方法論記事

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

7.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/53105

⸱

2015年8月31日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

この記事について

サマリー

細菌のピオメラニン産生は、酸化ストレスと病原性に対する耐性の増加をもたらします。ピオメラニン産生の阻害を決定し、その結果生じる細菌の酸化ストレスに対する感受性の増加を分析するために使用できる技術について報告し、抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を決定します。

要約

ピオメラニンは、いくつかの細菌および真菌種によって生成される細胞外赤褐色の色素です。この色素はチロシン異化経路に由来し、酸化ストレス耐性の向上に貢献します。緑膿菌におけるピオメラニン産生は、2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)による治療を通じて用量依存的に減少します。細菌のピオメラニン産生を減少または廃止する薬物の濃度を決定するために、複数の濃度のNTBCを使用した滴定法について説明します。滴定法は、薬物濃度の増加に伴う顔料産生の目に見える減少という、容易に定量化できる結果をもたらします。また、細菌中の抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を測定するためのマイクロタイタープレート法についても説明します。この方法は最小限のリソースを使用し、簡単にスケールアップして、1つのマイクロタイタープレートで1つの細菌株に対して複数の抗生物質を試験することができます。MICアッセイは、特定の濃度での細菌増殖に対する非抗生物質化合物の影響をテストするように適合させることができます。最後に、H2O2を寒天プレートに組み込み、プレート上の細菌の複数の希釈点を見つけることにより、酸化ストレスに対する細菌の感受性を試験する方法について説明します。酸化ストレスに対する感受性は、H2O2を含まない対照と比較して、H 2 O 2を含有するプレート上の異なる希釈に対するコロニー数およびサイズの減少によって示される。酸化ストレススポットプレートアッセイは、最小限のリソースと低濃度のH2O2を使用します。重要なのは、再現性も良好であることです。このスポットプレートアッセイは、寒天プレートに化合物を組み込み、結果として生じる細菌の増殖を特徴付けることにより、さまざまな化合物に対する細菌の感受性をテストするように適合させることができます。

概要

緑膿菌はグラム陰性菌で、酸化ストレス1-4からの保護を助け、アミノグリコシド系抗生物質5-7を含むさまざまな化合物に結合する赤茶色の色素であるピオメラニンを含む様々な色素を生成します。ピオメラニン産生は、ホモゲンチゼート1,2-ジオキシゲナーゼ(HmgA)1,9をコードする遺伝子の欠失または突然変異、または経路10のさまざまな酵素の不均衡のいずれかを介して、チロシン異化経路4,8の欠陥によって引き起こされます。ホモジェンチゼートはHmgAの不活性化により蓄積し、分泌・酸化されてピオメラニン11を形成します。ピオメラニンの産生は、除草剤 2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン (NTBC)12 による治療を通じて、用量依存的に廃止または減少させることができます。これは、チロシン異化経路13 の 4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ (Hpd) を阻害します。Hpdはホモゲンタイゼートの形成に必要であり、したがってピオメラニン11の形成に必要です。

私たちは、緑膿菌のピオメラニン産生株のNTBC治療の研究において重要だった3つの技術を詳細に説明しています。これらの技術には、実験室および臨床のピオメラニン産生株におけるピオメラニン産生を廃止または減少させる濃度を決定するためのNTBCの滴定、細菌をNTBCで処理した場合の抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の決定、およびNTBC治療による酸化ストレスに対する感受性が含まれます。

私たちが開発した滴定アッセイは、2つの目的を果たします。まず、このアッセイにより、NTBCが研究対象の細菌中のピオメラニン産生を廃止または減少させることができるかどうか、およびどの濃度で行うことができるかを判断できます。これにより、P. aeruginosa12で観察されるように、細菌の異なる株がこの化合物に対して異なる感受性を持つ可能性があるため、ユーザーはNTBCに対する感受性を判断できます。次に、NTBC滴定アッセイにより、ピオメラニン産生を廃止または減少させ、色素還元の効果を判断することが目標である場合、ユーザーは、抗生物質MICや酸化ストレス応答アッセイなどの後続のアッセイで使用するNTBCの適切な濃度を決定できます。

滴定アッセイが機能するのは、NTBCで処理された株にピオメラニン産生の目に見える違いが見られ、ピオメラニン産生の違いは用量依存的であるためです12。さらに、この手法は、細菌の色素産生を排除または増強する可能性のある他の化合物の研究にも適用できます。

抗生物質のMICは、細菌の抗生物質に対する感受性を決定するために使用されます。MICを決定するには、寒天希釈プレートやブロス希釈14など、いくつかの方法があります。ブロスの希釈は、小さな試験管または96ウェルマイクロタイタープレートで行うことができます。本明細書に記載のMIC測定のマイクロタイタープレート法により、ユーザーは最小限のリソースを使用して広範囲の抗生物質を試験することができる。このアッセイは、この方法で試験する抗生物質および菌株の数の再現性と柔軟性を提供します。さらに、アッセイにNTBCを組み込むことで、ピオメラニン産生の排除または減少がピオメラニンを産生する細菌の抗生物質感受性を変化させるかどうかを判断できます。

酸化ストレスに対する細菌の反応は、いくつかの方法でテストすることができます。記載されている最も一般的な方法は、一定期間酸化ストレスにさらされた細菌の生存可能な数1、または酸化ストレスディスク拡散アッセイ15のいずれかである。これらの方法は、細菌の酸化ストレスの影響を調べるために高濃度の酸化ストレッサーを使用する傾向があり、結果は生物学的複製間でかなり異なる可能性があります。また、Viable Count Assayは、他の方法よりも多くの寒天プレートを使用する傾向があります。ここで説明するスポットプレートアッセイは、低濃度のH2O2を使用し、ユーザーは最小限のプレートを使用して複数の菌株の酸化ストレス応答を試験することができます。また、このアッセイは、技術的反復と生物学的反復間で一貫して再現性があります。ピオメラニンは酸化ストレスに対する耐性に関与しているため、アッセイにNTBCを組み込むことで、ピオメラニン産生の排除が酸化ストレス耐性に及ぼす影響を判断できます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

培養培地、抗生物質の調製、及び2- [2-ニトロ-4-（トリフルオロメチル）ベンゾイル] -1,3-シクロヘキサンジオン（NTBC）

  1. 適切なボリュームにLBブロス（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、H 2 O中 0.25％のNaCl）、アリコートを行います。オートクレーブにより滅菌します。室温で保管してください。
  2. 250 mlのフラスコに100 mlのLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.25％のNaCl、H 2 O中の1.5％寒天）を作ります。室温でオートクレーブとストアによって滅菌します。寒天プレートに注ぐ前に溶けていることを確認します。
    注：LB寒天100mlを含有するフラスコを4板が得られます。 LB寒天培地の量は、アッセイに必要なプレートの数に対応するように変更することができます。
  3. PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMのの Na 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4）16ください。室温でオートクレーブまたは濾過し、ストアによって滅菌します。
  4. ゲンタマイシンのための抗生物質のストック溶液を準備し、カナマイシン、Dトブラマイシン。
    1. Pの適切な抗生物質ストック濃度を準備100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌菌株 。 4℃の水、フィルター滅菌し（0.2ミクロン）、および店舗での抗生物質を溶解します。研究細菌に応じて抗生物質および濃度を変更します。
  5. NTBCストック溶液を準備します。 DMSOの400μlのNTBC 10mgを溶解します。これは、75.9 mMのNTBCの濃度が得られます。 -20℃で保存NTBC原液。必要に応じて室温でソリューションを解凍します。
    注：NTBCの異なるソースは、溶解度の差があります。メーカーの推奨に基づいて、NTBCを溶解し、それに応じてステップ1.5を調整するためにする適切な車両を決定します。

細菌株の2 NTBC滴定

  1. テストされる株の一晩培養を設定します。 16×150 mmの試験管に2 mlのLBブロスを加えますS（1株あたり1）と、各株から1に単離したコロニーを接種します。空気インキュベーター中で組織培養回転子に通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
  2. 次の日は、LBブロス中でNTBCの滴定を準備します。異なる株がNTBCに対する感受性の違いを持っ​​ているので、0から900μMNTBCの初期範囲を使用してください。
    1. 1株あたり4〜5本の試験管（16×150ミリメートル）に1ミリリットルのLBブロスを追加します。
    2. 濃度の範囲内で試験管（16×150ミリメートル）にNTBC原液（75.9 mm）を追加します。 LBブロスの1mlに追加するには、NTBCの濃度とそれに対応する株式ボリュームについては、表1を参照してください。
  3. 一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelanin排除するためにOD 600読み取りを行う前に、文化を洗ってください。
    1. 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。上清を除去し、持つ任意の緩くペレット化した細胞ピペットとは、1ミリリットルのLB固体細胞ペレットを再懸濁
  4. OD 600 0.05で滴定チューブを接種します。チューブに接種するために必要な洗浄文化の量を計算します。
    注：pyomelaninが存在してはならないので、予防接種のための洗浄の文化を使用してください。
  5. 空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で約24時間滴定チューブをインキュベートします。
  6. 滴定チューブを撮影し、MICおよび酸化ストレスアッセイのために使用するNTBCの量を決定するために、内および系統間で色素産生を比較します。無細胞培養上清中pyomelaninの量を決定し、細胞密度を決定するために、OD 600測定値を使用します。
    注：細胞の培養上清中のpyomelaninのOD 600比は、NTBCで処理した後pyomelanin生産の違いを定量化するために計算することができます。

3.抗生物質の最小Inhibi96ウェルプレートでトリー濃度（MIC）アッセイ

  1. し、NTBCないLBにテストされる株の一晩培養を設定します。
    注：このプロトコルは、300μMのNTBCの代表レベルを用いて説明します。使用されるNTBCの適切なレベルは、ステップ2.6で決定されます。
    1. 2ミリリットルのLBに300μMのNTBCを追加無NTBC条件の2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の同等のボリュームを追加します。
    2. 滅菌爪楊枝を使用して、細菌のつの単離されたコロニーをチューブに接種。 NTBCと1つの培養し、各株についてNTBCせずに1つの培養があります。空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
  2. 次の日、MICアッセイを設定するためのLB + NTBCし、LB + DMSOマスターソリューションを作ります。接種物は、300μMの最終濃度を得、追加されたときに、これは2倍に希釈されるように、600μMの濃度でNTBCを追加します。
    1. 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。
      注：マスター溶液製剤は、ピペッティングの誤差を考慮して余分な溶液が得られます。試験した抗生物質および株の数に応じて必要に応じてマスターソリューションは拡大または縮小することができます。
  3. LB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションの抗生物質溶液を調製します。
    注：これらの溶液中の抗生物質濃度は、二重の最終的な所望の濃度にする必要があります。十分な溶液を、96ウェルプレートの4ウェルに100μlのを転送するようになされるべきです。
    1. 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。
      注：Pのゲンタマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、32μgの/ mlです。
    2. カナマイシン+/- 256 / mlのでNTBC原液を作ります。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにカナマイシンストック（30 mg / mlの）の3.84μlを添加します。
      注：Pのカナマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、128μgの/ mlです。
    3. トブラマイシン+/- 8 / mlのでNTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにトブラマイシンストック（10mg / ml）の0.36μlを添加します。
      注：Pの緑膿菌 PAO1、トブラマイシンの最大濃度は、4 / mlのです。
      注：細菌を試験するために、抗生物質との濃度を調整することができます。
  4. 96ウェルプレートの4つのウェルにそれぞれ2倍の抗生物質溶液100μlを追加します。 examplの行Aにこれらのソリューションを配置しますeは、ゲンタマイシンがA4を通じてA1に配置する必要があり、カナマイシンはA8を通じてA5に配置する必要があり、およびトブラマイシンはA12を通じてA9に配置する必要があります。セットアップ、96ウェルプレートの図については、図1Aを参照してください。
    注：複数の抗生物質は、一枚のプレートで試験することができるが、唯一の1株は他の株からの交差汚染の可能性を排除するために、プレートごとにテストする必要があります。
  5. 96ウェルプレートのHを通じて行BにLB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50μlを追加します。一方のプレートは、LB + NTBCであることを確認し、一方のプレートは、LB + DMSOです。 図1Aを参照してください。
    1. LB + NTBCにおける抗生物質のためのLB + NTBCを使用してください。 LB + DMSO中の抗生物質のためのLB + DMSOを使用してください。
  6. マイクロピペットを使用すると、ピペットチップを変更、Bのミックスにソリューションを行ごとにAから溶液50μlを転送することにより、抗生物質の2倍連続希釈を行い、のためのC.繰り返しを行ごとにBから溶液50μlを転送remainingの行。行Gを希釈した後、その行から溶液50μlを除去し、廃棄します。細菌の増殖のための抗生物質のないコントロールとしてH列を使用してください。 図1Bを参照してください 。
    注：Gを通じて行Aの各ウェルは現在の2倍でLB + NTBCまたはLB + DMSO中の抗生物質、50μlの最終的な所望の濃度が含まれています。 H列は、抗生物質なしでLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。
  7. 一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelaninを排除するためにOD 600読み取りを行う前に、すべての文化を洗ってください。
    1. 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。ピペットで上清を除去し、1mlのLBに細胞ペレットを再懸濁
  8. LBの中で2.75x10 5 CFU / mlに一晩培養を希釈
    注：1 OD 600ユニットは、Pの 1×10 9 CFU / mlと同等であると仮定緑膿菌 。 CFU / mlの変換へのODは、Dすることができます他の細菌でifferent。
  9. 適切なウェルに希釈した細菌培養物の50μlのを追加します。
    注：NTBCで増殖させた培養物は、DMSO中で増殖させ、培養物NTBCを含むウェルに添加されるべきではDMSOを含有するウェルに添加されるべきです。 図1Bを参照してください 。
    1. 各菌株と抗生物質濃度のための3つのウェルに細菌を追加します。細菌汚染のための対照として機能する第四ウェルにLB50μlのを追加します。 図1Bを参照してください 。
    2. 井戸を接種するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。近隣の井戸の汚染を防止するために、接種材料を追加する際にピペットチップは、ウェルの底近くにあることを確認してください。
      注：ウェルに細菌培養を追加すると、抗生物質とNTBC濃度2倍に希釈します。
  10. パラフィルムを有する96ウェルプレートを覆い、37℃で約24時間インキュベートします。空気インキュベーター中、静的96ウェルプレートをインキュベートします。
  11. 調べウェル中の細菌増殖のためのプレート。 MICには、細菌の増殖を、各株のすべての3つの複製のために見ていないされている抗生物質の最低濃度です。
    1. 視覚的な成長のためにプレートを調べたり、OD 600に設定し、プレートリーダーを用いて読み取ります。

酸化ストレス応答4.スポットプレートアッセイ

  1. ステップ3.1で説明したようにNTBCとないLB中でテストされる株の一晩培養を設定します。
  2. 翌日、酸化的ストレッサーとしてH 2 O 2を含有する LB寒天プレートを調製します。 0〜1 mMのからのH 2 O 2濃度の範囲は、良い出発点です。
    1. LB寒天フラスコを溶かします。室温で約50℃に冷却するメディア。
    2. 所望の濃度の冷却媒体に直接H 2 O 2 を追加します 。スワールフラスコを混合します。 H 2 O 2の濃度は 、表2を参照そして濃縮し、H 2 O 2のボリュームが追加されます。これらの値は、LB寒天100mlのに基づいています。
    3. すぐにH 2 O 2を添加した後 、プレートを注ぎ、気泡を除去するために表面を火炎。収率はLB寒天の100ミリリットル当たり4板です。マーク・H 2 O 2濃度でプレート。
    4. プレートから余分な水分を除去するために、30分間実行しているファンとの生物学的な流フードで明らかになったプレートを置きます。
      注：プレート、それらが用意されている同じ日に使用します。そうしないと、一貫性のないデータになることがあります。
      注：例えば、パラコートなどの酸化ストレスは、このアッセイにおけるH 2 O 2の代わりに用いることができます。他の酸化ストレスのために使用される濃度は、H 2 O 2のために使用されるものと異なってもよいです。
  3. 洗浄ステップ3.7で説明したように一晩培養のOD 600を測定します 。
  4. すべて一晩のcuのOD 600を正規化テストされている株のセットの最低値にltures。P.緑膿菌は、一般的に 、LB + NTBCまたはLB + DMSO中で一晩増殖させ、約2.5のOD 600を持っています。
    1. 1ミリリットルの全容量で最低のOD 600に文化を希釈するために必要な培養物の容量を決定します。例えば、培養物がOD 3の600を有しており、株のセットのための最小のOD 600が 2.5であり、次の計算実行する場合：（2.5）（1ミリリットル）=（3）（X）。 X = 0.833ミリリットル。文化の0.833ミリリットルをマイクロチューブ内に配置されます。
    2. 1mlに培養容量をもたらすために必要なLB + NTBC（300μM）またはLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、LB + NTBCまたはLB + DMSOの量は0.167ミリリットル（ - 0.833ミリリットル文化1ミリリットル総容量）になる培養液に添加。 LB + NTBCし、LB + DMSOのストック溶液は、すべての株を希釈するために必要な量に基づいて、これらの希釈液に使用するようにしてください。
    3. 文化とLB + Nを混ぜますボルテックスによってTBCまたはLB + DMSO。
  5. NTBCまたはDMSOの一定濃度で培養を維持するために、PBS + NTBCまたはPBS + DMSO中の正規化された一晩培養の10倍連続希釈を行います。
    1. PBS + NTBCし、PBS + DMSOのストック溶液を作ります。 1株についての希釈液の1セットでは、720μLの総容量を得るために、PBSで300μMのNTBCまたはDMSOの等量を混ぜます。テストされてどのように多くの株に応じて上下にこれらの株式をスケール。
    2. 10 -7の連続希釈10〜-1のラベルマイクロチューブ。適切なチューブにPBS + NTBCまたはPBS + DMSO90μlのを追加します。 LB + NTBCで成長した株について、PBS + NTBCを使用し、LB + DMSO中で成長した株をPBS + DMSOを使用しています。
    3. 適切な10 -1希釈チューブに文化の10μlのを追加します。ボルテックスで混合し、10 -2希釈チューブに10 -1希釈液10μlを移します。すべての希釈はperfoされるまで繰り返しますrmed。希釈液の間にピペットチップを変更します。
  6. 各株の重複でLB + H 2 O 2のプレートに10 -7希釈液を10〜-3のスポット5μlの。スポットがメッキされている場合は、ほとんどが少なくとも希（10 -7〜10 -3）に希釈から1ピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾燥するまでプレートを傾けたり、傾けたりしないでください。
  7. 歪みに応じて、37℃（空気インキュベーター）で24〜48時間、プレートをインキュベートします。
    注：P。緑膿菌 PAO1は、インキュベーションの24時間後に、LBの良いサイズのコロニーを持つことになります。それらがコロニーをPAO1とほぼ同じ大きさになるまで株を培養します。
  8. transluminator上にCCDカメラを用いてプレートを撮影。必要に応じて、同じサイズとは対照的と作物のために写真を編集します。酸化ストレスに対する感受性の変化を決定するために各スポットにコロニー数をカウントします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

NTBC滴定

NTBCはP.でpyomelanin産生を減少させることができた場合にNTBC滴定を決定するために使用されました緑膿菌 、また、追加のアッセイにおける使用のためのpyomelanin生産性を排除または低減されるNTBCの濃度を特定します。そこ異なる複製で生産pyo​​melaninのレベルの変化であるが、一般的な傾向は一定のままであってもよいです。 NTBC滴定アッセイはまた、他の細菌に色素産生に影響を及ぼし得る他の化合物を試験するために変更することができます。視覚的に測定または定量することができる表現型の変化がある場合にのみ、しかし、動作します。

Pの pyomelanin産生株の治療NTBCと緑膿菌は、顔料製造12の用量依存性の減少をもたらした。 図2は 、Pの異なる株を示していますピョのレベルによって示されるように緑膿菌は 、NTBCに対する...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルに記載されているNTBC滴定法により、ユーザーは、NTBCが細菌におけるピオメラニン産生を減少または排除できるかどうかを判断し、必要なNTBCの濃度を決定することができます。NTBC 滴定アッセイの最も重要なステップは、アッセイで使用する NTBC 濃度の範囲を決定することです。緑 膿菌 の異なる株はNTBCに対する感受性が異なり、実験室の株は臨床分離株よりもNTBCに対してより敏感である可能性があります12 (図2)。したがって、分析される株ごとにNTBC濃度の範囲をテストする必要があります。ユーザーは、特定の株でピオメラニン産生を阻害するNTBCの最低濃度を決定する可能性が高いため、低濃度から始めて、必要に応じて高濃度に増やすことをお勧めします。私たちの滴定アッセイは、色素生成の阻害を決定するための定性的方法を説明しています。研究の目的によっては、ピオメラニンレベルを決定する必要があるかもしれません。これは、HPLC3 または電子常磁性共鳴(EPR)分光法19によって達成でき、サンプル中のパイオメラニン...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、ダラ・フランクとキャリー・ハーウッドの寛大な貢献に感謝します。ウィスコンシン大学ミルウォーキー研究財団は特許番号8,354,451を保有しています。2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)などの4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害化合物を投与することにより、患者における微生物の感染の進行を治療または阻害することを広く目的とするクレーム。発明者はグラハム・モランとパン・ヘです。本研究は、国立衛生研究所(R00-GM083147)の支援を受けて行われました。University of Washington P. aeruginosa トランスポゾン変異体ライブラリは、NIH P30 DK089507によってサポートされています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)シグマ-アルドリッチSML0269-50mgニチシノンとも呼ばれます。 DMSOに可溶です。
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. % in H2O. 安定 化。
ゲンタマイシンゴールドバイオG-400-100H2Oに可溶。フィルター滅菌します。
カナマイシンフィッシャーサイエンティフィックBP906-5H2Oに可溶です。 フィルター滅菌します。
トブラマイシンSigma-AldrichT4014-100MGH2Oに可溶です。フィルター滅菌します。

参考文献

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

NTBC MIC Pseudomonas aeruginosa

関連記事