三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Summary

A デカルトバイオプリンターは、正確で再現性のある形状でのマルチマテリアル堆積を可能にすると同時に、環境要因の制御を可能にするように設計および製造されました。3次元バイオプリンターを利用することで、複雑で実行可能な構築物を印刷し、簡単に再現することができます。

Abstract

組織工学は、機能しない組織や損傷した組織の代替品の構築に集中してきました。組織工学における三次元バイオプリンティングの利用は、生体模倣組織構築物を製造するための細胞およびマトリックスの印刷のための新しい方法を生み出しました。3次元バイオプリンティング用に開発された固体自由曲面製造(SFF)法は、細胞とハイドロゲルの液滴を層ごとに堆積させる積層造形アプローチを使用します。バイオプリンティングの作製は、生体材料を3次元構造に特異的に配置することに依存しており、プリントされた構築物は、天然組織の細胞と細胞外マトリックスの複雑な組織を厳密に模倣する必要があります。この論文では、デカルトバイオプリンターであるパルメットプリンターの使用と、空間的に組織化された実行可能な構造を生成すると同時に、環境要因の制御を可能にするプロセスに焦点を当てています。この方法論は、コンピューター支援設計とコンピューター支援製造を利用して、これらの特定の複雑な形状を生成します。最後に、このアプローチにより、制御可能な印刷パラメータによって最適化された、製造されたコンストラクトの再現性のある生産が可能になります。

Introduction

組織工学は、維持、復元、または天然組織を強化し、機能するために代替の開発に生物学と工学の原則を使用しています。オンデマンドで三次元バイオミメティック構造体を生成する機能は、組織工学におけるならびに細胞ベースのセンサ、薬物/毒性スクリーニング、組織または腫瘍モデル、およびその他における科学技術の進歩を促進するであろう。それは密接に細胞と天然組織における細胞外マトリックスの高度に組織化された相互作用を模倣する必要があるため、組織工学構造物の三次元組織は、製造方法の基本的なコンポーネントです。

生分解性と形状形成三次元足場は、細胞が、細胞の二次元の層を形成するために移行するので、新規な組織構築物を生成する際に重要な要素であるが、好ま三次元で増殖する能力を欠いています。足場は、細胞の一時的な基盤として機能します添付ファイルおよび増殖するので、制御可能な多孔性および生分解性、および十分な機械的INTEGRITを有する材料から構成されなければなりません。足場材料は、細胞毒性であるか、またはホストからの有害反応を作成することはできません。ヒドロゲルは、一般に、組織工学技術において使用されており、それらの親水性のために、ヒドロゲルはstructurを通して流体及びガス交換を可能にします。異なるヒドロゲルを組み合わせることにより、合成されたハイドロゲルの特性は、異なるアプリケーションの要件を満たすために修正可能です。

従来の組織工学的手法は、細胞ポストfabricatioを播種する無細胞多孔質の犠牲足場の作成が含まれます。多くの技術は、ファイバ結合、溶媒キャスティングのように、使用され、溶融成形が、組織工学用途のための最低限の成功であることが証明されています。繊維結合方法は、繊維を特定の形状に整列されることを可能にするが、それらは、プロだけが可能です非常に薄い足場をducing。高度に多孔質構造体を製造し、ソルベントキャスト法では、しかし、最大の製造された膜はわずか3 mmのTHICました。このため、三次元構造を作成することは、これらの技術を用いて実現可能ではありません。溶融成形技術は、三次元足場を製造するのに成功したが、このような高温は、生物学的材料は、製造プロセスへ中に組み込むことができないことが要求されます。足場は、製造後の予め定義された又は制御可能な微細構造を有する三次元の足場を製造するために、組織工学の要件を満たす能力に制限されて播種し。固体足場播種技術のもう一つの大きな問題は、血管新生及び不十分な機械的の欠乏です。

Bioprinting以来、従来の欠点を克服するために、非毒性、生分解性、熱可逆性ゲルを使用して3次元に拡張されました。固体自由形状製造トン数現在採用されてechniquesは、レーザ支援bioprintingおよびインクジェット印刷されています。レーザ支援bioprinting技術は、三次元の生成するパルスレーザ源、ターゲットプレート、および受け基板を使用します。しかし、この技術は低いスループット、低い細胞生存率に制限され、唯一の光架橋性プレポリマーは架橋ヒドロゲルを形成するために使用することができるので、製造される構造だけの限られた配置を生成することができます。インクジェット印刷は、ピコリットルのインクを堆積させることによって、基板上にデジタル画像データを再生する非接触方法として開発されました。しかしながら、インクジェット印刷は、高解像度の構築物を生成しない、経験急速なタンパク質の変性を構築し、そして細胞の多くは、堆積中に溶解されます。

現在、新たな添加剤の製造bioprinting方法が開発されています。これらのシステムでは、細胞、タンパク質、成長因子、および生体模倣ヒドロゲルは、典型的には、マトリックスに組み込まれている母校IALS製造プロセス中に、同時に密接にネイティブのマイクロアーキテクチャを模倣する三次元骨格系の細胞を含んだ構築物を生成するために、コンピュータ制御のアクチュエータを使用して堆積されます。細胞を含んだヒドロゲルは、複数の細胞型、または均質からなる、不均質であることができるbioinkを構成します。添加剤の製造システム堆積bioink滴ずつx、y及びz方向に移動することができるコンピュータ制御ステージ上または層ごとの使い捨て注射器および先端経由。コンピュータソフトウェアを介して、印刷された足場のアーキテクチャは、容易にアプリケーションの要件に応じて操作することができます。従来の技術とは異なり、3次元医用技術（磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影​​法）は、患者特異的構築物を生成し、設計に組み込むことができます。構築物は、より高いLで製造されるため、これらの方法は、血管新生の置換を生成する可能性を可能にしますOCAL細胞密度、細胞 - 細胞相互作用を可能にし、移植後のsurvivaの可能性を向上させることができます。

パルメットプリンタは、三次元の異種の組織構築物（ 図1）を生成するためにプログラム可能なロボットの製造方法を使用して特注の三次元マルチディスペンサーシステムです。それは、ユニークな組み合わせで、複数の材料の使用は、不均質構造を生成することができます。 bioprinterの初期化は、それはあなたがbioprintedコンストラクトの印刷適性を最適化するために、様々なパラメータを設定することができますのでbioprintingの中で最も重要なステップの1つです。

bioprinterは、ユーザが対話式タッチスクリーン制御パネルを介して動作するプログラマブルロジックコントローラ（PLC）、（ 図1、A）で制御起動動作および停止配列とバッチ式プロセスを含みます。バイオの汚染を防止するために、論理材料bioprinterが正に加圧されたポリ（メチルメタクリレート）で囲まれた高効率粒子arrestance（HEPA）を有する（PMMA）チャンバは、空気循環システムを-filtered（ 図1、B、C）。プリンタの内部には、内蔵の紫外線光源（ 図1、D）を用いて滅菌することができます。 bioprinterの中心的なコンポーネントは、再現性10マイクロメートル（ 図1、E）の精度でディスペンサーチップを置くことができ、完全にプログラム可能な位置決めロボットです。ロータリースクリューを使用して230 NL（ 図1、F）のように、少量を堆積することができます3ディスペンサーがあります。彼らはそれぞれのディスペンサーのための印刷パラメータ（ 図1、G）を支配する別のコンピュータを使用して、独立してプログラム可能です。ロータリースクリュー分配は、注射器の下、シリンジ先端の外bioink移動するモータ駆動スクリューの回転を利用しています。これらのディスペンサーはpneumaticalに搭載されていますロボットは、ディスペンサーを切り替えることが可能LY制御ツールネスト（ 図2A、B）は 、プログラム制御下でZ軸ロボットアーム（ 図1、H）上に取り付けられています。

XYZロボットは設計ソフトウェア（ 図1、I）を実行しているコンピュータからの印刷指示を受けます。各プログラムは、分配場所、キャリブレーション・ルーチン、およびディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。生成された構造物の設計は、主に、XYZから成り、各ディスペンサが材料を堆積する場所を調整します。 bioprinterシリンジ先端のXYZ座標を決定する2つの光の光センサ（ 図2C）を含みます 。これらのセンサは、ディスペンサー先端の位置を計算するためにこれらを使用してロボットに座標情報を送信します。 ACCURAで距離を測定するために30×100マイクロメートルのスポットサイズの633nmのダイオード赤色レーザ光 ​​を投射する追加の変位をレーザー（ 図2D）があります0.1マイクロメートルのCY。ビームが高度に集中した場合、ロボットは、印刷面のZ距離を決​​定します。この測定値、およびZにおける先端部の光学的光センサ測定値は、印刷面に関連してディスペンサー先端部を配置するために使用される正確なZ座標を計算することができます。分注チップは、X軸の中心を見つけるために、横方向にY軸センサを介してYとZの中心を見つけるために、X軸配向光学的光センサを介して横方向および垂直方向に移動し、。表面は、分配先端部の位置を基準にして場所を決定するために+ CZ = dで斧+：印刷面は、XYZ空間における平面の数式を使用してマッピングされています。プリンタステージ（ 図1、J）は 、直径80 mmのサンプルペトリ皿を保持し、設定温度（ 図1、K）を維持するために再循環水浴を使用しています。ステージ温度は、-20の範囲内に設定し、内部で安定したままこ​​とができます。 USBカメラを装着ありロボットZアームに印刷工程（ 図1、L）の間に分配チップの拡大図を提供します。印刷工程（ 図1、L）の間にbioprinterの完全なビューを提供し、チャンバ内部の上面に向けて取り付けられた第2のカメラがあります。

ソフトウェアを描画するコンピュータ支援設計は、堆積パターンを決定し、増分的に離間した液滴や複雑な構造（ 図3）を生成することを可能にします。三次元の経路を手動でプリンタと互換性のある設計ソフトウェアにコード化または別のコンピュータ支援設計図面ソフトウェア（ 図4、表1）からインポートすることができます。プリンタ対応のソフトウェアは、印刷、このような蒸着法（単一打滴または連続経路蒸着）などのパラメータ、経路の三次元形状、堆積速度、シリンジ先端との間の距離とSUBSTのバリエーションを可能にしますレート印刷面、個々のドロップ、および高さを堆積し、注射器を高速化するための時間の量は、液滴の堆積の間に持ち上げられます。各プログラムは、印刷時に、オペレータの介入なしに、無菌環境を提供するために、XYZ調剤場所、先端校正ルーチン、ディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。ロボットのプログラマブル・ロジック・コントローラ（PLC）は、設計ソフトウェアを実行するコンピュータからの指示を受けて、外部コントローラ（例えば、ディスペンサー）からのイベントのタイミングを制御する。これを行うには、PLCは、ディスペンサーを制御するためにループ・メカニズムを使用して、ロボット位置決め装置、および環境要因。

三次元直接書き込みロータリースクリュー、液体分配システムを利用しbioprintingが堆積細胞の処理は、従来の方法よりも、効率的で正確、かつ容易にすることができます。本研究では、カスタム構築されたbioprinterは、CEを生成することが可能であることを示していますLLを含んだヒドロゲルは、高い細胞生存率を構築します。

Protocol

アルギン酸ハイドロゲルの三次元Bioprintingのための基質を含むゼラチンの調製

1. 高いコンテンツに関連する減少した生存可能性を回避するためにPataky ら ¹¹により記載のカルシウム/ゼラチン基質法以下のカルシウム/ゼラチン基板を準備します。カルシウム/ゼラチン基質法は、以下に記載されています。
   1. 塩化カルシウム水和物（1.5重量％）、塩化ナトリウム（0.9重量％）、およびブタゼラチン（2重量％）を蒸留水に結合し、100mMのゼラチン溶液を作成し、2分間沸騰させます。
2. （少なくとも8をゲル化することを可能にする100ミリメートルにゼラチン/カルシウム溶液5mlを入れ標準ペトリ皿で​​も、表面にコーティングするために周りのソリューションを旋回し、ゲル、O / Nに冷蔵庫で平らな面に置き使用前に時間）。
3. 基板表面の不透明度を高めるために、ゼラチン/ _塩化カルシウム溶液に二酸化チタン（0.3重量％）を加えます。 10分間攪拌します。 AUTそれを滅菌するために30分間液体サイクル上のゼラチン/ _TiO 2のソリューションをoclave。
   1. 先に調製したゼラチンプレートの表面にゼラチン/ _TiO 2の溶液3mlを追加します。それが表面に均一に広がっていることを確認するために、混合物を渦巻。 （使用前に少なくとも8時間をゲル化することを可能にする）4℃の冷蔵庫のO / Nでゲル化することができます。基板は、3日以内に使用しなければなりません。

2.アルギン酸酸化

1. 以下で説明するBouhadir ら ³⁰によって部分的に酸化されたアルギン酸塩のための方法以下のアルギン酸ナトリウムbioinkを酸化します。
   1. 5％酸化アルギネート溶液を作るために、100mlの蒸留水にアルギン酸ナトリウム1gを溶解します。 5％の酸化溶液を生成するために、過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液（0.25 M、0.25 mmol）を、酸化剤を加えます。室温で19時間撹拌します。 REAを終了するために24時間後の溶液に40 mlのエチレングリコールを追加ction。
   2. 溶液中の塩化ナトリウムを2.5g溶解します。酸化されたアルギン酸塩を沈殿させるために：（1比2）エチルアルコールの過剰量を追加します。沈殿物を収集するために千×gで遠心分離し、溶液を蒸留水で再溶解します。エタノール洗浄を繰り返します。
   3. 凍結乾燥使用するまで-20℃で酸化アルギン酸ペレットと店を。
2. ナトリウムの割合を測定することにより、酸化の程度を決定するエチレングリコールによって終了される前に消費素酸。
   1. ヨウ化カリウム溶液（w / vの20％、pH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液）およびthyodene溶液（w / vの10％、pH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液）を準備します。室温で酸化アルギン酸を持つ2つの溶液を混合。
   2. 徐々にヨウ化カリウムとtheodyne溶液の混合物に反応させ、アルギン酸ナトリウム素酸水溶液をドロップします。 426 nmで分光光度法、混合物の吸光度を測定します。それが到達したときに最大値は、V ₁としてアルギン酸塩及び過ヨウ素酸ナトリウム溶液を使用量を記録します。
   3. 反応があります 。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの量は、
   4. 過ヨウ素酸ナトリウムの消費量を決定するために、元の濃度から未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの量を差し引きます。前の式を使用して、アルギン酸塩の最終的な酸化度を決定します。

3.アルギン酸ペプチドコンジュゲート

1. ローリーら ³¹により、RGD-アルギン酸結合方法に従うことにより、先に調製した酸化アルギン酸塩にさらさアルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列（ペプチド）との結合体のリガンドは、細胞の付着および拡散を促進するために、以下に説明。
2. 水carbodを使用してくださいG ₄ RGDSPto複合体³¹とiimide相性。
3. 0.1 M 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液中の5％の酸化アルギナート1gを溶解し、pHが4 = 1-エチル - （ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC、0.54ミリモル）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（追加します2のNHS、0.27ミリモル）：1の比率は、アミド中間体を形成します。
4. 末端アミンを介しアルギン酸塩ポリマーの主鎖に結合させる、0.28ミリモルペプチドを追加します。 RT O / Nで撹拌。
5. この溶液に2.5グラムの塩化ナトリウムを添加することにより、カップリング反応を停止させます。酸化されたアルギン酸塩を沈殿させるために：（1比2）エチルアルコールの過剰量を追加します。沈殿物を収集するために5分間4,000×gで、混合物を遠心。細胞培養フード内でメディアを吸引し、蒸留水で沈殿物を再溶解します。エタノール洗浄を繰り返します。
6. 後で（白色粉末状物質として表示されます）、それが完全に乾燥するまで沈殿物を乾燥、凍結とCの冷蔵庫°-20で店使用しています。

4.ヒト脂肪組織の間質細胞（hADSCの）細胞培養

1. 培養ヒト脂肪組織間質細胞（hADSCの）10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％グルタミン、および1％のアンチマイシンで15 mlの低グルコースDMEMで覆われた細胞培養フラスコ（T75フラスコ）で処理した75センチメートルです。彼らはコンフルエント（80〜90％）に到達するまで、2日ごとに、細胞培養フード内で、メディアを変更します。
2. 集密したら、細胞培養フードにT75フラスコを転送し、トリプシン酵素消化法を用いhADSCのを中断する。
   1. フードでは、細胞からの細胞培養培地の全てを吸引します。カルシウムとマグネシウムとのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS ++）5mlで洗浄します。細胞のオフDPBS ++を吸引します。
   2. フード内が、1ミリリットルトリプシンおよび4ミリリットルのDPBS ++を混合することにより、トリプシンおよびDPBS ++のソリューションとなります。各フラスコをsolutの5ミリリットルを必要としますイオンは、そのようにコンフルエントなフラスコの数の適切なボリュームを作ります。各フラスコにトリプシン/ D​​PBS ++の5ミリリットルを加え、2分間インキュベーターに入れて。
   3. 2分後、フラスコを取り除き、軽く底から細胞を緩めるために、それらの側面をタップします。細胞が中断されることを保証するために、顕微鏡下で各フラスコを見てください。バック細胞培養フード内でフラスコを置き、各フラスコに、適切な細胞培養培地の3ミリリットルを追加します。これは、トリプシン反応を終了します。
   4. 各フラスコから細胞を含んだメディアを転送し、50mlの円錐に入れます。 5分1,000×gで、それらを遠心。細胞は、円錐の底に小さな白いペレットとして表示されます。バック細胞培養フードに移し、メディアを吸引除去します。細胞培養培地2mlに細胞を再懸濁。
   5. 顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞を数えます。細胞は培養フードで、カウントされた後、アリコート〜1.3 millioを含む培地の量n個の細胞、15 mLコニカルに移します。遠心千×gで5分間、再び細胞を含む15 mlのコニカル。
   6. 培養フードでは、各フラスコに〜35万細胞の濃度を追加して、複数のT-75フラスコ内の残りのセルを再シード。 DMEM培地の15ミリリットルを追加して、再度コンフルエントになるまで培養器に戻します。
   7. 遠心分離サイクルが完了すると、細胞培養物に15 mlの円錐を返します。吸引し、細胞ペレットからのメディア、およびbioinkを通して細胞の均一な分布があるので、多くの場合、解決策をterteriating、bioink 1ミリリットル当たり130万個の細胞の濃度で水性アルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。無菌プリンタ互換の3ミリリットルシリンジに細胞を含んだソリューションをロードし、滅菌した22 Gプラスチック先端にネジ止めします。

5. Bioprinterセットアップ

1. bioprinter、ディスペンサーの各コンピュータ、およびrecirculatをオンにします水浴をる。
   1. 手動でゲル化機構のために再循環水浴温度を設定します。
   2. 手動相関ディスペンサーコンピュータ上の各ディスペンサー用の印刷パラメータを設定します。 230 NL、0にバックステップ数、-sec10μLするの分配率に分注容量を設定します。
2. 設計ソフトウェアとコンピュータのUSBカメラのディスプレイを表示するためのプログラムを開きます。
   1. ソフトウェアを使用して、手動で液滴間の2.4ミリメートル間隔で5×5ドットアレイの座標を入力します。
   2. なるように印刷パラメータを設定します。先端と基板表面との距離= 0.1ミリメートル;高さの注射器は、堆積の間に持ち上げられる= 20ミリメートル; = 1秒あたりの堆積時間。
   3. プログラムを保存して、ロボットに送信します。
3. 4°Cプリンタのステージ上でのゼラチン/ _TiO 2を含有するペトリ皿を置きます。閉じて、室のドアをロックします。
4. INIにPLCを使用してください紫外線光源をtialize、90秒間チャンバを殺菌。
5. 滅菌が完了したら、チャンバーを開き、hADSCの銃にアルギン酸に懸濁1.クローズを含む注射器をロードし、室のドアをロックします。
6. 平衡内圧のために30秒を待って、ファンシステムをオンにするために、PLCを使用してください。
7. コンピュータでは、幾何学的な経路及び印刷パラメータを含むプログラムを実行します。
8. 印刷プロセスを通して、正確で均一な印刷を確認するために、コンピュータにUSBカメラのディスプレイを見ます。
9. 印刷が終了したら、構築物は、40分間、ゲル化することを可能にします。

6.細胞生存率の評価

1. DMEM中ですぐに印刷後画像形成されるようになっていない構造体を覆い、撮影時まで、インキュベーター内で保管してください。
2. 構築物の生存度を定量するために、蛍光ベースの生存性/細胞毒性アッセイを使用して染色し、共焦点顕微鏡を用いて目の画像。
   1. キットの指示に従って、カルセインAMおよびエチジウムホモダイマー1を含む染色液を準備します。 、染色溶液10mlを行い、エチジウムホモダイマー120μlのカルセインの5μLを追加するには、無菌の10mlまで午前、組織培養グレードのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（+マグネシウム+カルシウム; DPBS ++）。
   2. 暗所で15分間染色液でbioprinted構成体を浸し。
   3. 画像0日と8で共焦点顕微鏡システムを用いて染色構築物は、300ミクロンの深さで30光学スライスのZスタックパラメータを使用して、各bioprintedコンストラクトの複数の写真を撮ると、手動で細胞をカウントします。細胞は、黄色または緑色の表示された場合などの生きているそれらをカウントし、赤の場合には、死んだとして、それらを数えます。
3. 構築物中の細胞の総数で割った生細胞の数と細胞生存率のパーセンテージを計算。の細胞生存率=数生細胞（緑+黄色）/総細胞数（緑+赤+黄色）×100％。
4. 8日目の細胞数は、0日目に、細胞数で除し、各サンプルについての細胞増殖の量を計算します。 8日目/生細胞の細胞増殖=生細胞数日の0×100％にカウントします。

7. RGDペプチドコンジュゲートの分析

1. アルギン酸のRGDペプチド結合の成功を分析するために、RGD共役アルギン酸塩と非共役アルギン酸塩を比較します。これを行うため、画像印刷（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）（DAPI）を用いて構築し、ファロイジン染色。
   1. DPBS ++200μlのメタノール原液の5μLを希釈して使用液をphalloidinsを行います。使用するまで-20℃で保存してください。
   2. （0.10509グラム/ L）/（350.3グラム/モル）= 3×10 ^{-4 M} = 0.0003 M = 0.300ミリモル= 300μM：以下の式DAPI染色の300μMのストック溶液を作ります。目を作ります3μM溶液を得たDPBS ++で100：原液1を希釈することにより、電子のDAPI作業溶液。使用するまで-20℃で保存してください。
2. 完全に4％パラホルムアルデヒドでサンプルを沈めます。室温で1時間インキュベートします。溶液を5分間ずつ洗浄静置し、DPBS ++で3回洗浄します。プロセス中のゲルを裏返し、スライドガラスによくからゲルサンプルを転送します。 10分間、DPBS ++中の0.1％トリトンX-100中でゲル（0.1グラム/ 100ml）に浸します。各洗浄のために5分を可能にすること、DPBS ++で3回洗浄します。
3. 作動溶液中に浸漬することによってファロイジンを有するプリント構築物を染色します。ホイルで覆い、4時間インキュベートします。ファロイジン染色を取り外し、DPBS ++で3回洗浄します。最初の洗浄は、後者の洗浄は5分ごとに座るべきで、高速である必要があります。
4. DAPIワーキング溶液中に浸漬することによって、DAPIを備えたプリント構造物を染色します。ホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。ウォッシュ各洗浄を5分間静置しDPBS ++で3回。共焦点顕微鏡システム上のサンプルを観察し、画像。

Results

結果はbioprinterを正確かつ一貫してコンピュータ支援ソフトウェアを使用して、特定の3次元の位置でセルを含んだヒドロゲルを堆積させることが可能であることを示しています。これらのソフトウェアは、各液滴の配置を決定した （図3,4）を分配するためのパラメータの多くを制御します。適切に生体材料を堆積させるbioprinterの再現は、組織工学アプリケーションでの成功の基本です。

細胞生存率、成功bioprinting技術の要件の1つは、1時間および印刷後8日目に分析しました。高い細胞生存率は、バイオミメティック構造体を製造するために不可欠であると十分なbioinkの直接表現です。 RGDペプチドの結合は、細胞拡散を促進することにより、長期間にわたって細胞生存率を向上させます。蛍光顕微鏡は、印刷工程の後に構築物中の細胞生存率を定量しました。 concentrとアルギン酸bioink15％と5％の酸化ationが0日目98％の生存率、96％の4日目、及び95％の8日目（ 図5）を有していました

Discussion

組織工学の主な焦点は、復元維持、または天然組織のfunctioを向上させることが可能な生物学的な代替を開発することによって、臓器不足や移植の必要性との間のギャップを埋めることです。これは、複合体と足場の直接製造、解剖学的に正しい外部ジオメトリ、および内部geometrを正確に制御するに至りました。三次元bioprintingはレイヤー・バイ・レイヤーapproacを用いてデジタルモデルから様々なサイズおよび形状の三次元構造を生成するために使用される方法です。三次元の生体模倣コンストラクトの作製は、組織工学の発展において重要な役割を果たしています。

生成された構造物の生体模倣functioに影響を与える設計プロセスの重要な側面があります。生体材料と基板の温度を制御する能力は、ヒドロゲルのゲル化メカニズムとその私の維持に必須ですしたがって、ハイドロゲル内の細胞分布、増殖および分化に影響を与えるchanicalプロパティ。器官は、多くの細胞型で構成され、そのように多数のディスペンサーは、異種、組織様構造を製造するために重要です。外部のアーキテクチャのコンピュータ支援設計は、明確な傷や組織...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
位置決めロボット(JR2000 XYZ)	ジャノメ
ディスペンサー: SDAV リニアドライブ SmartDispensers	フィッシュマンコーポレーション
光学光センサー:	Keyensce
変位レーザー:OD Mini	SICK
再循環水浴:Polystat	Cole-Parmer	EW-12122-02
USBカメラ:Dino-Lite Premier 5MP	AnMo Electrionics/YSC Technologies	AD7013MT
プリンター対応コンピュータ設計ソフトウェア:JR-Cポイント	Janome		Robotの購入に付属
コンピュータ支援設計製図ソフトウェア: Visual PathBuilder	RatioServ		ダウンロード先: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Printer 3 cc Syringes:	フィッシュマンコーポレーション	122051
22Gディスペンサーのヒント	フィッシュマンコーポレーション	Z520122
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	10035-04-8
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	7647-14-5
豚ゼラチン	Sigma-Aldrich	9000-70-8
二酸化チタン	Sigma-Aldrich	13462-67-7
プロタナールLF 20/40 アルギン酸 (アルギン酸ナトリウム)	FMC BioPolymer	9005-38-3
塩酸	Sigma-Aldrich	7647-01-0
エチレングリコール	Mallinckrodt Baker, Inc	9300-01
過ヨウ素酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	7790-28-5
hADSC	ロンザ	PT-5006	使用時まで液体窒素のバイアルに保管してください。
ダルベッコのモディファイドイーグルのミディア	ギブコライフテクノロジー	ズ11965-0923	37で暖かい。使用前にC水。
トリプシン/EDTA	ロンザ	CC-5012	37°Cで暖かい;使用前にC水。
Calcein AM	Gibco Life Technologies	C3100MP	-80°Cで暗闇の中で保管。使用までC。
生/死んだ哺乳類生存率アッセイキット	Invitrogen Life Technologies	L-3224	-80°Cで暗闇に保管します。使用までC。
MESハイドレート	Sigma-Aldrich	M2933
N-ヒドロキシスクシンイミド	Sigma-Aldrich	130672
1-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)	Sigma-Aldrich	E1769	10グラム
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、+カルシウム、+マグネシウム	ライフテクノロジー	14040133	37°Cで暖かくなります。使用前にC水。
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、-カルシウム、-マグネシウム	ライフテクノロジー	14190144	37°Cで暖かいです。使用前にC水。
RGD Peptides	International Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain	Invitrogen Life Technologies	A22283	-20 >C 使用時まで
(4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール, 二塩酸塩) (DAPI) Stain	Life Technologies	R37606	-20 °C で保存;Cは使用まで