本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。
この記事について
サマリー
要約
腫瘍の転移を支配する分子メカニズム解明のため、モデル動物としてマウスを使用してさまざまな試金が提案されています。ここでは、腫瘍細胞の浸潤や微小転移を評価する簡易測定法を示す.この分析では、腫瘍細胞を尾静脈投与と短い期間後肺解剖し、蓄積されたラベル付けされた腫瘍のセルの個数を消化します。このアッセイの血管に原発腫瘍の侵入の最初のステップをスキップして、遠隔臓器転移が発生するイベントの検討が容易になります。転移の限られた数を観察するための血管に注入された細胞の数を最適化できます。それは、遠隔の臓器の間質細胞が転移に貢献することが報告されています。したがって、このアッセイは、潜在的な治療薬や腫瘍転移予防のためのデバイスを探索する便利なツールかもしれない。
概要
腫瘍の転移は癌関連疾患の高い死亡率を占めています。分子レベルで調査の観点から転移が複数のステップに分けることができます: 原発腫瘍部位、腫瘍の成長と周囲の組織、intravasation、血管の循環に侵入で腫瘍開始、遠隔臓器や腫瘍の再増殖で血管外漏出。各ステップには、異なる分子/信号の1のセットが含まれます。
研究は、腫瘍細胞が転移前フェーズ2,3,4,5は別名、血の循環を開始する前に、遠く離れた臓器に発生するイベントに注目しました 6。マウス モデル研究では、転移前の相が肺のと低レベルの長期的な炎症性応答を作成することによって肺転移を促進を明らかにしました。転移前の相は themicrovasculature の血管、骨髄由来細胞 (腎不全) の採用、S100A8 と SAA33,4を含むサイトカイン/ケモカインのような分子の発現によって特徴付けられる.そのリジルオキシダーゼ変更黒谷
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プロトコル
マウスで実行されたすべてのプロシージャは、動物研究委員会の東京女子医科大学によって承認されました。
1. ルイス肺癌細胞 (LLC) の尾静脈注射
- 加湿 5%、10% の FCS を DMEM に LLC 細胞を維持 37 ° C で CO2インキュベーターセルは、蛍光タンパク質の発現システム (例えばGFP) を含める必要があります。
- 培養皿からセルを削除するには、非酵素細胞解離試薬を使用します。製造元のプロトコルに従ってください。
- 3 分ピペットで 5 mL の PBS で細胞を再懸濁します、遠心チューブ (400 × g、3 分) 15 mL チューブで 400 × g で遠心する細胞を収集します。その後、上清を削除します。
- この洗浄工程をあと 1 回繰り返します。
- 第 2 洗浄後セル ストレーナー (40 μ m 孔サイズ) をセルを通過し、1 x 106セル/mL の最終的な細胞密度を与えるため PBS で再懸濁します。
- 各 c57bl/6 マウス (8-10 週古い男性) 尾静脈を介して細胞懸濁液 (1 x 10 の5セル、29 G 針) の 0.1 mL を注入します。
2. ....
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結果
肺は、注入 (図 1 a) 後多くの GFP LLC 細胞 2 h を提示します。また赤のフィルターで検出された蛍光スポットがセル数から除外すべきことに留意。LLC 細胞の大半は肺 24 h から注入 (図 1) 後に消えます。
肺の GFP LLC の数を確認するには、フローサイトメトリーによる解析 (図 2) の葉の 1 つ使用できます。
図 1.......
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ディスカッション
マウス抗体、薬、高脂肪の食事療法または腫瘍細胞の注入前に腫瘍エアコン中の前処理が可能です。この試金で最も困難なステップは、尾静脈注射です。不完全な注入は決定的なデータを結果します。C57bl/6 の尾静脈は、失敗した注射の結果を識別し、特に困難です。役立ちます加熱パッド (37 ° C) にマウスを配置する尾静脈注入が容易になるようにを拡張させます。
この試金は、患者の血液よりもはるかに大きいである大型 (1 × 104 - 1 x 10 の5) の数の腫瘍細胞を使用します。細胞のような多数の 1 回注射は、ホスト動物から不要な応答をもたらすかもしれない。蛍光ステレオ顕微鏡カウント、腫瘍細胞の奥深くに組織が検出しにくいです。フロー フローサイトメトリー分析で肺、肺の腫瘍のセルの個数を完全に消化されます。このプロセスは、腫瘍細胞の場所 (血管の内外にかかわらず) に関する貴重な情報の損失を発生します。共焦点レーザー蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の検出により他人から血管内細胞の特徴的な腫瘍、それどころか、10
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コラゲナーゼ | Σ C6885 | ||
| ディスパーゼ | Gibco | 17105-041 | |
| ウシ血清アルブミン | Σ | A7030 | |
| DPBS | ギブコ | 14190-144 | カルシウムなし、マグネシウムなし |
| デオキシリボヌクレアーゼ I | シグマ | DN-25 | 微量 |
| RBC 溶解バッファー | シグマ | R7757 | |
| セルストレーナーBD | 352340 | 40マイクロメートルメッシュ | |
| 蛍光ラベリングキット | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μmのシリンジ フィルター | ザルトリウス | 17597K | |
| O.C.T. 混合物 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% パラホルムアルデヒドの隣酸塩緩衝液 | 和光 | 163-20145 |
参考文献
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438
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