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方法論記事

内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

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DOI：

10.3791/53100

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2015年9月18日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

この記事について

サマリー

私たちの目標は、内皮細胞の捕捉のための強磁性体のステントを設計、製造、テストしました。十ステントは、骨折のために試験し、10以上のステント保持磁力を試験しました。最後に、10のステントは、 インビトロで試験したところ、8複数のステントは、細胞捕獲および保持を示すために、4匹のブタに移 ​​植しました。

要約

心血管ステントの急速な内皮化は、ステント血栓症を低減し、出血のリスクを減らすことができる抗血小板療法を回避するために必要とされます。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）で標識された内皮細胞の伸長（EOC）を取得し、保持するために磁力を使用することの実現可能性は、以前に示されています。しかし、この技術は、迅速な内皮化を証明するために、in vitroおよびin vivo試験に続いて、磁性および生体適合性の材料から機械的に機能的なステントの開発が必要です。我々は、コンピュータ支援設計（CAD）を使用して、2205二相ステンレス鋼から弱い強磁性ステントを開発し、その設計は、さらに、有限要素解析（FEA）を用いて精製しました。ステントの最終的な設計は、機械的圧着し、拡張中に材料の破壊限界以下の主ひずみを示しました。百ステントを作製し、それらのサブセットは、機械的試験のために使用した、RETained磁場測定、 インビトロ細胞取り込み研究及びインビボ移植実験。十ステントは、それらが故障せずに圧着し、膨張サイクルを持続かどうかを確認するために展開するために試験しました。別のステント10は、強力なネオジム磁石を用いて着磁し、その保持磁界を測定しました。ステントは、保持磁力が我々のインビトロ研究においてSPION標識EOCを捕捉するのに十分であったことを示しました。 SPION標識EOCを捕捉および保持を4匹のブタのそれぞれに1着磁ステント1の非磁化対照ステントを移植することにより、大型動物モデルにおいて確認されました。ステント動脈を7日後に外植し、組織学的に分析しました。本研究で開発した弱磁性のステントは、誘致し、迅速な治癒を促進することができるSPION標識内皮細胞を保持することができました。

概要

ステンレス鋼、コバルトクロム、プラチナクロムなどの血栓形成材料から製造された血管ステントを移植された患者は、どちらもベアメタルステント(BMS)と薬物溶出ステント(DES)の両方であり、血栓形成を防ぐための抗血小板療法が必要です。 BMSは急速に治癒しますが、治癒が不完全であるため、後期再狭窄の影響を受けます。 DESは治癒が遅れるため、長期の抗血小板療法が必要です。 治癒が不完全または遅延した結果として血栓症を避けるために投与される抗血小板療法は、出血リスクの増加につながり、特定の患者には適さない場合があります1,2。 理想的なステントは完全かつ迅速に治癒するため、長期の抗血小板療法や後期の再狭窄を回避できます。 この完全な治癒は、移植後にステントが内皮細胞の単層で急速にコーティングされている場合にのみ達成できます。 ステントを金や他の生体高分子などの生体適合性材料でコーティングすると、血栓抵抗性が改善することが示されていますが、これらの技術のいずれも、内皮細胞でコーティングすることによって可能になる可能性のある理想的な血液適合性を達成しませんでした3,4。

ステントは、循環する前駆細胞を引き寄せることにより、移植後に内皮細胞でコーティングすることができます。 このセルフシーディング技術は、リガンドと抗体を利用することで実現できます。 しかし、この手法は、循環する内皮前駆細胞の数が少ないために制限されています。 有望な戦略は、移植直後の短時間の血流閉塞3,5の間に細胞を直接ステントに送達することです。 この戦略には、血流を回復した後でも細胞を迅速に捕捉し、ステント上に保持する技術が必要です。 私たちは、磁気ステントを使用して、移植後に送達された磁気標識内皮細胞を引き付けて保持する技術を開発しました。 これを達成するためには、磁気標識内皮細胞を捕捉し保持するのに十分な磁気特性を有する機能的BMSが必要である6。

この論文では、2205ステンレス鋼ステントの設計、製造、および試験の方法について説明します。 ステントはCADとFEAを使用して設計されました。 作製したステントをネオジム磁石で着磁し、磁気抵抗マイクロセンサープローブで保持磁場を測定しました。 次に、インビトロ実験中に、ステントを培養皿内で磁気標識細胞捕捉について試験しました。 最後に、ステントを生体内で試験し、4頭のブタに磁性ステントと非磁性ステントを埋め込み、ステント留置動脈を組織学的に分析しました。

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プロトコル

すべての動物実験は、メイヨークリニックでの動物実験及び利用委員会（IACUC）によって承認されました。

2205ステンレス鋼ステントの1設計と解析

  1. CADを使用して、ベアメタルステントの設計
    1. ステントストラットの厚さに等しい壁厚に「押し出されたボス/ベース」機能を選択することにより、押し出された中空円筒を行います。
    2. 押し出された円筒に対して接線方向に異なるスケッチ平面上のステントパターンを設計します。押し出された中空円筒の円周に合わせて、フラットパターンの幅を確認します。
    3. ラップ機能を使用して中空シリンダー上にフラットパターン設計を転送します。
    4. FEAのためにエクスポートするために、そのネイティブフォーマットでも、ACISフォーマットの一部を保存します。
  2. ステントモデルの有限要素解析
    1. さらにanalysためFEAソフトウェアの一部のモジュールにACIS形式で保存されたソリッドジオメトリをインポートです。
    2. FEAソフトウェアの一部モデラーでステントにモデル2の分析シリンダ同軸。外筒は、クリンパと内筒の膨張バルーンをシミュレートするために1mmの初期直径を有するシミュレートするためにステントの直径よりも大きい初期直径を有しています。
    3. 上記を組み立てる組立モデラーの「インスタンス」ツリー項目をダブルクリックして、相対的な位置で部品を述べました。
    4. FEAソフトウェアのメッシュモジュールを使用し、低減積分で20ノードの六面体エレメントとしての要素型を指定し、要素のサイズを指定し、ステントメッシュ。
    5. ステントとモデルツリーの「相互作用のプロパティ」で、それぞれ2つの気筒間の摩擦の剛性接点ペアを指定します。
    6. ステントモデルに2205ステンレス鋼の弾塑性応力 - ひずみ挙動を割り当てます。
    7. まずCをシミュレートする1​​ミリメートルに外筒を圧着するための境界条件を定義します。ステントのリンピン。クリンプステントの緩和をシミュレートするために、外筒を取り外します。展開をシミュレートし、最終的には、ステントの反動をシミュレートするために、内筒を除去するために、3mmの内筒を展開します。
    8. 「分析」モデルツリーの項目に割り当てられたプロセッサとRAMの量の数を含む、シミュレーションパラメータを定義し、シミュレーションを実行します。
    9. シミュレーションが完了すると、結果は主要な系統を研究し、反復的物質の故障限界未満である20％の主ひずみを達成するために、ステントの設計を改善するために、結果ファイル（filename.odb）及び後処理を開き。

圧着および拡張のための2ステントの作製とテスト

  1. ステントの製造
    1. このようなパイオニアでアクション精密製品等の精密加工会社に銃の掘削および精密研削バーストック材料によって2205ステンレス鋼管を取得し、OHです。
    2. レーザー切断と電解研磨のためにこのようなウォーキーガン、イリノイ州のLaserageテクノロジー社としてステント切断会社に精密研磨管とフラットパターンのステント設計を転送します。
    3. さらに10分間塩基（10％のNaHCO 3）、続いて10分間、強酸（50％塩酸）でそれらを浸すことにより、電解ステントの表面を不動態化します。注意：適切な保護具を持つとヒュームフードの下に化学物質を扱います。最終的には、エチルアルコールと脱イオン水を用いてステントを洗浄します。このプロセスは、酸洗いと呼ばれています。
  2. 圧着および拡張のために製造のステントのテスト
    1. 圧着工具、手持ちを使用してつ折りバルーン上にステントを圧着します。ステントと圧着工具でつ折りバルーンを保持します。放射状にバルーン上に圧着されるように、ステントを変形させるためにハンドルを押します。
    2. 均一な圧着用顕微鏡とによる構造の故障の兆候を使用してクリンプステントを検査塑性変形します。
    3. 水でつ折りバルーンを加圧して3mmの設計直径にそれを展開します。微細な骨折および均一な拡張のための拡張したステントを調べます。

留保磁場用ステントの3キャラクタリゼーション

注：2インチ、直径1インチの高さの円筒磁石は、この研究において使用しました。磁石の極は、軸に沿って整列されています。磁石の表面磁束密度は約1であるT.

  1. 強力なネオジム磁石を使用して、直径又は軸方向にステントを磁化。磁化のため、約1分間の強力な磁石に近いステントを保持します。
  2. 直径磁化又は軸方向にそれを磁化する磁力線に沿ってその軸と円筒面の隣にステントを保持する磁力線に沿ってその直径を平らな面の一つにステントを保持します。留保磁気金融商品取引法ステントの開発は、少なくとも24時間安定であるが、磁化後できるだけ早くステントを使用することが見出されました。
  3. ガラスマンドレル上に個別にステントをマウントして、磁気探査治具の精度チャックにガラスマンドレルをマウントします。磁気マイクロプローブは、正確にXYZを用いて表面に触れることなく、ステントの近くに配置することが可能な磁気探査固定具（ 図4）の組み立てをステージ。
  4. 遠く離れたステントからの磁気マイクロのベースラインの読みを測定した後、磁気探査治具のXYZステージを使用してプローブを配置することによって、ステントの表面に保持する磁界を測定します。

4.磁気細胞キャプチャー研究

  1. 入手細胞、蛍光色素でSPIONおよび染色による標識
    1. 5,7で説明したように、ブタの末梢血から内皮成長細胞（EOC）を求めよ。 unti T-75フラスコで培養リットル約80％コンフルエント（5×10 6 6 8×10個の細胞）。
    2. 10 nmの直径のマグネタイト （Fe 3 O 4）8,9に記載のように厚さ50nmのポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）シェルによって囲まれたコアとしてSPIONsを合成します。
    3. 37 O℃で16時間、細胞培養培地に200μg/ mlの濃度でSPIONと導出EOCインキュベート
    4. 静かに細胞培養培地を吸引除去します。優しく、フラスコにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10mlを加える揺動し、PBSを吸引することにより細胞を洗浄します。
    5. 実験中に可視化するための蛍光色素（CM-DiIを）で細胞を染色します。これは、5μL/ mlの濃度で細胞培養培地10mlに染料を添加し、37℃で30分間細胞をインキュベートすることにより、製造業者の指示に従って行われます。
    6. ステップ4.1.4のようにPBSで細胞を洗浄し、37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA溶液3mlでインキュベートフラスコから細胞を持ち上げます。
    7. 細胞ペレットを形成するために、5分間500×gで15ミリリットルコニカルチューブ、PBSでトップオフ、および遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。
    8. 1-2x10 6細胞/ mlの濃度でPBS中に細胞ペレットを再懸濁し、数回にし、円錐管からピペッティングにより完全に混和します。
  2. インビトロ細胞試験
    1. （例えば、3D印刷）だけカバーガラスの表面上にステントを保持するための簡単な治具を設計・製作してください。
    2. 電磁消磁装置を使用してステントを消磁や強いネオジム磁石を使用して、直径又は軸方向にステントを磁化。
    3. 軸方向に磁化さや直径磁化または非磁化対照ステントを含む皿にPBSに懸濁SPION標識EOCをピペット。画像倒立蛍光顕微鏡を用いて蛍光についてすぐにPBSに懸濁EOCを有するステント。
5。 生体内で動物研究

  1. ステント移植
    1. 4健康ヨークシャーブタからの末梢血を描く- 5,7で説明したように3週間前にそれぞれ移植し、ステントと文化EOCする-約50キロで計量。
    2. （毎日アスピリン325mgのクロピドグレル75 mg）を、手術の3日前に開始する抗血小板薬を投与します。
    3. 該当機関の動物の管理と使用に関するガイドラインに記載されているようにステント移植の日には、筋肉内テラゾール、キシラジン、およびアトロピン（それぞれ5 / 2-3 / 0.05ミリグラム/ kg）で豚を麻酔。
    4. 挿管と1から2.5パーセントイソフルラン麻酔の吸入に豚を配置します。
    5. 豚の腹側ネック領域を剃ると、一般的な無菌状態で手続きを行っています。
    6. インプラント1は、標準的な心臓カテーテル技術を使用して右冠動脈（RCA）に着磁1非磁性ステント。
      1. Cathete動物のrizationは訓練されたインターベンション心臓病専門医が行ってください。 9フランスの鞘で右頚動脈にアクセスします。
      2. ターゲット冠動脈にカニューレを挿入し、透視画像を取得するためにヨード造影色素を注入します。
      3. 動脈内の0.014インチの標準冠状動脈ガイドワイヤを配置します。このガイドワイヤーを使用して、バルーンやステントを進め、3〜3.5ミリメートルの直径の容器内にステントを展開。
    7. ワイヤーバルーン上で使用して移植したステントへのRCA近位内の血流を閉塞し、2分間かけて、中央カテーテルを介して4mlのPBSに懸濁SPIONで標識された約2×10 6自家EOCを提供します。
    8. 追加の閉塞の2分後のRCAへの血流を復元します。
    9. 回復室に​​動物を移し、それは意識を取り戻したまで密接に動物を監視します。
    10. 抗血小板薬（アスピリン325mgのクロピドグレル75メートルの管理を継続しますg）を犠牲にするまで、術後。
  2. ステント植片および組織学
    1. 該当機関の動物の管理と使用のガイドラインに従って静脈内ペントバルビタールナトリウム（100mg / kg）の致死量を投与し、その後、以前に説明したように、第1の動物を麻酔により7日手術後、動物を安楽死させます。
    2. 外科的ステント付動脈セグメントを収穫。最低30分間​​10％ホルマリン緩衝液中に外植動脈を修正しました。さらなる組織学的分析のためにホルマリンバッファ内のサンプルを残します。
    3. 金属ステントと組織学を行うことのできる施設に固定された試料を外部委託しています。この処理の間、サンプルは、メチルメタクリレートに埋め込んされる断面に、鉄粒子のためのプルシアンブルー染色でマロリーの染色技術を使用して組織学的に分析しました。

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結果

FEA（ 図1）に基づく反復ステント設計は、圧着し、30％の最終的な株よりも小さい20％の主ひずみを拡張することができ、ステントを示しました。圧着及び拡張試験（ 図2）は 、破壊の徴候を示さありませんでした。変形したステントの写真は、FEA計算された変形と良い一致を示し、また、顕微鏡写真には、骨折に（ 図3）を示さありませんでした。保持磁界測定（ 図4＆5）から予想されるように、SPION標識細胞は、優先的に軸方向に磁化されたステントに曲がったセグメントに引き付けられ、より均一直径磁化ステント（ 図6）内の直線セグメントに魅了されました。組織学の画像は7日間の注入期間（ 図7）の間にステントにEOCの魅力と保持を証明するステント支柱の近くに鉄染色を示しました。

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ディスカッション

私たちは、ベアメタルステントとして機能することが可能とSPION標識内皮細胞を引き付けることができる磁気ステントを開発しました。磁気ステントを伴う以前の研究では、研究者が原因で、強磁性ステント5,10-14の使用不能に磁性材料で作られたニッケル被覆商業ステントおよびコイルまたはメッシュを使用しています。他のグループはまた、ナノ粒子ロード内皮細胞3を標的とするために、市販の304グレードのステンレス鋼ステントの常磁性の性質を使用しています。ニッケルコーティングは、ステントを受けている患者にアレルギー性であってもよく、常磁性のステントは、磁性ナノ粒子3,5を引き付け、維持するために外部磁界を必要としています。したがって、機能的な強磁性ステントの設計および開発は、細胞送達用途だけでなく、他の臨床応用10,15-20のために重要です。 2205ステンレス鋼 - - この研究のために選択された材料の二重の性質はwがそれを作ります強磁性eakly。そのような316Lステンレス鋼（70％）として6,21,22ステントを製造するために使用さ...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、貴重な貢献に対してTyra Witt、Cheri Mueske、Brant Newman、およびMBBS、PhDのPeter J. Psaltis博士に感謝します。 この研究は、欧州地域開発基金(FNUSA-ICRC)の財政的支援を受けました。CZ.1.05/1.100/02.0123)、米国心臓協会科学者開発助成金(AHA#06-35185N)、国立衛生研究所(T32HL007111)、グレインジャーイノベーションファンド–グレインジャー財団。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2205ステンレス鋼カーペンターテクノロジーコーポレーション丸棒ストック材料
Abaqusダッソーシステムソフトウェア
アトロピン処方薬。
クロピドグレル商品名:プラビックス。処方薬。
CM-DiILife TechnologiesV-22888分子プローブ、ユージーン、または
内皮成長培地-2ロンザCC-3162
ハンドヘルド圧着工具ブロックワイズ エンジニアリングM1-RMC
塩酸 (HCl)シグマ アルドリッチMFCD00011324注意: プロテクティブ デバイスを着用し、ヒュームフード
イソフルラン麻酔の下でハンドルを着用してくださいPiramal Critical Care, Inc. 
エチルアルコールシグマ アルドリッチMFCD00003568
NdFeB 磁石 2" Dia x 1" 厚さ素晴らしい磁石D1000P平らな面に極を持つ軸方向に磁化されたディスク磁石
Over-The-Wire 三つ折りバルーン市販の OTW 三つ折りバルーンを使用することができます
リン酸塩緩衝生理食塩水ライフテクノロジーズ 10010-023一般にPBS
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)として知られているシグマアルドリッチMFCD00003528
ペントバルビタールナトリウムゾエティス商業名:スリープアウェイ(26%)、FatalPlus、Beuthanasi。規制物質は、ライセンスを受けた獣医師のみが注文できます
SolidWorksDassault systemsソフトウェア
SpinTJ-020 マイクロセンサーMicroMagneitcs Sensible Solutionsロングプローブ STJ-020 マイクロセンサー
SPIONMayo Clinic内部で合成されたナノ粒子 (参照: Lee, S. J. et al. ポリ(D,L latide-co-glycolide) でカプセル化された磁性酸化鉄のナノ粒子磁気共鳴画像造影剤へのそれらの応用。J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004)
)TelazolZoetis認可された獣医師のみが注文する規制物質
Trypsin EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazineBayer Animal Health商業名: Rompun.認可された獣医によってのみ注文される制御されたサンスタンス

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