イントラ小胞体のCaの光学マッピング 2+とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

サマリー

この記事では、ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における詳細なプロトコルおよび膜貫通_電位 （Vm）のデュアル光学マッピングとフリーイントラ筋小胞体（SR）のために必要な機器のCa ^{2+を説明しています。}この方法は、無傷の中心部にあるV _mとSRのCa ²⁺動態の直接観察と定量化を可能にします。

要約

筋小胞体 (SR) Ca²⁺ の取り扱いは正常な励起収縮結合において重要な役割を果たし、異常な SR Ca²⁺ の取り扱いは特定のタイプの不整脈において重要な役割を果たすことが知られています。不整脈は空間的に異なる創発的な現象であるため、組織レベルで調査する必要があります。しかし、無傷の心臓でSR Ca²⁺を直接プローブする方法は依然として限られています。この記事では、Langendorff灌流ウサギ心臓における膜貫通電位(V_m)および遊離内SR [Ca²⁺]([Ca²⁺]_SR)の二重光学マッピングのプロトコルについて説明します。このアプローチは、低親和性のCa²⁺インジケーターであるFluo-5Nを利用しており、細胞内[Ca²⁺]([Ca²⁺]_i)が比較的低いサイトゾルでは蛍光が最小限に抑えられますが、[Ca²⁺]_SRがミリモル範囲にあるSR内腔では有意な蛍光を示します。このアプローチには、心臓の心外膜表面全体で空間的にSR Ca²⁺の特性を明らかにするだけでなく、V_mの同時モニタリングという明確な利点があり、V_mとSR Ca²⁺の双方向関係、および不整脈発生現象におけるSR Ca²⁺の役割についての調査が可能になります。

概要

無傷のランゲンドルフ灌流心臓における細胞内^Ca2+と膜貫通電位(V_m)の二重光学マッピングは、不整脈や興奮収縮結合のメカニズムを含む心臓電気生理学の研究の主力となっています^1-4。このアプローチは、正常および異常な電気生理学、そして重要なことに、V_mと細胞内Ca²⁺との間の双方向の関係に関する前例のない知識を提供しました。しかし、高親和性蛍光インジケーター(Rhod-2やFluo-4など)を用いた細胞内Ca²⁺の光学マッピングでは、細胞内Ca²⁺のバルク変化のみが報告され、これらの変化が膜貫通型Ca²⁺フラックスによるものなのか、細胞内貯蔵への放出と再取り込みによるものなのか、あるいはほとんどの場合、その両方の組み合わせによるものなのかを区別することはできません。さらに、高親和性Ca²⁺指標はオンオフ速度が遅く、Ca²⁺濃度^の急激な変化を正確に報告しない場合があります5。

各活動電位は、細胞内Ca²⁺トランジェント(CaT)として知られる細胞内Ca²⁺の上昇を引き起こします。哺乳類の心臓では、全CaTの約70〜90%が、リアノジン受容体(RyR⁾⁶の開口部を介して筋小胞体(SR)から^Ca2+が放出されることによるものです。SR内では、全Ca²⁺の約半分がカルセケストリン(CSQ)および他のSR内緩衝液⁷に結合しており、これらはSR Ca²⁺恒常性^8,9において重要な役割を果たす。遊離SR Ca²⁺の量は、SR Ca²⁺放出の原動力とRyRのゲーティングを決定するため、細胞内CaTに大きな影響を与えます。さらに、SR Ca²⁺の放出または再取り込みの変化は、電気起源のNa⁺-Ca²⁺交換を介してV_mに影響を与える可能性があり、これは不整脈の原因となる可能性があります。したがって、CaTに加えて、遊離SR Ca²⁺のモニタリングは、収縮性および電気生理学的機能障害に関する重要な洞察を提供することができます。

過去数年間で、研究者たちは、孤立した心筋細胞におけるSR Ca²⁺のモニタリングにおいて、無傷の心臓の単一の場所からのモニタリングにおいて大きな進歩を遂げました。そのような方法の1つは、RyRsを開くためにカフェインの急速なパルスを必要とし、SR Ca²⁺含有量は、細胞内Ca²⁺¹⁰の即時上昇から推測または計算されます。別の興味深いアプローチは、Fluo-5N¹¹やMag-Fluo4¹²などの低親和性Ca²⁺インジケーターを使用し、遊離SR^{Ca 2+}に結合します。これらの指示薬は、解離定数_(KD) が 10 から 400 μM の範囲にあるため、Ca²⁺ 濃度 ([Ca²⁺]_SR) がミリモル範囲にある SR 内腔と比較して、サイトゾルでの蛍光が最小限に抑えられます。低親和性Ca²⁺指標を用いて、SR Ca²⁺サイクリングのいくつかの側面が単離された筋細胞のレベルで調査されており、これにはフラクショナルSR Ca²⁺放出やCa²⁺オルタナンのメカニズムなどが含まれている^13,14。しかし、無傷の心臓におけるSR Ca²⁺サイクリングの不均一な性質と、空間的に異なる不整脈現象におけるSR Ca²⁺の役割を完全に理解するためには、無傷の心臓の心外膜表面全体でSR Ca²⁺をイメージングする方法が必要である¹⁵。

この記事では、無傷のランゲンドルフ灌流ウサギ心臓における遊離SR Ca²⁺とV_mの二重光学マッピングの方法論を、低親和性のCa²⁺指標Fluo-5Nを用いて説明しています。このアプローチには、心臓の心外膜表面を横切って空間的にSR Ca²⁺の特性を明らかにするだけでなく、V_mの同時モニタリングという利点があり、V_mとSR Ca²⁺の間の双方向の関係を調べることができます。

プロトコル

動物に関わるすべての手続きは、カリフォルニア大学デ​​ービス校の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に付着させました。

1.準備

1. 4℃に予め、店舗で修正されたタイロード液の2集中（25X）の株式を準備します（1）株式のI（MM中：NaClの_3205、CaCl 2を32.5、塩化カリウム117.5、のNaH ₂ PO ₄ 29.75、のMgCl ₂ 26.25）と（2）株式II（MM中：のNaHCO ₃ 500）。
   1. NaClの128.2、 _塩化カルシウム1.3、塩化カリウム_4.7、MgCl 2を1.05、のNaH ₂ PO _{4 1.19、NaHCO} 3で20、脱イオン（DI）の1840ミリリットルを組み合わせることにより、11.1グルコース：たて（MM）で、以下の組成の2 Lのタイロード溶液を調製水、80ミリリットル証券私、証券IIの80ミリリットル、およびグルコースの4グラム。直接株式私と証券IIを混在させないでください。加えます沈殿を回避するために1840ミリリットルのDIにメートル。
2. 事前に無水ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mg / mlで興奮収縮脱共役剤のブレビスタチンの原液を調製し、4℃で保存溶液を保存します。
3. 蛍光色素のストック溶液を準備します（1）電位感受性色素RH237（DMSO中1mg / ml）及び（2）低親和性のカルシウム指示薬フルオ-5N AM、製造業者の推奨に従って（DMSO中に2mg / ml）を。積載量のその後の損失と分解を避けるために、すぐに準備を使用してください。
4. プライム酸素（95％O _{2、5％CO 2）}タイロード溶液で再循環ランゲンドルフ灌流システム。 7.4±0.05でタイロード液のpHを維持するために、O ₂ / CO ₂の流れを調整します。継続的に灌流液をフィルタリングする：イン・ラインナイロン織りネットフィルター（11μmの孔サイズ）を使用します。
   1. その後のLOADIとして内閣総理RTで灌流システム、Fluo-5N AMのNGを室温で行われます。フルオ-5N AMローディングのために、再循環灌流液の少量（〜150ミリリットル）を使用します。色素負荷後、灌流液の大量使用（1 - 2 Lを、 図1Cを参照）。
5. データ収集システムの電源をオンにし、ECGおよび灌流圧を連続的に監視するための準備。圧力監視システムを準備します。灌流ラインに圧力変換器を接続し、transbridgeアンプで灌流圧を監視します。心臓が灌流システムに接続されていないとき0 mmHgのベースライン潅流圧を調整します。
6. V _mとSRのCa ^{2+シグナル}との間の空間的な位置合わせを確実にするために、光学マッピングカメラの位置を合わせます。
   1. まず、灌流皿にルーラーやテキストを使用してオブジェクトを配置することによって、カメラの焦点を合わせます。ライブビューモードにマッピングカメラを回して、テキストはくっきりと鮮明になるまでフォーカスを調整します。各カメラから単一のフレーム画像を取得します。
   2. オーバーレイこれらの画像との両方の画像が表示されるように、トップ画像の透明度を調整します。画像内のテキストが正確にオーバーラップする必要があります。完全に整列していない場合、2つの画像が位置合わせされるまで、ダイクロイックミラーまたは各カメラの位置の角度を調整します。

2.ウサギの心の収穫、灌流、および色素ローディング

1. 承認されたウサギの制止にウサギを固定します。深くペントバルビタールナトリウム（50mg / kg）およびヘパリン（千IU）の静脈内注射（辺縁耳静脈）を介して麻酔。
   1. ウサギは、侵害受容反射の欠如を表示する場合は、胸骨と肋骨を露出するために正中線皮膚切開を行います。胸骨柄の剣状突起から鈍い先端の外科ハサミで胸骨を切断。胸骨を開いている間に心を傷つけないように注意してください。心臓を露出するためのリブを広げます。
   2. すぐに急速にすべての血管および結合組織を切断することにより、全体の心肺ブロックを切り出します。 Immediately氷冷タイロード溶液中に心肺ブロックを配置します。
2. 逆行性灌流のための大動脈の位置を確認します。大動脈弓の3支店のすぐ近位上行大動脈をカットします。灌流システムに接続された8 Gカニューレに大動脈にカニューレを挿入。カニューレ上に大動脈を確保するために、USP 0絹縫合糸の一部を使用します。
3. 慎重に心臓から気管、肺、および心外膜脂肪を分析。鋭いピンセットと解剖ハサミで、僧帽弁を見つけて、慎重に左心室内の溶液の混雑を防ぐために、1リーフレットを損傷したり、削除します。
4. イメージングのために上向きに心臓の前面と水平にガラスジャケット付き灌流チャンバーに心を沈めます。マッピング（ 図1D）の間、心臓の動きを防止するために皿のシリコン底部にU字型ピンとシルガードの片にカニューレを固定します。必要に応じて、STAのための心の頂点に小さな虫ピンを挿入bilization。
5. ポジション心電図（ECG）は、心臓の右側と左側にバス内の電極。完全に浴に電極を浸し、彼らがリード私の構成に類似したボリューム行わ心電図を提供するために、心臓の表面に接触していないことを確認します。通常のリードI ECG形態を確認してください。 70 mmHgの - 大動脈圧は60に維持されることを確実にするために - （35ミリリットル/分25）の流れを調整します。
6. 部屋の照明をオフにして、0.3を追加 - （ - 20μMの最終濃度10）灌流液にブレビスタチン原液（ステップ1.2）の0.6ミリリットルを。
   1. ブレビスタチンの光不活性化を回避するために、部屋の照明をオフにします。必要に応じて、小さなスポットライトやヘッドランプは、作業照明を提供するために使用することができます。
      注意：ブレビスタチンは、ミオシンATPアーゼ阻害剤および興奮収縮脱共役剤です。フルオ-5Nの荷重が延長（60分）、RT（低体温）条件（ステップ2.8を参照してください。 - 2.10）を必要とするので、心臓のエネルギー生産が損なわれることがあります。目ereforeは、ロードを染める前に灌流液へのブレビスタチンの添加は、エネルギー需要^{16を削減し、}その後の光学記録¹⁷の間にモーションアーチファクトを除去することができます。
7. 心臓の収縮が停止した場合（10 - 大動脈圧の記録に検証15分）、小容量循環灌流システム（ステップ1.4.1を参照）に切り替えます。
8. 準備したFluo-5N AMのローディング溶液をロード：0.25ミリリットル暖かい20％プルロニックF127にフルオ-5N AM原液（ステップ1.3）の0.25ミリリットルを追加します。 0.5mlの混合物に暖かいタイロード液を加えよく混ぜ、および小容量循環灌流システムに追加します。
9. 連続灌流圧と心電図をモニターし、必要に応じて流れを調整します。色素負荷は、室温で約1時間かかります。ロードが開始された45分後、37℃に灌流システムおよび灌流液を暖め始めるために循環水浴をオンにします。
10. フルオ-5N AM搭載の60分後、SWI大容量循環灌流システムに灌流をTCH（ステップ1.4を参照）。
11. 温かいタイロード液1mlに電位感受性色素RH237ストック溶液（ステップ1.3）、50μlの希釈し、カニューレに注入口の近位に（〜5分かけて）ゆっくりと加えます。

3.光学マッピング

1. 色素負荷の最後の瞬間の間に、心を合わせて、実験用のビューの適切なフィールドを確保するために、光学マッピングカメラの焦点を合わせます。
2. 必要に応じて、ペーシングのために心臓の心外膜表面に双極ペーシング電極を配置します。
3. 灌流液の循環に存在することができる液面にモーションアーチファクトを低減するために灌流チャンバーの表面のプラスチックまたはガラスカバースリップを置きます。
   注意：カバースリップに代わるものとして、クリーンなプラスチック製の50ミリメートルのペトリ皿のカバーを使用しています。
4. 均一Eで心臓の表面を照明する光ガイドをフォーカスxcitation光。 495 nmのバンドパスフィルタ（ 図1A） -青色発光ダイオード（LED）光源を使用し、さらに475の光をフィルタリングします。
5. マクロスコープ及び二つの相補型金属酸化膜半導体（CMOS）光学的マッピングカメラで放出された蛍光を集めます。 545 nmのダイクロイックミラーで放出された光を分割します。
   1. ロングパスは700 nmで、V _mの_信号を含む、より長い波長成分をフィルタ。 534ナノメートル（ 図1A） -バンドパス502から、SR ^の Ca 2+シグナルを含む、短波長成分をフィルタリングします。 1 kHzの - 0.5に光データ収集の頻度を設定します。
6. 各光記録のために、第1の所望のペーシングプロトコルを開始し、励起光をオンにし、1収集 - データの4秒。必要に応じて、ペーシングプロトコルとデータ収集を同期させます。
   注：これは、再ロードのFluo-5N AMすることは不可能であるので、信号対雑音比（SNR）がdecreaますSE、SRからの漏れを染料による実験を通して。高いSNR値を確保するために、2時間 - 1に実験プロトコルを制限します。
7. 実験の後、DI水で再びDI水、70％の試薬アルコールの順序で灌流システムを洗浄し、。
8. 製造業者のプロトコルに従って、市販のソフトウェアパッケージを使用した空間ガウスフィルタ（半径3ピクセル）と各データセットをフィルタリングします。
9. 必要に応じて、空間V _mとSR ^の Ca 2+のデータセットを整列させます。ステップ1.6のように、各カメラからの画像をオーバーレイし、検証し、そのビュー（ すなわち、カニューレ、ペーシング電極）の分野における心臓の解剖学的構造（すなわち、冠血管系、心房のエッジまたは心室）、またはその他の項目を正確に重複。そうでない場合、データセットの空間的な位置合わせが必要です。
10. 正確なオーバーラップが達成されるまで、画素数のノートを作り、x軸とy方向に上部の透明画像をシフト画像は、それぞれの方向にシフトしなければなりません。トップ画像（V _mまたはSRのCa ²⁺のいずれか）に対応するデータセット全体は、その後、V _mとSRのCa ²⁺データセット間の正確な位置合わせを保証するために、各方向の画素の決定された数だけシフトする必要があります。

結果

図1Aは、二重のV _mおよびSR ^の Ca 2+マッピングの光学的構成の概略図を示します。この設定では、V _mの完全なスペクトル分離とSRのCa ^{2+シグナル} （ 図1B）があります 。フルオ-5N染料ロードに使用デュアルループ灌流システムの図を図1Cに示されている。 図1Dは 、灌流皿の中の心の水平方向を示しています。代表V _mとSR ^の Ca 2+心臓の心外膜表面上の異なる位置から連続ペーシング時の光跡は、 図2Aに示されています。このセットアップでのビューの光学視野は、x 31 mmの31ミリメートルであり、視野内の中心部の向きは、図2Bに示されています。活性化マップは、 図2Bに示されており、各画素とpの起動時間を選択することによ...

ディスカッション

成功のFluo-5Nの色素負荷への鍵は、色素の大量を必要とせずに高いのFluo-5N濃度を可能にする小容量循環灌流セットアップ、ロード時間（1時間）の長さ、およびロードを実行していますRTで。ロードが生理的温度、細胞の酵素活性で実行された場合、色素が細胞質ゾルに染料分子を捕捉し、それらは、SR膜を通過することができない、細胞膜を横切るときに迅速-AMタグを切断します。 RTで、しかし、酵素活性を遅くし、-AMタグがSRに色素を捕捉する、切断される前に染料の十分な量は、細胞膜およびSR膜の両方を通過することができます。

であっても、最適な負荷条件で、しかし、このアプローチには、信号振幅および分別蛍光の変化（ΔF/ F）は、高親和性染料とV _m及び^細胞内Ca 2+の従来の光学的マッピングの場合よりも低くなります。例えば、LED励起光で構成され、ここで使用される光学装置、巨視的な目的、大きなフィルタおよびダイクロイックミラー（×5 cmで5センチ）、及びCMOSカメラで、分数の蛍光の変化（ΔF/ F）は、1のオーダーでありますRH237

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	チロード溶液の成分
CaCl2 (2H2O)	フィッシャーサイエンティフィ	C79-500	チロード溶液の成分
KCl	フィッシャーサイエンティフィック	S217-500	チロード溶液の成分
MgCl2 (6H2O)	フィッシャーサイエンティフィック	M33-500	チロード溶液の成分
NaH2PO4 (H2O)	フィッシャーサイエンティフィック	S369-500	チロード溶液の成分
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	チロード溶液の成分
D-グルコース	ッシャーサイエンティフィック	D16-1	チロード溶液の成分
95% O2 5% CO2	AirGas	カルボゲン	チロード溶液の酸素化と pH ブレ
ビスタチン	トクリス バイオサイエンス	1760	励起収縮アンカプラー
RH237	ビオチウム	61018	電位感受性色素
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	低親和性Ca2 + < / sup>インジケーター。代替:Invitrogen F-14204;ローディングは室温で実行する必要があります
プルロニックF127	オチウム	59004	Ca2+インジケーターローディング用;使用前に溶液が透明になるまで温めます
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	ブレビスタチンと染料を溶解するために
フィルター	EMD Millipore	NY1104700	11 μm インラインフィルター
圧力トランスデューサ	WPI	BLPR2	灌流圧力測定用
トランスブリッジトランスデューサーアンプ	WPI	SYS-TBM4M	圧力信号の変換/増幅用。PowerLabは、適切なBioAmp
PowerLab 26T	ADInstruments		圧力およびECG信号の連続記録用
THTマクロスコープ	SciMedia		マクロスコピック光学セットアップ。詳細: 0.63X 対物レンズ (NA = 0.31)、2X 凝縮対物レンズ、結果視野 = 3.1 cm x 3.1 cm、焦点深度 = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		光学マッピングカメラ
精密 LED スポットライト	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED 光源