マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Summary

共培養は、神経と標的組織や臓器との間の相互作用を研究するための貴重な方法を表しています。マイクロ流体システムは、神経節と発生中の臓器または組織全体を異なる培養培地で共培養することができるため、ニューロンとその標的との間のクロストークのin vitro研究のための貴重なツールとなります。

Abstract

神経支配は、臓器や組織の発達、ホメオスタシスおよび再生に重要な役割を果たしています。しかし、これらの現象の根底にあるメカニズムはまだよく理解されていません。具体的には、歯の発生と再生における神経支配の役割は無視されます。

in vivo試験でのいくつかは、様々な動物モデルの開発および修復プロセス中に歯の組織の神経支配のパターンに関する重要な情報を提供しています。しかし、これらのアプローチのほとんどは、神経線維と標的器官と組織との間の相互作用の分子的基礎を強調するために最適ではありません。

共培養物を制御し、隔離された環境で神経線維と歯の間の相互作用を調査し、操作するための貴重な方法を構成しています。過去数十年間で、同じ培地を用いた従来の共培養物は、非常に短い期間に行われている（ 例えば 、2日）感覚神経線維上の口腔や歯の組織の開発の魅力や反発効果を調査します。しかし、培養期間の延長は、歯の形態形成と細胞分化の神経支配の影響を調査するために必要です。

マイクロ流体システムは、適切な培養培地中のニューロンと異なる細胞型の共培養を可能にします。我々は最近、三叉神経節（TG）と歯が長期間生存することができることを実証している時に共培養マイクロ流体デバイスで、それらは、これらの条件で、それらが生体内で示す同一の神経支配のパターンを維持します。

これに基づき、我々は単離する方法を説明し、共培養マイクロ流体共培養system.Thisプロトコルで三叉神経節と歯の細菌の開発は神経節/神経および標的組織培養共同すると役割を研究するために、シンプルで柔軟な方法について説明しますCONTRでこのような相互作用の特定の分子のolledと隔離された環境。

Introduction

神経支配は、臓器や組織^1,2の発達、ホメオスタシスおよび再生に重要な役割を果たしています。 ^{5 -}さらに、神経支配は、幹細胞の増殖、分化及び動員³の調節に関与します。実際には、口腔顔面複合体の組織で実現最近の研究は、上皮前駆細胞は唾液腺^6,7の開発と再生中の機能のために副交感神経が必要であることを示しています。 ^{11 -}同様に、神経支配が味蕾⁸の開発及び維持のために必要であることが実証されています。したがって、このような歯のような他の重要な口腔顔面器官および組織の発達における神経支配のまだ無視役割を分析することが重要です。

大人の歯の豊富な神経支配にもかかわらず、ボディ、develo他のすべての臓器や組織とは対照的に、pingの歯は、最も初期の出生後の段階で神経支配され始めます。歯は口腔外胚葉および頭蓋神経堤由来の間葉間シーケンシャルと逆数の相互作用の結果として発生します。これらの相互作用は、それぞれ^12、上皮由来エナメル芽細胞とエナメル質や象牙質の形成に関与している間葉由来の象牙芽細胞を生じさせます。 ^{15 -}上頸神経節から三叉神経節および交感神経からの感覚神経は大人の歯^13を支配します。胚発生時には、神経線維は、現像歯胚に向けて三叉神経節プロジェクトから発せられると次第にそれら....

Protocol

全てのマウスは、チューリッヒ、スイスの動物福祉法に、州立獣医局の規制に準拠してに従って維持し、取り扱いました。

解剖素材、文化メディア、マイクロ流体デバイスの作製

1. オートクレーブマイクロ解剖ピンセットやハサミ（121℃、滅菌時間：20分）、滅菌容器に保管してください。
2. 37℃でオービタルシェーカー上で24時間、1 M HCl中でそれらをインキュベートすることにより、ガラスカバースリップ（24ミリメートル×24 mm）を滅菌します。 99％エタノールで滅菌蒸留H ₂ O 3回とそれらを3回洗浄します。乾燥後、37℃または滅菌流フードの下でカバースリップ。最後に、滅菌を完了するためにUV光（30分）にカバースリップをオートクレーブまたは露出します。カバースリップは、次いで、70％エタノールに保存することができます。
3. 滅菌ピンセットを使用してパッケージから慎重AXIS軸索分離デバイ​​スを取り外し、滅菌ペトリ皿に置きます。
4. 滅菌生検パンチ（φ：1ミリメートル）を使用すると、培養室に対応して（ 図1）で培養するサンプルあたり一つの穴を作成します。
   注：それらが適用された圧力によって損傷する可能性があるとして、微小溝に近すぎるパンチしないでください。
5. 70％エタノールでそれらを浸すことにより、AXIS軸索分離デバイ​​スを滅....

Results

これらの結果は、単離された三叉神経節は、単離された歯の細菌の開発は、マイクロ流体デバイスの他の区画内の長期間持続すること、加えて、マイクロ流体デバイスの一の区画で成長し得ることを示します。異なる培地は、二つの区画で使用されると、2つの区画間マイクログルーブは、現像歯胚に向かって三叉神経節からの軸索の伸長を可能にする。 図3マウスの共培養において、免疫蛍光³⁷を介して、神経フィラメントの視覚化を表します記載のマイクロ流体共培養系における胚の三叉神経節およびマウス胚性切歯。一貫して、三叉神経節からの軸索が多く10日間培養での開発歯胚によって廃止されている。図3（a）は、この中に軸索室の概要を示し、マウスの門歯は、in vivoでの開発時に神経支配されていません。共培養系。 図3（b）及び（c）を示して軸索室とマイクロ畑内の神経突起の進行倍率。歯の細菌（または任意の共培養の器官または組織）は、組織学的染色のために、または遺伝子発現分析のために処理し

Discussion

歯の神経支配のインビトロ研究における前は三叉神経節及び歯の組織または細胞^26,28,29の従 ​​来の共培養に基づいていました。これらの研究は主に感覚軸索³⁸にこれらの細胞または組織の魅力的な効果を調査するために行きました。フィールドに大きな進歩をもたらしたが、いくつかの技術的な問題が提起されました。歯胚を培養³⁷の数日後に退化し始めます。これらの観​​察に基づいて、同じ培養条件下で成長したニューロン及び歯は、これら2つの組織間のクロストークに関与する分子のいずれかの最終的な解析を損ないます。最適な培養条件は、三叉神経節及び歯の組織の生理学的分子プロファイルを維持するために必要とされます。

マイクロ流体システムは、最適化されたメディア^34,36にニューロンおよび種々の細胞型の共培養でこれまでに使用されています。このマイクロ流体システムは、より多くの信仰を表すことができ完全に神経細胞体、軸索の端末と、標的組織は、一般に、異なる細胞および分子の微小環境にさらされて.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	異なる長さのマイクロチャネルが利用可能
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
組換えマウスβ-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	ヒトおよびラット β-NGF (R&D Systems)は
、DMEM-F12	Gibco	11320-033