アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

Summary

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。

Abstract

脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで^2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ_1-40に露出ラット脳組織>（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。

Introduction

健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性^1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト^4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。

反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。

アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ^6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了^{7を示しています} 。

この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサ....

Protocol

この研究は、医学のイラン大学（テヘラン、イラン）の倫理委員会によって承認された実験動物の管理と使用（NIH）のためのガイドに記載されたポリシーに準じて行きました。

1.動物、手術検体の準備

注：3D共焦点顕微鏡分析のために、脳組織を準備します。

1. 二つのグループに無作為に動物を分割_：Aβ1-40 -injection（N = 8）、およびゲニステイン治療（N = 8）と_、Aβ1-40 -injection。手術前に強制飼養1時間によってゲニステイン（例えばポリエトキシル化ヒマシ油等の車両に希釈した10mg / kgの）を管理。
2. ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で動物を麻酔。つま先をつまん後引っ込め反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、手術中に目に軟膏を使用してください。
3. 定位固定装置と剃りヘッドの動物を配置します。 IODの適用INE溶液を切開前頭皮をきれいにし、感染のリスクを減らすために、手術中に無菌手術部位を維持します。ラット脳アトラス⁸によれば、ブレグマ-3.5ミリ後方、正中線±2ミリメートル、横方向、および硬膜下の-2.8 mmに海馬における_Aβ1-40定位（4μl）を注入します。定位方法については、以前の出....

Results

このセクションでは、3次元形態計測分析によって生成定性的および定量的な観測のいくつかの例を紹介します。前述した全12パラメータの完全な結果を得るために、私たちの以前の出版物^{10を参照してください} 。

定性的観察

アストロサイトは_、Aβ1-40注射したラット（ 図1）で、通常の長さで細いまたは太い枝を示しました。短い枝といくつかの小さな星形のアストロサイトは、大脳皮質で観察された、とアストロサイトのコンパクトなネットワークは、脳梁に発生しました。

ゲニステイン処理することにより_、Aβ1-40 -injectionと動物の脳組織におけるアストロサイトは短く、細い枝（ 図^2）10で星状の形を示しました。いくつかの星状細胞は萎縮外観を示しました。

星状細胞の密度およびGFA.......

Discussion

現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために_、Aβ1-40とラットの海馬組織_-とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態、すなわちアストログリオーシスに対するゲニステインの影響を示すことができました。

脳組織の細胞内および細胞外環境の変化は、細胞/組織の容積および/またはサイズを変更することができます。これらの変化は、様々な脳損傷^3,11に病理学的特徴と考えられています。これらの変化を定量化するために、多数の技術が使用されます。ほとんどの調査は唯一のCEのごく一部についての情報を与える光 - または電子顕微鏡（EM）によって捕獲2D低解像度の画像を使用することに基づいていますLL。この制限を克服するために、高解像度画像上の3次元共焦点形態計測は^、11を.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アミロイドベータ 1-40	Sigma Aldrich	79793	-70 °C で維持。C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	キープ -20 °
グリア線維性酸性タンパク質に対するCポリコロンウサギ抗体	DAKO	Z0334
アルカリリン酸結合ブタ抗ウサギ IgG抗体	DAKO
永久発色剤	DAKO	K0640
液体永久赤色基質バッファー	DAKO	K0640
クレモフォアEL	シグマアルドリッチ	27963	Polyethoxylated ヒマシ油 - ステップ 1.1
LSM 700 共焦点レーザー走査顕微鏡	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000	Tekno Optic
Streotaxic apparatus	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.