二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

サマリー

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。

要約

タンパク質間相互作用(PPI)は、生物学にとって重要な分子イベントです。しかし、従来の光学顕微鏡の分解能は回折が~250nmに制限されているため、細胞内で十分な分解能と感度でPPIを可視化することは依然として課題です。二分子蛍光相補型(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることで、PPIを細胞内で1分子の感度とナノメートルの空間分解能で可視化することができます。BiFCは、蛍光コントラストでPPIを視覚化するために一般的に使用される手法であり、蛍光タンパク質を2つの非蛍光フラグメントに分割することが含まれます。PALMは、ナノメートルおよび単一分子スケールで生体サンプルをイメージングするための最近の超解像顕微鏡技術であり、光活性化可能な蛍光タンパク質(PA-FP)などの光変換可能な蛍光プローブを使用します。BiFC-PALMは、PALMと互換性のあるPA-FPであるPAmCherry1を分割することにより、そのモノマー性、良好な単一分子輝度、高コントラスト比、および化学量論測定への有用性を実証しました。アミノ酸159と160に分割すると、PAmCherry1は、PPIに対する高い特異性と低い非特異的再構成で、37°Cで効率的に再構成するBiFCプローブにすることができます。Ras-Raf相互作用は、BiFC-PALMがナノメートルスケールで単一分子の分解能で相互作用を調べるのにどのように役立つかを示す例として使用されています。その拡散は、1分子トラッキング(smt-)PALMを使用して生細胞で追跡することもできます。このプロトコルでは、BiFC-PALMの融合タンパク質を設計する際に考慮すべき要素について説明し、サンプル調製、画像取得、およびデータ解析のステップを説明し、いくつかの例示的な結果を示します。高い空間分解能、特異性、感度を提供するBiFC-PALMは、無傷の生体サンプル中のPPIを研究するための有用なツールです。

概要

タンパク質-タンパク質相互作用薬（PPI）は、生物学¹の基本である、しっかりと多くの時間と長さスケール全体の時空間的機構を介して調節されています。細胞膜上の細胞シグナル伝達に対する研究は、例えば、特定のPPIおよび細胞プロセス^{2を容易に}動的な、ナノスケール空間区画を明らかにしました。したがって、十分な空間的・時間的解像度、高い特異性、高感度で生物学的システムでのPPIを調査する能力は、生物学のメカニズムの理解を達成するための鍵です。

二分子蛍光相補（BIFC）は、細胞内の分解能でセル内のPPIを可視化するためのいくつかの既存のツールの一つであり、生細胞の互換性^{3から5 を} 。技術は比較的簡単であり、2つの非蛍光フラグメントに蛍光タンパク質の分裂を伴います。遺伝的に2つの相互作用するタンパク質にタグ付けされたときに近接させ、フラグメントは、蛍光シグナルを生じる、完全な蛍光タンパク質を形成するように再構成することができます。適切に設計すると、BIFCプローブは自発的にのPPIの不存在下で再構成してはいけません。このように、BIFCアッセイにおける蛍光シグナルは、高い特異性でのPPIの直接可視化を可能にするのPPIの存在下で生じます。読み出しとして蛍光を使用することのさらなる利点は、とりわけ、高いスループットと高含有量スクリーニングアッセイ、と高感度、細胞内の解像度、および互換性があります。これらの利点のために、異なる親蛍光タンパク質に基づくBIFCプローブの数が開発されています。従来の光学顕微鏡法に基づいて、すべての他の検出手法のように、しかしながら、BIFCの空間分解能は、光の回折による〜250nmのに限定されています。これは、ナノスケールでのPPIの調節を研究するための挑戦になり、先に言及したと脂質ラフト⁶ aで例示されるようにします、NDラスナノクラスター^7は 、そのようなシグナル伝達などの多くの細胞プロセスを理解するための重要な長さスケールです。

BIFCはPPIの^10を撮像するための空間分解能でこの制限を克服するために、光活性化ローカライゼーション顕微鏡^{（PALM）8,9}と組み合わされています。 PALMは、確率論的活性化し、単一の蛍光分子のsubdiffractiveローカライズを通じて蛍光イメージングでの回折限界を回避する最近の超解像顕微鏡技術です。各作動サイクルでは、蛍光分子は、数千光子に数百を放射し、検出器上の単一分子の画像を生じます。画像は、回折限界（幅〜250 nm）であるが、その重心は、典型的には、検出された光子の数に応じて10〜50ナノメートルのオーダで、非常に高い精度で判定することができます。試料中の各蛍光分子を活性化し、局在化することにより、高解像度画像を再構成することができます。 Performe生細胞上のD、単一のセル¹¹からのタンパク質の拡散軌跡の数千の単一分子追跡（smt-）PALMさらに許可取得。重要なのは、Palmは確率的な活性化を達成するために、このような光活性化蛍光タンパク質（PA-のFP）などの特殊な蛍光プローブを使用しています。 BIFCとPalm用の蛍光タンパク質の両方ので、それらは、アミノ酸159と160の間に2つの断片に、Palm用PAmCherry1、一般的に使用されるPA-FPを分割して組み合わせました。

分割PAmCherry1に基づいBIFCシステムは、2つの断片の自発的な再構成からの低バックグラウンドシグナルを示しています。遺伝的に相互作用するタンパク質のペアにタグ付けすると、2つの断片を（RN =は1から159残基; RC =メット+残基160から236）であっても37℃、より低い温度でインキュベートすることなく、完全なPAmCherry1タンパク質を形成するために、効率的に再構成し、これそのような親mCherryを¹³などの他のBIFCペア¹²には当てはまりません。 Furthermo再、再構成PAmCherry1タンパク質は、高コントラスト比、正確な単一分子の局在化と高解像度のPALM画像化のために重要である他、間中光子収量、高速光活性化、などの親PAmCherry1の光物理的特性を、保持していました。

このプロトコルでは、分割PAmCherry1（ 図1A）を用いて、U2OS細胞中のRas-Rafの相互作用を撮像するBIFC-PALMの使用が記載されています。最初のステップは、PAmCherry1フラグメント（ すなわち 、RN及びRC）と目的タンパク質との間の融合タンパク質を発現するための構築物を設計することです。理論的には、候補タンパク質（A及びB）の対ごとに、融合タンパク質の8組をテストするために存在する：RN-A / RC-B。 RN-A / B-RC。 RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC。 -RC / RN-B;そしてA-RC / B-RN。このプロセスは、しばしば考慮候補タンパク質の構造的または生化学的特性を取ることによって簡略化することができます。 Rasの場合には、タンパク質であります翻訳後のC末端CAAXボックスで変更された（C =システイン、A =脂肪族; X =任意の）、その後、AAXモチーフが切断されます。したがって、RNまたはRCは、RasのN末端に融合することができます。これは、4つ（ 図1B）への融合タンパク質のペアの数を減少させます。 Rafは、Rasの結合ドメイン（RBD;残基51から131）が使用され、両端にタグを付けることができます。これら4融合構成が生成されました：RN-KRAS / RC-RafのRBD。 RN-KRAS / RafのRBD-RC。 RC-KRAS / RN-RafのRBD。 RC-KRAS / RafのRBD-RN。

さらに、フラグメントおよび目的のタンパク質との間のリンカーを考慮する必要があります。約10アミノ酸の柔軟なリンカーは、しばしば、それが相補性を生じるのに十分な自由度を提供するように使用されます。マルチクローニングサイト^（MCS）14から生成されたランダムな配列を含む、正常に適用されてきた多くの人が、ありますが、そのようなリンカーは、（GGGGS）×2です。リンカーの長さはdependin最適化する必要があるかもしれません目的のタンパク質とその向きの相互作用の大きさにグラム。

PAmCherry1断片はのMCSに隣接すると、小さなクローニングバックボーンに含まれている（材料リストを参照してください）​​。目的の遺伝子は、制限部位を介して、またはライゲーション非依存の方法で挿入することができます。クローニングおよび配列確認の後、発現カセットは、リコンビナーゼ反応、高忠実度、高効率のクローニング法を使用して発現ベクターに移されます。

次に、得られた発現構築物は、標的細胞株を感染するためにレンチウイルスにパッケージング、安定な細胞株が所望される場合、標的細胞株にトランスフェクトまたはれています。一過性トランスフェクションは、BIFC構成の迅速な検証を可能にしますが、潜在的な問題に注意する必要があります。化学薬品を使用してトランスフェクションは、多くの場合、高い自己蛍光が得られ、細胞を強調。一方、全内部反射蛍光（TIRF）microscoの使用PPIは、細胞膜上で行われるときpyがTIRF理想、照明量を制限することにより、このバックグラウンド信号を軽減することができます。また、一過性トランスフェクションは、多くの場合、遠くのPPIの検出にアーチファクトを引き起こす可能性がある内因性タンパク質のものを超える、高レベルのタンパク質発現を導きます。したがって、それは、適切なBIFC設定が初期テストを通じて決定された後に安定な細胞株を確立することをお勧めします。安定な細胞株はまた、ドキシサイクリン誘導^{15を介して}調節可能な発現の可能性を有します。

感染後、細胞を、抗生物質、典型的にはピューロマイシン、ネオマイシンで各構築物のための1つの選択されています。試料調製、画像収集、およびデータ分析のための後続のステップは、プロトコールに詳細に説明します。

このアプローチでは、ラス-RafのRBDのBIFC-PALM画像内のナノスケールのクラスターの形成が日常観察される（ 図2A </強いです>）。一貫して、ラス-RafのRBDのSMT-PALM軌道が拡散状態（ 図2B-D）での不均質な分布を示しています。これらの結果は、Ras-Rafの複合体は、潜在的な生物学的な意味で、おそらくモノマー及びクラスターとして、細胞膜上の複数の状態で存在することを示唆しています。この作業は、従来BIFC、蛍光の共局在化、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて得ることが困難となり、ナノメートルの空間分解能および単一分子感度を有する細胞でのPPIの選択的なイメージングにBIFC-PALMのパワーを示しています。

BIFC実験を設計し、その結果を解釈する際には、BIFCプロセスが分割PAmCherry1を含め、ほとんどの場合、中に不可逆的であることを心に留めておくことは重要です。二つの断片を組み合わせて、完全なPAmCherry1タンパク質、二つの断片間の結合を形成し、一旦このように、PPIは永続的になります。これはBIFCとBIFC-PALの使用を制限PPIのダイナミクス（ すなわち 、結合反応速度ではなく、それが形成されると、タンパク質複合体の拡散ダイナミクス）を監視すると、時間にMがあっても、PPI複合体の誤局在につながる可能性があります。

BIFC-PALM実験を設計する際に考慮すべき付加的な要因は、蛍光タンパク質に固有の発色団の成熟の遅れです。 2つのタンパク質が相互作用し、FPのフラグメントが一緒に来たら、彼らは一般的に数秒程度（EYFP ³ 60秒のハーフタイム）にリフォールディング。しかし、その後の発色団の成熟と蛍光シグナルが分程度で開発しています。蛍光はスプリット金星、高速折りたたみYFP変異体の再構成後10分以内に検出することができるが、一般的には成熟のためのハーフタイムは、多くの場合、約60分で¹⁶です。分割PAmCherry1は、同様の速度を有することが観察されました。したがって、BIFCとBIFC-PALMは現在、リアルタイムのPPIの動態を監視するための悪い選択です。他の私このようなFRETと最近開発された二量体化に依存する蛍光タンパク質¹⁷としてthodsは、この目的のために、より適しているかもしれません。

プロトコル

1.クローニング

1. リンカのクローンを作成し、選択する設定を決定します。彼らは適切なローカライズを妨害しないように、NまたはC末端のフラグメントとタグタンパク質は、以下に説明するように。そのような（GGGGS）×2として、柔軟なリンカーを使用してください。
2. 遺伝的にPAmCherry1フラグメントに目的のタンパク質にタグを付けます。一つの選択肢として、MCS配列に隣接して断片RN（PAmCherry1残基1-159）とRC（メットプラスPAmCherry1残基160から236）を含む材料のリストに記載されたクローニングプラスミドを使用しています。
   1. 挿入の時点で断片インバースPCR（または制限消化）とRNとRCを含むプラスミドを線形。逆PCRのためのプライマーは 、表1に列挙されている。以下は、筆者の研究室で使用される例のPCRプロトコルは（このプロトコルで使用される正確な材料のための材料リストを参照）です。
      1. 一緒にPCR反応ミックス、水で50μlの最終体積に育っ：薄壁にED PCRチューブ、水、2×マスターミックス25μlの、フォワードおよびリバースプライマー0.5μlの各（20μM希釈株式、0.2μMの最終濃度）、およびテンプレートの1 ngのを追加します。以下のサイクリング条件を使用してください：98℃、30秒間、98℃での30サイクルは7秒、68℃で2分間、および72℃で10分間の最終伸長のために。
   2. PCR RNとRC断片を含む線形化プラスミドへの挿入のために目的の遺伝子。 68℃での伸長時間とステップ1.2.1のように、PCRを実行します。組換えのための線形化RNとRCプラスミドの末端に（GGGGS）×2、及び15塩基対の相同性のためにこのようなGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGTなどの柔軟なリンカー配列を含むオーバーハング、を有するプライマーを使用してください。
      注：プラスミド骨格を線形化するために、表1のプライマーを使用した場合、目的のタンパク質のためのプライマーのオーバーハングは、 表2に示します 。
   3. PCRダイジェストDpn1との反応は、PCRの鋳型を除去します。 PCR反応の50μlに直接Dpn10.5μlの（20 U /μl）を追加します。 20分間、80℃で1時間加熱し、非活動化のために、37℃でインキュベートします。背景テンプレートは、後のステップで解決しない場合は、酵素の量を増やすか、消化時間を長くします。
   4. 製造業者によって記載されるようにスピンカラムを介してPCR産物を精製します。
   5. 目的の遺伝子を持つRNまたはRC断片を含む線状化プラスミドを組み合わせることライゲーション非依存の反応を実行します。精製したPCR産物の濃度を測定：酵素プレミックスの1μlの線状化プラスミド50ngのと、目的の遺伝子の50 ngのを組み合わせて、脱イオン水で5μlに全量を。氷上で15分間、場所、50℃でインキュベートし、TE緩衝液20μlを追加します。
   6. コンピテント細菌¹⁸への組換えプラスミドを変換します。
   7. O / N培養用（必要に応じて、）2-4 +コロニーを選択します。 5ミリリットルを追加します。LBブロス14 mlのポリプロピレン丸底チューブにカナマイシン（50 mg / mlのストック）を5μl、滅菌接種ループで選択された細菌コロニーを追加します。 225rpmで振とうしながら37°のCO / Nでインキュベートします。
   8. グリセロールストック¹⁹と製造業者によって記載されているようにミニプレップ残りのために、O / N培養の1ミリリットルをフリーズします。
   9. 良いクローンを決定するために、配列決定を行います。物質一覧でクローニングプラスミドを使用している場合は、融合構築物の完全な配列を得るために、必要に応じて（別個の反応に）M13フォワードを使用して、リバースプライマー。 -そのような国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）からのBLASTとしてアライメントツールを使用して、期待されるシーケンスと比較しhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi。
   10. リコンビナーゼ反応を介して発現プラスミドへの配列を検証構文を転送します。
       1. 先プラスミド＆＃75 ngのを追加します。8212;酵素プレミックスの1μlに組換えクローニングプラスミド50ngの、脱イオン水で5μlに総容量を持ち出す-このような一過性トランスフェクションまたはpLentiレンチウイルスパッケージング²⁰のためのpcDNAなど。 TE緩衝液5μlを追加し、1時間25℃でインキュベートします。
          注：レンチウイルスのパッケージングおよび安定な細胞株の生成は、例えば、各構築物のために異なる宛先プラスミドを使用し、ピューロマイシン耐性およびその他のネオマイシンとの1。これは、形質導入された細胞の二重選択を可能にします。また、そのような調整可能なドキシサイクリン調節された発現のためのtetOオペレータと構成サイトメガロウイルス（CMV）の高発現レベルのためのプロモーター、またはCMVとして、それぞれのためのプロモーターを検討してください。
       2. コンピテント細菌に5μLを変換し、ステップ1.2.6に1.2.8のようにプラスミドをミニプレップが、適切な抗生物質を（通常はアンピシリン）を使用。
3. 最適を決定しますBIFC構成。
   1. U2OS細胞（または任意のセル）に同時トランスフェクト発現プラスミド。
      1. 8ウェル＃1.5ガラスボトムチャンバースライドの各ウェルに、10％FBSを補充したフェノールレッドフリーの抗生物質を含まないDMEMの350μlのを追加します。プレートウェル当たり約7.5×10 ^{4個の細胞}の細胞は、翌日に約70％〜90％コンフルエントになるように。
      2. よく好ましい試薬を使用して、それぞれに異なる構成で、同時トランスフェクト発現プラスミドをメッキした後、製造業者によって記載されているような一日。
         1. 各ウェル0.6 mlチューブとピペットで無血清減少培地を50μlに各発現プラスミドの125 ngのを追加するために上下に混合します。管の中心ダウンと直接メディアへのトランスフェクション試薬の1μLを加えます。混合し、反応を30分間放置する優しくかき混ぜます。
         2. 約半分によってチャンバースライドの各ウェル中の培地を減らします。ウェルにトランスフェクション混合物を滴下して加えるとgを振りますまったく別混合します。 24~48時間CO _2、37℃で細胞をインキュベートし、5％。メディアにトランスフェクションの翌日を変更します。
   2. ステップ2.1.4で始まるプロトコル2のように、蛍光顕微鏡の画像セル。
      注：発現レベルが高く、カメラがPAmCherry1比較的低い光子出力のために十分に敏感である場合、試料は、標準的な蛍光顕微鏡で画像化することができます。再構成PAmCherry1分子は、緑の励起（561 nm）のフィルターセットを画像化する前に紫外線フィルターセット（405 nm）とで活性化することができます。
4. 該当する場合には、相互作用を妨害する目的のタンパク質のいずれかに点突然変異を導入するなどして、ネガティブコントロールを作成します。変異したと選択した構成の対象のタンパク質のクローニングプラスミドに部位特異的変異誘発^{21を実行します} 。
5. ウイルスへのコンストラクトをパッケージングすることにより、安定した細胞株を生成します粒子およびU2OS細胞（または選択された細胞株）に感染。誘導性（テトラサイクリン）の発現系¹⁵ BIFCの長期の不可逆性が問題になる場合、または調整可能な表現が要求されるので、もし式がイメージングの前に誘導することができるを考えてみましょう。
   注意：ウイルスパッケージングシステムの最近の世代が大幅に複製能のウイルスを産生する可能性を低減しているが、ウイルスを使った作業がバイオセーフティレベル2に分類される、いくつかのリスクは依然として存在しています。参照はで見つけることができhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/。
   1. lenti-またはレトロウイルスデスティネーションベクター^20を使用して手順を繰り返し1.2.10。ミディプレッププラスミドのより高い純度のための100mlに、O / N培養を増やします。
   2. 1日目：プレートの各構築物について10cmの皿に、約2×10 ⁶ 293T / 17細胞をパッケージ化します。
   3. 2日目：トラを使用してトランスフェクション反応を準備します選択したとメーカーによって記載されているようなnsfection試薬。
      1. パッケージングプラスミド1および2、250 ngの/μlの最終濃度のプラスミドをパッケージのプレミックスを用意し、100 ngの/滅菌水にプラスミド3を包装するためμlで。混合するために上下5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブとピペットで10梱包プラスミドプレミックスμlの無血清減少培地1mlに標的プラスミド2.5μgのを追加します。管の中心ダウンと直接メディアへのトランスフェクション試薬20μlのを追加します。
         1. 混合し、室温で30分間インキュベートし優しくかき混ぜます。細胞からの約半分のメディアを削除し、滴下方法でトランスフェクション混合物を追加します。 37℃で混合しインキュベートし軽く振ると、5％のCO _2。温度とCO ₂平衡を緩めキャップ付きチューブにプレートあたりのメディアの10ミリリットルをインキュベートします。
      2. 3日目：静かにプレインキュベートしたメディアとメディアを変更し、returインキュベーターにセルをn個。緩めキャップでメディアの別のチューブをインキュベートします。
         注意：合胞体、または大規模な多核細胞の形成は、パッケージングがうまくいっていること徴候である可能性があります。しかし、細胞は、脆弱な状態にあり、容易に取り外すことができます。メディアを変更する場合、それが水平になるようにピペッターを傾け、プレートの一方の縁部にメディアを滴下して加えます。
      3. 4日目：シリンジで培地を除去し、清潔な50mlチューブに0.45μmの孔径のフィルターを通して濾過することにより、ウイルスを収穫。静かにプレインキュベートメディアとメディアを交換。
      4. 5日目：収穫再びステップ1.5.3.3で以前に行われ、同50ミリリットルチューブに共通ろ液を組み合わせとして。各チューブにウイルスコンセントレータの6ミリリットルを加えて混ぜます。ウイルス沈殿するまで、少なくとも24時間、4℃で保存します。
         注意：細胞の健康状態に応じて、ウイルスが三度目に収穫することができます。
      5. 1,500×gで遠心分離することにより、ウイルスを濃縮します4℃で15分間。上清を吸引除去し、メディアの250μlの中でペレットを再懸濁。ウイルス感染のために直ちに使用するか、または最大1年間-80℃で50μlのアリコートで保存することができます。
      6. 感染の6ウェルプレート（ウェルあたり10％FBSを含むDMEMを2ml）に当たり、プレート約3×10 ⁵ U2OS（または標的）細胞を、細胞が感染の時点で約50％コンフルエントになるように。
      7. 次の日は、約1mlが残るので、約半分のメディアを削除します。各構築物のために濃縮したウイルス50μlのと同時感染。各ウェルにポリブレンを1μl（8 mg / mlの）を追加します。 37℃で培養し、5％CO _2。翌日のメディアを変更して、抗生物質選択の前にもう一日インキュベートします。
         注意：追加するウイルスの量は、感染の所望の速度に応じて変えることができます。ウイルスは、定量RT-PCRを用いて滴定することができます。
      8. 感染した細胞を選択するために抗生物質を追加します。 viのを見ていない、非感染細胞との別々のウェルRUSは、選択の有効性を試験するためにカナリアとして必要とされています。 2-7日間インキュベート、または選択が完了するまで。
         注意：有効濃度が最初に滴定されるべきであるが、彼らは通常、ネオマイシンのためのピューロマイシンおよび1.0 mg / mlの1.0μgの/ mlです。
      9. 大きな10cmの皿に細胞を展開し、プロトコル2に進みます。

2.イメージング固定された細胞

1. イメージングのためのサンプルを準備します
   1. 少なくとも1時間、1MのNaOH250μlのを追加することで、8ウェル＃1.5ガラスボトムチャンバースライドをきれいにし、PBSで十分に洗浄してください。
      注：未処理チャンバースライドは、典型的には、高いバックグラウンドシグナルをもたらします。さらに、細胞は、残留NaOHおよび細胞接着が困難になることができる十分にガラス面をクリーニングする障害（のような多くの10倍などの洗浄）に敏感です。必要に応じて、洗浄後、PBS、O / Nで洗浄チャンバースライドをインキュベートします。感受性細胞株、より高い密度でめっき（例えば、50％-60％初期コンフルエント）に役立つことがあります。
   2. プレート約5.5×10 ^4、10％FBSを含むフェノールレッドを含まないDMEMの350μlの中で、ウェルあたりU2OS安定発現細胞の画像化する際に細胞がコンフルエントにわたって健康ではありませんように。
   3. このようなタンパク質の発現を誘導するためにテトラサイクリンを追加するなど、実験のために必要な処置を実行します。
   4. 画像の直前に細胞を固定してください。
      1. 固定前に、新鮮なパラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製 - 3.7％PFAを1×PHEM中の0.1％グルタルアルデヒド（GA）と。 10ミリリットルのPFAソリューションでは、PFAの0.37グラムの重量を量る、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。 1mlの蒸留水および1M NaOHおよび渦の30μLを追加します。 70℃で加熱し、PFAが完全に溶解するまで、すべての1-2分の渦。
      2. 転送を15mlの円錐管にPFAを溶解し、混合するために蒸留水3.8ミリリットル、5ミリリットル2倍PHEMバッファ、25％のグルタルアルデヒドを20μl、および渦を追加します。証券、2倍PHEMバッファは12であります0mMのパイプは、50mMのHEPES、20mMのEGTA、および16mMの10 M KOHで7.0にpH調整して_、4を硫酸マグネシウム。この固定液は、数日間4℃で保存することができます。
         注意：PFAとGAは両方とも危険です。ドラフト内で溶液を調製し、両方の化学薬品を取り扱う際は、適切な保護具を着用します。吸入または皮膚との直接接触は避けること。
      3. 成長培地を除去します。 500μlのPBSで迅速に洗浄し、ウェル当たりのPFA固定液の250μlを添加します。 RTで20分間細胞をインキュベートします。
   5. サンプルからのPFA固定液を取り出して、PBSまたはイメージングバッファウェルあたり（30mMのNaClおよび20mMの_MgCl 2を、pHが8.5と100 mMトリス）の350μlを添加します。
   6. 渦100 nmの金粒子が凝集体を破壊し、撮像中のステージのドリフトを追跡するために、ウェルあたり35μL（10倍最終希釈）を追加します。
2. 画像を取得します
   1. 顕微鏡の電源をオンにします。 405および561 nmのレーザーの電源をオンにしますが、シャッターを保ちます（内部または外部）は、この時点で閉じました。 EMCCDカメラの電源を入れ、冷却します。 561 nmのフィルタが整備されていることを確認します。
   2. 取得ソフトウェアを開き、100ミリ秒の露光時間および300（範囲1 - 千）にEMCCDゲインを設定します。
   3. 客観的に液浸油を追加し、顕微鏡ステージにサンプルを固定します。
   4. 明視野または（〜1キロワット/ ^cm 2）を上の561 nmレーザーのいずれかで、焦点に試料をもたらします。
   5. Rasおよび他の膜タンパク質を画像化するために、1.49の開口数を有する60XアポクロマートTIRF対物レンズを使用し、TIRF構成に顕微鏡をもたらします。 TIRF対物レンズの背面開口を打つとき、それはオフ中心になるように、励起レーザーを調整します。これは、レーザがサンプルに到達して偏向させます。臨界角に達するとレーザーをバックに反射されるまで、レーザーを調整してください。ビューにはいくつかの金粒子を用いて画像にセルを検索します。関心領域を設定します。それは、セル（またはセル内の領域）と、金粒子を囲みます。
      注意：TIRFは、励起レーザーの侵入深さを減少させ、フォーカスバックグラウンド信号のうちを低減します。また、ドリフト補正は、より多くの金粒子が視野内にある場合に、より正確である可能性が高いです。
   6. 可能な場合は、z方向にサンプルのドリフトを補正するためにオートフォーカスシステムと係合します。画像の焦点が外れた場合はそれ以外の場合は、買収を通じて、手動でピントを調整します。
   7. （発現レベルが高く、典型的な場合）、十分な活性化が既に発生している場合に（〜1キロワット/ ^cm 2）を上に405 nmレーザーオフと561 nmのレーザーで取得を開始します。フレーム当たりの分子またはそのための単一分子の数十があるまで、必要に応じてそれ以外の場合は、最も低い工場電力設定（0.02 MWまたは0.01 W / ^cm 2）をで405 nmのレーザーをオンにして（一度に0.1 MW）を徐々に増加十分に分離されています。
   8. データ収集は、卒業生を続けていますuallyほぼ一定のスポットの密度を維持するために405nmのレーザパワーを増大させます。
      注：下部405 nmの励起パワーで、いくつかのPAmCherry1はすでに活性化され得ます。これらの分子は、光退色のように、光活性化PAmCherry1分子の残りの集団は、各フレーム内の蛍光を発する分子の同じ密度を維持するために、より高い光子束が必要と減少します。
   9. より活性化イベントを活性化しない- （10 W / ^cm 2の2.5）高い405 nmのパワーまで画像取得を続行します。
      注：合計取得時間は、相補性の発現レベルと効率に依存しています。
3. 画像を処理
   注：画像処理のための多くのオープンソース・ソフトウェアのオプションがあります。例は雷雨（https://code.google.com/p/thunder-storm/）とQuickPALM（https://code.google.com/P / quickpalm /）。典型的なデータ処理手順について簡単例としてPALMデータを処理するためwfireadというカスタムMatlabのパッケージを使用して、ここに示されています。しかし、将来の改訂はまさにここに記述されているものをフォローしない場合があります。他のソフトウェアと画像処理のため、ユーザーのドキュメントを参照してください。
   1. 画像処理ソフト（補足コードファイル）または、最新バージョンをダウンロードhttp://www.ohsu.edu/nanを 。 MATLABを開き、（既にデフォルトパスに置かれている）wfireadソフトウェアをロードします。
   2. 生の画像シーケンスを表示して、関心領域を決定します。左クリックで処理されるスタックの領域を選択し、所望の領域の周りにボックスをドラッグします。関心領域は、（約256×256ピクセルに）取得中に減少しなかった場合は、計算時間を軽減するより小さな領域を選択します。エリアの選択を解除し、フレーム全体を処理するには、右の目の任意の場所をクリックします電子イメージ。
   3. 処理されるべきフレームの範囲を入力します。
   4. 左の画像をクリックして、その周りに小さなボックスをドラッグすることで、金粒子（形状で単離し、均一である1）を選択します。粒子追跡の下では、トラックのボタンをクリックします。グラフは、ドリフトの程度を描いた、それは画像のスタック全体選択金粒子の位置を示して表示されます。
   5. できるだけ多くの金粒子を追跡し、（粒子が色分けされます）一緒に追跡するものを決定するために、このプロセスを繰り返します。理想的には全体的なドリフトは、最大で一つのピクセルのオーダーです。
   6. 個別に一度一緒に1を追跡し、金粒子を選択し、粒子追跡の下にマーカーを追加ボタンをクリックします。緑十字は、マーカーとして追加されたドリフトを補正するために使用されることを意味現れます。
   7. シグマレンジ、スムージング範囲とやや値を変更することで、必要に応じてしきい値を調整します。検索パーティクルをクリックします設定をテストするためのボタン。処理される粒子が箱詰めされ、そうでないものは除外されます。 PAmCherry1分子、比較的円形で明るい粒子は、選択されるべきです。
   8. メイクCOORD File]ボタンをクリックして画像を処理する起動し、ファイルを保存します。
      注：このプログラムは、定義されたフレームの範囲内の各フレームを通過するすべての蛍光スポットを見つけ、重心座標を見つけるためにガウシアンフィッティングを行います。 .corファイルが処理された単一分子の画像のすべての座標や他のフィッティングパラメータを格納生成されます。
4. ポストプロセス画像やヤシの画像をレンダリング
   注：抽出を調整した後、他のソフトウェアは、直接画像をレンダリングすることができます。
   1. MATLABでは、「手のひら」のパッケージを起動して、先ほど作成し.corファイルをロードします。
   2. 座標を使用してPALMの画像をレンダリングする前に、「localizatiから個々の座標（それぞれを並べ替えますイベントで '）。最適なソート値は、セットアップおよびフルオロフォアに応じて変えることができます。
      1. PAmCherry1については、次の値を使用します。フレームの組み合わせ - 8。結合距離（NM） - 100。最小RMS - 4。最小フィットの良さ - 0.25;マックス。偏心 - 1.4。これらのパラメータの追加説明のための議論のセクションを参照してください。
   3. 高解像度の画像をレンダリングするための準備ができて、座標の新しいセットを生成するために、ソートボタンをクリックします。
   4. このような生のピクセルサイズ（nm）と、レンダリングされた画像中の所望の特徴サイズ（nm）であり、レンダリングされた画像のピクセルサイズとして最終画像の適切なレンダリングのための値を入力します。
      注：生のピクセルサイズは、各セットアップのために決定されなければなりません。レンダリングされた特徴のサイズは任意に設定できるが、通常は平均局在化精度よりもわずかに高い値に設定されています。 PAmCherry1では、平均ローカリゼーション精度は約18 nmであるので、20の特徴サイズ - 30nmでappropriaですTE。注目すべきは、ローカリゼーション精度が光子の検出数の平方根で回折限界を分割して複数のフレーム²²としないで同じ分子の局在の標準偏差をとることによって算出しました。レンダリングされた画像の画素サイズに関しては、10nmで良好な出発点です。この値の設定が低すぎると拡大されていないビューのため不必要に大きな画像ファイルになります。
   5. PALM画像を生成するレンダリングボタンをクリックします。ズームイン、ズームアウトするには、Figureウィンドウのツールバーに+/-拡大アイコンを使用してください。
   6. オプション：リプリーKテストや、シミュレーション支援^{DBSCAN（SAD）23}のような他のメカニズムのいずれかを使用して再構成されたPALMの画像のクラスタ分析を実行します。注意：カスタムヤシのパッケージでは、リプリーズKとSAD分析の両方がすでに構築されています。他のソフトウェアから生成される座標の、同じ分析は、追加のカスタムスクリプトを用いて行うことができます。

生細胞中3.単一分子追跡

1. 組織培養表面を処理し、特定の培養皿を必要とするカバーガラスは、顕微鏡のセットアップのための適切な厚さ（0.17ミリメートル）を持っていることを確認し保証することができる温度および/ ​​またはCO ₂の制御段ので議定書2に記載されているように細胞をプレー。
   1. 一過性の発現をしている場合は、細胞をトランスフェクトし、発現を誘導するためにテトラサイクリンなど、実験に必要な任意の治療を行い、必要に応じてインキュベートします。これはまた、プロトコール2に記載のものと同じです。
   2. ステージ上のインキュベーターで培養皿を置きます。温度とCO ₂濃度は、培養皿を取り付けたり、関心の新しい領域に移動した後たびに安定するまで料理は数分間のステージに落ち着くしてみましょう。この段階でレーザーをブロックします。 CO ₂の制御は、そのようなLeibovとして右撮像前に、CO ₂の独立したメディアへの変更、利用できない場合ITZのL-15。
      注意：フェノールレッドを含まない培地がめいるバックグラウンド蛍光のために推奨されます。
2. しかし、プロトコル2のように画像を取得し、適切な露光時間（PAmCherry1ため、通常、25〜50ミリ秒）を設定します。
   注：軌跡が互いに重なることなく記録することができるように、分子密度が固定された細胞よりも低くなければなりません。分子の指定された数十は、約160ナノメートルのピクセルサイズで256×256ピクセルの取得のための典型的なものです。 561 nmのレーザーのパワー密度は、細胞への毒性を減少させ、平均軌跡の長さを増加させつつ、良好な信号対雑音比を維持するために、0.8キロワット/ ^cm 2としました。
3. 画像を処理します。
   1. プロトコル2、または別のパッケージに記載されているようwfireadパッケージを持つ単一分子の座標を抽出します。
   2. 見つかった別のアルゴリズムに基づいて（SPT）パッケージを追跡する様々な単一粒子を用いて、単一粒子の軌道を再構築他の場所で^24。注：別の方法として、この手順は、将来のバージョンで可能性が利用できる家庭内蔵Matlabのパッケージ（使用して達成することができるhttp://www.ohsu.edu/nanを。
   3. オプション：復興後、軌道からの変位と拡散定数を計算するために、SPTパッケージ^24を使用しています。さらに、標的タンパク質の拡散状態を決定するために追跡する変分ベイズ単一粒子^{（vbSPT）25を使用しています。} ：vbSPT Matlabのパッケージおよびドキュメントは、公式Sourceforgeのサイトで見つけることができhttp://vbspt.sourceforge.net/。

結果

示さBIFC-PALMの例は、CRAFのラス結合ドメイン（RBD）（ 図1A）との相互作用KRAS G12D変異体です。議論したように、それはRasの膜局在化、ひいては生物学的活性を破壊になるので、RNまたはRCフラグメントは、RasのC末端にタグ付けされていませんでした。これは、8から4（ 図1B）に可能な組み合わせを減少させました。これらの4つの組み合わせの各々は、レンチウイルス感染を用いてU2OS細胞に導入しました。プロトコールで詳述されるように細胞を固定し、そしてBIFC信号はPALMセットアップを用いて評価しました。 405 nmレーザーがオンになったときに正BIFC信号を有する細胞は、蛍光の急激な増加により同定しました。 561 nmのレーザーは、撮像実験を通じてでした。この蛍光の急激な変化は、405 nmのレーザーで照射する際BIFC-再構成PAmCherry1の光活性化に起因するものです。試料中の複数の領域は、このアプローチを用いて評価しました。、およびBIFC信号強度は、405 nmのレーザーからの高出力パルスの前後の画素強度の増加を平均することによっ...

ディスカッション

PALMはそのまま生物学的試料のナノスケールイメージングを可能にし、最近の単一分子の超解像顕微鏡技術である間BIFCは、細胞内でのPPIを検出し、可視化するために一般的に使用される技術となっています。手のひらでBIFCの組み合わせは、ナノメートルの空間分解能と単一分子感度で、細胞内のPPIの選択的イメージングを達成しました。 BIFC-PALMは、両方の技術の有用性を拡張し、この作品で実証されたように、それらの天然の細胞コンテキストでのPPIの分子の詳細を明らかにすることで大きな期待を示しています。具体的には、ナノメートルの分解能は、生物医学研究の課題であった分子スケールで特定のPPIの空間的および時間的規制の詳細な調査を可能にします。前述したようにしかし、BIFC-PALMは、相補性と低速発色団成熟の不可逆性によって制限されます。

分割PAmCherry1は原理を示すために使用されたUBIFC-PALMのtility。 PAmCherry1が広く、優れた光物理的特性のためにPALM実験に使用されています。 PPIに結合されたときにBIFCプローブとしてPAmCherry1を使用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
顕微鏡フレーム	Nikon	Ti-U
60X 油浸 TIRF 対物レンズ、1.49 NA	ニコン	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD カメラ	Andor	iXon Ultra 897
561 nm レーザー	オプト エンジン	MGL-FN-561
405 nm レーザー	コヒーレント	CUBE-405 50mW
561 nm ダイクロイック ミラー	セムロック	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nmフィルター	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nmノッチフィルター	Semrock	NF01-405/488/568-25
温度とCO2制御ステージ	東海ヒット	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene
http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LRClonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II チャンバーカバーガラス	Thermo Scientific		155409#1.5 ガラス底皿
U2OS細胞	ATCC	HTB-96
293T/17細胞	ATCC	CRL-11268
フェノールレッドのDMEM	ライフテクノロジー	ズ 11995
DMEM フェノールレッドなし	ライフテクノロジー	ズ 21063
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	ズ 10082
Leibovit's L-15, フェノールレッドなし	ライフテクノロジー	21083-027
減少血清中程度	ライフテクノロジーズ	31985
酸塩緩衝生理食塩水	生命技術	14040
リンジ	BDバイオサイエンス309604
シリンジフィルター	ミリポア	SLHV033RB
ウイルス濃縮器	クロンテック	631231
レトロウイルス濃縮器	クロンテック	631455
10cm培養ディッシュ	BD Biosciences	353003
6ウェル培養プレート	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	フィッシャー	BP152
EDTA	シグマ	EDS
水酸化ナトリウム	シグマ	S5881
パラホルムアルデヒド	シグ	マ 158127
グルタルアルデヒド	シグマ	G6257
パイプ	シグマ	P6757
HEPES	シグマ	H4034
EGTA	シグマ	3777
マグネシウム	シグマ	M2643
酸化カリウム	シグマ221473
塩化ナトリウム	フィッシャーBP358
塩化マグネシウム	ッシャーM33
100nm金粒子	BBIソリューション	EM。GC100
分子グレードの水	ライフテクノロジー	10977
Dpn1	ニューイングランドバイオラボ	R0176
PCR精製キット	Qiagen	28104
Miniprepキット	Qiagen	27104
Midiprepキット	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml微量遠心チューブ	フィッシャー	05-408-120
1.5 ml 微量遠心チューブ	フィッシャー	05-408-137
15 ml チューブ	フィッシャー	05-539-12
5 ml ポリプロピレン丸底チューブ	BD バイオサイエンス 352063
14 ml ポリプロピレン丸底チューブ	BD バイオサイエンス	352059
50ml チューブ	BD バイオサイエンス	352070
PCRチューブ	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB ブロス	BD Biosciences	244610
硫酸カナマイシン	フィッシャー	BP906
コンピテントセル	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks