生体分子の時間的に制御された放出のための界面高分子電解質繊維の複合足場

サマリー

スキャフォールドは、細胞ニッチの複雑な生化学的および生物物理学的な微小環境を再現する必要があります。ここでは、界面高分子電解質錯体化繊維をプラットフォームとして使用して、持続的な生化学的放出を伴う複合多成分高分子足場を作成する方法を示します。

要約

組織工学で使用される様々な足場は、生理学的細胞ニッチを模倣するために制御された生化学的環境を必要とします。界面高分子電解質錯体化(IPC)繊維は、低分子薬物、細胞、タンパク質、成長因子などのさまざまな生物学的薬剤の制御された送達に使用できます。IPCファイバーの製造方法がシンプルなため、制御された生体分子送達への適用に柔軟性があります。ここでは、親水性多糖類と疎水性ポリカプロラクトンという2種類の高分子足場にIPC繊維を組み込んで、多成分複合体足場を作製する方法について述べる。私たちは、IPC繊維がこれらの高分子構造に容易に埋め込まれ、生体分子の持続放出と保存の改善能力を高めることを示しました。また、トポグラフィーの手がかりと持続的な生化学的放出を備えた複合高分子足場を作成し、細胞の挙動に相乗的な影響を与えることができました。IPCファイバーと複合ポリマー足場は、細胞ニッチを再現する斬新でシンプルな方法です。

概要

細胞外マトリックスは、細胞の振る舞いを指示する固有の生化学的および生物物理学的な手がかりを持っています。この生理学的3次元(3D)微小環境を模倣することは、再生医療および組織工学の応用において広く探求されている戦略です。例えば、天然由来の基質と合成基質の両方が、生物物理学的な細胞環境を模倣する手段として、トポグラフィーの手がかりを用いて改変されてきました。¹ 例えば、ポリカプロラクトン(PCL)足場は、パターニングされたPDMS基材上にキャストすることで容易にパターニングできます。² しかし、ほとんどの合成足場は、in vivoで制御された生化学的環境を不適切に再現しています。合成材料のバルク修飾または表面修飾は、細胞接着の生化学的な手がかりを示すだけで、生化学的送達の時間的な調節はまだありません。³ したがって、細胞外マトリックスの時間的に制御された生化学的送達システムを模倣できる最適な足場が必要です。

マイクロスフェアのような生化学的送達システムは、多段階の合成プロセスの厳しさと複雑さによる生物活性の喪失と低い取り込み効率の問題に悩まされています。^4-6 ワンステップの作製および組み込み法を使用する代替方法は、組み込みにおける非効率性および生物活性の喪失を伴うことなく、好ましい生化学的微小環境を作り出す優れた可能性を有することが証明された。実行可能な解決策の1つは、界面高分子電解質錯体化(IPC)繊維を使用して生物学的薬剤を送達および保護することです。2つの反対に帯電した高分子電解質水溶液を一緒にすると、IPCファイバーが界面から引き出されます。水溶液中のほぼすべてのタイプのヒドロフル生体分子を負または正に帯電した高分子電解質溶液に添加できるため、錯体化プロセス中に有用な生体分子をIPCファイバーに組み込むことが容易になります。さらに、このプロセスでは、水性条件と周囲条件のみが必要なため、生物活性が失われるリスクが軽減されます。この方法を用いて、活性成長因子^2,7、さらには細胞^8,9が首尾よく送達されている。さらに、IPC繊維を成形する簡単な方法により、任意の形状または向きに成形できます。このような繊維の安定性は、疎水性²と親水性^{ポリマー7}の両方に組み込んで複合足場を作り出すのに有利であった。IPC繊維を使用したこれらの複合足場は、細胞の物理的な固定を提供しながら、生理学的に関連性のある生化学的環境を作り出すのに有益です。

この研究では、活性生体分子の制御された放出のために、親水性および疎水性の足場にIPC繊維を組み込む方法を示します。概念実証として、キトサンとアルギン酸塩から作られたIPC繊維を、生体適合性、非免疫原性、非抗原性のプルラン-デキストラン親水性ハイドロゲルまたは生体適合性ポリカプロラクトン疎水性足場に組み込みます。

プロトコル

高分子電解質溶液の調製

1. 簡単に言えば。リャオらに詳述されるように、キトサンを精製し、グレード93濾紙を使用して、2％キトサンの1％（w / v）の溶液（v / v）の酢酸、真空フィルタを作成します。 pHは10分間1200×gで7遠心沈殿したキトサンに安定するまで5MのNaOHを使用して、ろ液を中和します。上清を除去し、キトサンを洗浄し、脱イオン水を加えます。遠心分離および洗浄工程をさらに2回繰り返します。 -80℃で析出したキトサンを凍結し、精製された形態を得るために、O / Nを凍結乾燥。除湿されたキャビネットに精製されたキトサンを保管してください。
2. 無菌の組織培養皿に精製されたキトサン1gを量り分けます。生物学的安全キャビネット内のUVランプにできるだけ近い組織培養皿にキトサンを置き、15分間UV光にさらします。滅菌ピンセットを使用し、ガラス容器に滅菌キトサンを配置します。 0を使用して濾過し、キトサンを溶解します。（w / v）の0.5％と1％の間の最終濃度15M酢酸。
3. アルギン酸ナトリウム塩を0.1gを秤量し、1％（w / v）の溶液を得、脱イオン（DDI）を蒸留水10mlに溶解します。完全な溶解を確実にするために、ボルテックスミキサー上に少なくとも2時間、アルギン酸ナトリウム塩を混ぜます。 0.2μmのシリンジフィルターを通してアルギン酸塩溶液をフィルタリングします。 4℃でのアルギン酸塩溶液を保管してください。
4. 製造業者によって推奨されるように、神経成長因子（NGF）、 - 例えば、血管内皮増殖因子（VEGF）またはベータなどのヒト組換え増殖因子を再構成します。

IPC繊維の2デッサン

1. 同様の正味の電荷を有する高分子電解質溶液の10〜20μlのアリコートに、タンパク質、成長因子または他の生体分子を混ぜます。正味の負電荷（例えば、ウシ血清アルブミン[BSA]）との生物学的分子は、アルギン酸塩溶液と混合されるべきです。正味の正電荷（例えば、VEGF）と生体分子と混合されるべきですキトサン溶液。
2. パラフィルムで覆われている安定した平らな面にキトサンおよびアルギン酸塩の少量のアリコート（10〜20μl）を配置します。キトサンおよびアルギン酸塩の液滴が近接していないが、互いに接触して配置されるべきです。
3. 軽くキトサンおよびアルギン酸液滴に鉗子のペアで各チップを浸します。鉗子をつまんで一緒に高分子電解質の液滴をもたらします。液滴が互いに接触すると、ゆっくりと2滴（ 図1A）の界面からIPC繊維を描画するために垂直上方鉗子を引きます。
4. （セクション3と4を参照）、このような回転マンドレル上に固定された平らな高分子足場として集電体上に鉗子、上に描かれたIPCのファイバの端部を慎重に配置します。均一のとIPC繊維ビードレス形成を可能にするために10ミリメートル/秒の一定速度でマンドレルを回転させます。 IPC繊維の描画速度を増加させると、Incorporatedのバースト放出の原因となる、ビーズを形成します生化学的および早期ファイバ終端^。10
5. 取り込み効率を決定するために、残りのすべての液体が1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を500μlで希釈して、パラフィルム上に残さ集めます。 BCAの（BSAのための）アッセイ、（VEGFおよびNGFのための）ELISAまたは組み込まれた生体分子を検出するための適切なアッセイを介して残留物中のタンパク質または成長因子の含有量を測定します。

プルラン、デキストラン（PD）多糖類とIPC繊維の複合ヒドロゲル足場の3製作

1. IPC繊維コレクションの犠牲プルランフレームを製作
   1. プルラン多糖を秤量し、20％（w / v）の水溶液を作成するために、蒸留脱イオン（DDI）水と混ぜます。均一性を確保するためにプルラン溶液O / Nを混ぜます。
   2. 直径10cmの組織培養ポリスチレン（TCPS）皿にプルラン溶液の15グラムをキャストします。 37℃でのプルラン溶液O / Nを乾燥させます。 7へのプルランフィルムをカット×7 mm角フレームミリ。
2. プルラン、デキストラン多糖溶液を調製します
   1. DDI水中：（1比3）プルランおよびデキストラン多糖の30％（w / v）の溶液を作成します。多糖溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。ゆっくりと（w / v）の20％の最終濃度を達成するために、多糖溶液に炭酸水素ナトリウムを追加。溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。 4℃での多糖溶液を保管してください。
3. プルランフレームにIPC繊維の収集
   1. ワニ口クリップを使用して犠牲プルランフレーム（3.1節）を貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレルの先端にワニ口クリップとプルラン枠を貼り付けます。 10ミリメートル/秒の一定速度で取り付けられたフレームと、マンドレルを回転させます。プルランフレームは、所望の方向で回転するマンドレル上に固定することができます。
4. ピンセット（セクション1）とATTACを使用してIPC繊維を描きます時間回転プルランフレームにIPC繊維の描かれた終わり。一定速度でIPC繊維を描画します。 IPCファイバの終端に到達すると、RTでファイバ·オン·フレーム構築O / Nを乾燥させます。
5. PDヒドロゲル足場にIPC繊維を埋め込みます
6. プルラン、デキストラン溶液のすべてのグラムを架橋するために、ナトリウムトリメタホスフェート水溶液と100μlの10M水酸化ナトリウム（w / v）の11％の100μlを添加する^。7 1〜2分間stirplateを用いて60 rpmで溶液を混合。トリメタリン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを添加した後、多糖類溶液は、ほとんどすぐに架橋します。 IPC繊維を完全に埋め込むための繊維·オン·フレーム構造物上に粘性多糖溶液を注ぎます。化学架橋複合足場（ 図1B）を形成するために30分間60℃で混合プルラン、デキストランIPC繊維（PD-IPC）をインキュベートします。
7. 注意：ヒュームフードのステップ3.3.2を実行し、適切な保護エクイを使用酢酸等のpmentは腐食性、可燃性です。
8. PD-IPC足場における細孔の形成を誘導するために、20分間、20％（w / v）の酢酸を全体足場を沈めます。
9. 100rpmで振とうしながら5分間、1×PBSでPD-IPC足場を洗浄することにより未反応試薬を除去します。このステップを2回繰り返します。
10. 過剰のPBSを除去し、直ちに-80°CO / NでPD-IPC足場を凍結。足場に任意の制御放出または生物活性アッセイに使用する前に少なくとも24時間を凍結乾燥。

PCLおよびIPC繊維の複合骨格の4製作

注意：ジクロロメタンは危険物です。ジクロロメタンを取り扱う際にヒュームフードや個人用保護具を使用します。

1. 自然のままとパターン化PDMS基板を作成
   1. ソフトリソグラフィプロセスを使用して所望の寸法のTCPの一部を使用して、自然のままのポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー基板を作成します。パットの作成希望の地形とテンプレートポリ（メチルメタクリレート）で、標準的なソフトリソグラフィ法を用いて、rned PDMS基板を¹²
2. IPC繊維収集のための犠牲PCLフレームを製作
   1. PCLを秤量し、（w / v）の溶液を、0.9％を作成するために、ジクロロメタンに溶解します。 PDMS基板の各1cm ^2の面積については、0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。所望の厚さに膜を厚くするために0.9％のPCLの鋳造プロセスを繰り返します。 PDMS基板から乾燥PCLフィルムを取り外します。適切にサイズのパンチャーを使用してPCLフレームに穴を作成します^。2
3. PCLフレームにIPC繊維の収集
   1. ワニ口クリップで（4.2.1）から穴犠牲PCLフレームを貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレル上にワニ口クリップを貼り付けます。 PCL FRAMにIPC繊維の描かれた端を取り付け10ミリメートル/秒（セクション2）の一定速度で回転を開始する前に、E。 IPC繊維描画終了後、4℃での繊維·オン·フレーム構造物O / Nを乾燥させます。
4. 埋め込み繊維·オン·フレームは、パターン化されたPCL基板内に構築します
   1. 必要に応じて、自然のままの、またはパターン化されたPCLベースを作成するために、PDMS基板上に0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。所望の厚さの足場を得るために、0.9％のPCL溶液の複数の層をキャスト。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。
   2. PCLベースの上に、繊維·オン·フレームの構築物（4.3.1）を配置します。所望の厚さを得るために複数回を構築するファイバ·オン·フレームの上に0.9％のPCL溶液を添加し、完全にPCL-IPC複合骨格（ 図1C）の製造、IPC繊維を埋め込 ​​みます。

コンポジットIPC足場からの生物学的薬剤の放出5.測定

1. 複合PD-IPCを置きますかPCL-IPC足場とスタンドアロンIPC繊維を別々に24ウェルプレート中。
2. 足場を浸し、スタンドアローンIPC繊維を1×PBSを500μlと。 37℃でサンプルをインキュベートします。種々の時点（リリースメディア）でPBSを収集し、1×PBSを500μlと交換してください。
3. 組み込まれた生体分子の累積放出プロフィールを計算するためにBCAアッセイ（BSA）、ELISA（VEGFおよびNGF）又は他の適切なアッセイを使用して、放出媒体中のタンパク質または成長因子の量を測定します。

コンポジットIPC足場上の細胞の6播種リリース生物学的薬剤の生物活性をテストします

1. 少なくとも20分間、生物学的安全キャビネット内のUV光を用いて凍結乾燥したPD-IPCまたはPCL-IPC複合足場を滅菌します。
2. 200μlの増殖培地中に2×10 ⁵細胞の細胞懸濁液を得るために、標準的な細胞培養技術を使用します。複合足場の上に濃縮された細胞懸濁液をシード。 AFTER 20分、完全に足場を水没する増殖培地のトップアップボリューム。
3. このようなアラマーブルー代謝活性アッセイ、PC12神経突起伸長アッセイまたは免疫蛍光などの標準的な技術を介して細胞活性を測定します。

結果

本稿では、様々な生体分子の持続放出のためのIPC繊維との複合足場を作成しようとしました。本研究で用いた生体分子の特性を表1に見出される。IPC繊維が最初PD-IPC複合足場（ 図1B）を作成するために、親水性PDヒドロゲル中に包埋しました。モデル分子BSAは、第1の被制御生体分子の放出のための複合足場を使用することの実現可能性を決定するために試験しました。 BSAは45±0.97パーセントの効率でPD-IPC足場に組み込まれました。 PD-IPDから放出されたBSAは、付随的定常状態が続く最初の弱毒化されたバースト放出（ 図2）とほぼリニア動態を示しました。 2ヶ月後、BSAは97％の全放出を達成しました。対照的に、スタンドアロンIPC繊維が4時間以内にBSAの80％の急速な放出を示しました。

次に、我々は、PD-IPCのscaffoを使用して、VEGFの放出プロファイルと生物活性をチェックLDS。 VEGFは、75.5±2.7％の効率で組み込まれ、少なくとも1週間（

ディスカッション

IPC繊維は、2つの反対に帯電した高分子電解質との相互作用によって形成されます。プロセスが安定した繊維形成のための自己組織化プロセスを容易にする、高分子電解質の界面からの複合体の抽出を利用します。 IPCの繊維形成の機構は同様に荷電した高分子電解質に添加される任意の生体分子は、錯体形成プロセス中に組み込むことができることを保証する^。10,11逆に、反対に荷電した高分子電解質中への生体分子の添加は、瞬間的な沈殿が生じます。 IPC繊維のための簡単​​な製造方法には、細胞、増殖因子および小分子などの様々な生物学的材料を組み込んで汎用性を貸します。 IPC繊維のこの重要な特徴は、異なる物理的および生体分子の性質（電荷および分子量）と成長因子を高い効率で取り込まれたPD-IPCとPCL-IPC複合足場の両方で観察されました。コントラでSTは、VEGFおよびNGFのためのマイクロスフェアの方法論を使用してカプセル化効率は、それぞれ^、16％6および^8〜13％と低くすることができます。

PD-IPCとPCL-IPC足場の両方は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プルラン	林原株式会社 岡山		分子量 (MW) 200 kDa.この材料は、プルランフレームとPD-IPC足場の製造に使用される医薬品グレードのプルランです。
デキストラン	シグマアルドリッチ	D1037	MW 500 kDa。この材料は、シグマ・アルドリッチ社では製造されていません。推奨される代替案は、カタログ番号31392(Sigma Aldrich)です。この材料は、PD-IPCの足場を作るために使用されます。
重炭酸ナトリウム	Sigma Aldrich	S5761	重炭酸ナトリウムをプルラン-デキストラン多糖類溶液にゆっくりと加える必要があります。重曹を急に添加すると、降水量が発生します。
ナトリウムトリメタホスフェート	グマアルドリッチ	T5508	化学物質は吸湿性であり、除湿キャビネットに保管する必要があります。トリメタリン酸ナトリウムの水溶液は、常に新鮮にする必要があります。
水酸化ナトリウム	Sigma Aldrich	S5881	この物質は危険であり、ニトリル手袋などの適切な保護具で取り扱う必要があります。
キトサン	シグマアルドリッチ	448877	MW 190-310 kDa。アセチル化度は75%から85%。キトサンの精製は、安定したIPC繊維を作成するために必要です。
酢酸メル	ク		これは別のブランドタイプに置き換えることができます。この材料は腐食性で可燃性です。この化学物質をドラフトで取り扱うときは、フェイスシールド、ニトリル手袋、白衣、靴カバーなどの保護具を着用する必要があります。
褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム塩、低粘度	シグマ アルドリッチ	A2158	水に一晩溶かします。滅菌済み0.2 &マイクロ;使用前にMシリンジフィルター。4°Cで保管してください。
ウシ血清アルブミン	Sinopharm化学試薬		滅菌PBSに溶解し、0.2µを使用してろ過します。使用前のmシリンジフィルター。
BCAアッセイキット	Pierce	23225	このキットは、PD-IPC足場からのBSA放出を測定するために使用されました。
ヒト組換え血管内皮成長因子	R&D systems	293-VE	成長因子を 0.2% ヘパリン溶液に溶解し、最終濃度 5 mg/mLです。
豚のヘパリンナトリウム塩	Sigma Aldrich	H3393	これは、別のブランドタイプに置き換えることができます。ヘパリン塩を最終濃度1%の滅菌水に溶解し、0.2µでろ過します。使用前のmシリンジフィルター。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)	ロンザ	C2517A	この初代細胞タイプは、PD-IPC足場からの放出後のVEGF生理活性を測定するためのアッセイで使用されました。
アラマーブルー	ライフテクノロジー	ズ DAL1025	これは、細胞の代謝活性を測定するために使用されます。Alamar blueを細胞とインキュベートし、標準的な細胞培養条件で2〜4時間維持します。570 nmでの吸光度を測定して、細胞活性と相関するアラマーブルーパーセントの減少を決定します。
ScanVac Coolsafe 凍結乾燥機	Labogene	7.001.200.060	これは、-105 から -110  で動作するプログラム不可能な凍結乾燥機です。°C.これは、他の標準的なラボ用凍結乾燥機に置き換えることができます。
ポリカプロラクトン(PCL)	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa.これは、シグマ・アルドリッチによって製造されなくなりました。これは、Sigma Aldrich カタログ番号 704105 に置き換えることができます。
ジクロロメタン	シグマ アルドリッチ	V800151	これは別のブランドタイプに置き換えることができます。この物質は危険であり、ドラフト内で取り扱う必要があります。この化学物質を取り扱うときは、常に保護具を着用する必要があります。
ポリジメチルシロキサン(PDMS; 184シリコーンエラストマーキット)	ダウコーニング	(240)4019862	エラストマーキットにはポリマーベースと架橋剤が付属しています。ポリマーベースと架橋剤を異なる比率で混合すると、PDMSの剛性が異なります。
ヒト組換えβ神経成長因子(NGF)	R&Dシステム	256-GF	DI水で最終濃度100に再構成 &マイクロ;g⁠/⁠ml.アリコートと-20 °で保存します。使用までC。
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)	Cambrex		この細胞タイプは、NGFとナノトポグラフィーの相乗効果を決定するためにアッセイで使用されました。
ラットPC12褐色細胞腫細胞	ATCC		この細胞型は、NGFの生理活性を測定するための神経突起伸長アッセイで使用されました。NGFを含む放出培地に曝露した後、神経突起伸長を有する細胞の数を測定し、細胞の総数に正規化します。
グレード93濾紙	Whatman	Z699675	これは、pH 7で水酸化ナトリウムで沈殿した後のキトサンの精製に使用されます。
スイングバケット遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	1,200 x gの速度を使用してキトサンを精製する際に使用します。
マンドレル付きモーター 定速回転	Rhymebus	RM5E	モーターは、プルランまたはPCLフレーム上のIPCファイバーの製造に使用されます。
リン酸緩衝生理食塩水	FirstBase		ろ過による滅菌(0.2 µmフィルター)とオートクレーブ。
直径10mmの組織培養ポリスチレンディッシュ(TCPS)	グライナー		TCPSディッシュはプルランフレームの鋳造に使用されます。
ヒトVEGF ELISAキット	R&Dシステム	ズDVE00	ELISAキットは、放出媒体中のVEGFの検出に使用されます。
ヒトNGF ELISAキット	R&D systems	DY256	ELISAキットは、放出媒体中のNGFの検出に使用されます。
プラスチック被覆粘着テープベル	アート	9040336	粘着テープは、ワニ口クリップを回転マンドレルにしっかりと貼り付けるために使用されます

シこの滅菌