、負に帯電した基を除去し（ 図1C </強いです>）。

メチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液（COL LBL）の層ごとの堆積は、そのような...

ディスカッション

極薄純粋なコラーゲンアセンブリが​​変更されたコラーゲンのレイヤーバイレイヤー堆積を用いて帯電した細胞または材料表面上に堆積することができます。この研究の結果は、メチル化及び天然コラーゲンのスクシニル化は、細胞（ 図2）上の極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを堆積させるために層ごとの手法で使用することができる（ 図1）または他の荷電したポリカチオンとポリアニオン性コラーゲン溶液を作成することを実証材料表面。このような極薄マトリックス層は、肝細胞（ 図3）、その機能と同様に、マイクロ流体デバイス内に播種した後（ 図4）のような細胞の形態、生存能力、及び偏光を安定化させることができます。

極薄コラーゲン層の堆積のために成功し、メチル化およびスクシニル化コラーゲンを生成する改質反応が重要です。カルボキシル基のメチル化反応が良好でないためコラーゲンメチル化反応はル・シャトリエの原理に基づいて、正反応を駆動するために、酸性化メタノール中で行われなければなり...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲンI型、ラットテール	ライフテクノロジー	A1048301	濃縮ラットテールコラーゲン
I型オプション、ラットテール	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	濃縮ラットテールコラーゲン
I型オプション、ラットテール	EMDミリポア	08-115	濃縮ラットテールコラーゲン
I型オプション、ラットテール	R%Dシステム	3440-100-01	濃縮ラットテールコラーゲン
ハク酸無水物	Sigma-Aldrich	239690-50G	サクシニル化試薬
無水メタノール	Sigma-Aldrich	322415-100ML	メチル化試薬
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH 沈殿試薬
塩酸	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH沈殿試薬
ラットコラーゲンI型 コラーゲン	含有量を検出するための	Chondrex	6013
ヒドロキシプロリンアッセイキット	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	コラーゲン含有量検出オプション
ヒドロキシプロリンアッセイキット	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	コラーゲン含有量検出オプション