次のプロトコルは、二次元(2D)と三次元(3D)の細胞環境の中間段階として使用されるサンドイッチ状の培養物を組み立てる手順を説明しています。設計されたシステムは、顕微鏡、バイオメカニクス、生化学、細胞生物学アッセイに応用できます。
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この記事について
サマリー
要約
細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。
この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。
概要
インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。
2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化....
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プロトコル
背の基板1の製造
- 溶媒キャスティングによるPLLAのフラットフィルムの製造。
- 完全に溶解するまで（約3時間）、室温（RT）で攪拌し、クロロホルム中の2％（w / v）のPLLA（100mLのクロロホルム中の2gのPLLA）の溶液を調製し、ドラフト中で作業。
- ガラスシャーレ上にワッシャーを配置します。
注：（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径で使用ステンレス鋼ワッシャをワッシャが腹側基板の上に配置されるようになっています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）またはガラス洗濯機のような他の材料も同様に使用することができます。 - 洗濯機でPLLA溶液200μlを加え、室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。溶媒をゆっくり蒸発を可能にするために、いくつかの穴を持つアルミホイルでペトリ皿を閉じ。
- 溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。
- サンプルはクールやってみましょうRTでWN。
- サンプルは（30分程度）まで冷却した後、ペトリ皿中·cmの水18.2MΩで覆い、室温で8分間インキュベートします。
注：サンプルを完全に冷却されていない場合は、·cmの水18.2MΩを取るとゴム状態を採用することができます。さらに、8未満分·cmの水18.2MΩでインキュベートして、不適切な脱離で、ワッシャから離脱以上の8分なることがあります。 - かみそり....
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結果
サンドイッチ状の培養内の背側の受容体の刺激は、細胞形態の変化、細胞接着および細胞内シグナル伝達経路（ 例えば、焦点接着キナーゼ、FAK）10〜12をトリガーします。他の3Dの文化15,16のために観察されるような例として、サンドイッチ状システム内で培養した線維芽細胞は、2Dと比較して、α5インテグリンサブユニットを過剰発現しました。
細胞の運命は、ヒドロゲルなどの他の3Dシステムで起こるのと同様に、背側の受容体が刺激される時間におよび背側の相互作用の性質によって大きく依存しています。例えば、タンパク質が強固に結合されたヒドロゲルは、通常、未開発のアクチン細胞骨格と小さく、丸みを帯びた細胞を示し、焦点癒着を拡散します。細胞は機械的に、このタンパク質の層と細胞spreaを再編成することができないようにするために、しっかりとタンパク質を吸着基板を用いたサンドイッチ状培養中で模倣することができます鼎が阻害されます。同様に、細胞がECMを再構築することができるヒドロゲルはタンパク質をより緩やかに10.......
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ディスカッション
現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これらの欠点のいくつかを克服しようとしている新しい培養システムを開発することは非常に重要です。
サンドイッチ様培養物は、細胞分化、細胞形態、細胞シグナル伝達および細胞遊走などの重要な細胞プロセスに強く影響を及ぼすことが示されています。サンドイッチ状文化が3D培養システムと2Dを結ぶという声明を支持する3Dシステムで培養した細胞とさらに細胞株の類似性。生理的な組織が3〜14のμの範囲の孔を有しますしたがって、細胞を制約し、mは、そのような移行などの細胞プロセスに影響を与えます。これは、何らかの形で背側と腹側の刺激のようにサンドイッチ状システムを使用して再現しさそれ自体が細胞の形態を制限し、必ずしもかかわらず、タンパク.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
HealInSynergy(306990)およびFPUプログラムAP2009-3626を通じたERCからの支援が認められています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| プロイ(乳酸) | ネイチャーワークス | 4042D | 試薬 |
| カバーグラス (12 mmØ) | マリエンフェルド | 631-0666 | 機器 |
| クロロホルム | シャーラブ | CL0200 | 試薬 |
| 1,1,1,3,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP) | シグマ | 105228 | 試薬 |
| シリンジ(1ml) | ヘンケサスウルフ | 4010-200V0 | 機器 |
| シリンジポンプ | ニューエラポンプシステム | NE1000 | 機器 |
| 高電圧DC電源 | グラスマン高電圧 | シリーズFC | 機器 |
| インキュベータ | ーHucoa-Herlös | 3111 | 機器 |
| 層流 フード | Telstar | AV30/70 | 機器 |
| ヒト フィブロネクチン | Σ | F2006 | 試薬 |
| RNeasy マイクロキット | Qiagen | 74004 | 試薬 |
| 倒立顕微鏡 | ライカ マイクロシステムズ | DMI 6000 | 機器 |
| Triton X-100 | Σ-Aldrich | T8787 | 試薬 |
| アルブミン | Sigma-Aldrich | A7409 | 試薬 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 試薬 |
参考文献
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J.
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再版と許可
