髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

サマリー

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。

要約

最近のリプログラミングの進歩により、体細胞をヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に変えることができます。患者特異的なiPS細胞を用いた疾患モデリングにより、発症の根本的なメカニズムの研究が可能になり、治療の選択肢を改善するためのin vitro薬物スクリーニングや遺伝子治療の開発のためのプラットフォームも提供されます。近年、iPS細胞に関する論文が>7000件ほど増えていることからも、再生医療におけるhiPS細胞の有望な可能性が明らかです。皮膚線維芽細胞、造血細胞、表皮ケラチノサイトなど、異なる系統のさまざまな細胞タイプがhiPSCの生成に使用されています。皮膚生検と採血は、hiPSCを生成するための体細胞の供給源として多くの研究室で日常的に行われていますが、毛髪ケラチノサイトの収集とその後の誘導はあまり一般的ではありません。毛髪由来ケラチノサイトは、患者から細胞サンプルを採取するための非侵襲的なアプローチです。ここでは、抜毛した毛髪からケラチノサイトを誘導するための簡単な非侵襲的方法の概要を説明します。また、エピソームベクターを用いたインテグレーションフリーのhiPSCを作製するためのケラチノサイトのメンテナンスとその後のリプログラミングについても説明します。

概要

ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）の発見は、患者特異的幹細胞^1-3の生成のための実行可能な方法を提供し、再生医療の分野に革命をもたらしました。 hiPSCsは正常線維芽細胞^4,5を含む種々の体細胞タイプ、造血細胞^6,7、尿⁸およびケラチノサイト^9,10からの腎上皮細胞から生成されています。これまで、皮膚線維芽細胞および造血細胞は、患者固有のiPS細胞を生成するための最も一般的に使用される細胞の供給源を表します。おそらく、これは、皮膚生検及び採血ルーチン医療処置および多くの国で確立された患者の血液または皮膚サンプルの大規模なバイオバンクであるという事実によるものです。

侵襲的な抽出方法を必要とする血液細胞および皮膚線維芽細胞とは対照的に、ケラチノサイトはhiPSCの生成のために容易にアクセスできる細胞型を表します。 KeratinocytESは、皮膚の外側表皮バリアを形成し、また、爪及び髪¹¹に見出されるケラチン豊富な上皮細胞です。特に、ケラチノサイトは毛包、内毛根鞘（IRS）細胞^（12、 図1）と一緒に毛幹をカバーし、外部の細胞膜の外毛根鞘（ORS）に記載されています。ヘアコレクションは医療関係者の支援を必要としない簡単な手順であるように、患者が収集し、大幅hiPSCの世代のための患者サンプルの収集を容易にするであろう実験室に自分の毛髪サンプルを送信するための機会を提供しています。表皮角化細胞はまた、hiPSCの生成^9,13のための出発細胞としてのケラチノサイトを使用する利点に加えて、線維芽細胞と比較してより高い初期化の効率と高速再プログラミング速度を持っています。さらに、hiPSCsはまた毛包内の他の細胞集団を使用して生成することができ、毛包^14,15の基部に位置毛乳頭細胞を含みます。

毛由来の細胞を用いてiPS細胞の発生以前の報告は、多くの場合、レトロウイルスまたはレンチウイルスベースの再プログラミング法^9,14,15を利用します。しかし、これらのウイルスの方法は、再プログラミング中に外国の導入遺伝子の望ましくないゲノム組込みをご紹介します。対照的に、エピソームベクターの使用は、統合フリー性IPSC ^4を生成するために実行可能な、非ウイルス性の再プログラミング方法を示しています。我々は以前に効率的にエピソームベクター^13を使用してhiPSCsにケラチノサイトを再プログラムするための簡単な、費用対効果および非ウイルス法を開発しました。ここでは、hiPSCsを生成するためのケラチノサイトおよびその後の再プログラミングの撥髪、拡張やメンテナンスからケラチノサイトの導出を含むケラチノサイト由来hiPSCsの生成のための詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

個人からの人間の毛髪サンプルの収集は、ホスト機関における人間研究倫理委員会の倫理的な承認を必要とし、機関のガイドラインに準拠して行う必要があります。

撥弦楽器髪からケラチノサイトの1の単離

1. アイスO / Nで（ すなわち、マトリゲル）雪解け細胞外マトリックス（ECM）ソリューションを提供します。
2. 予備冷却したピペットチップを使用して、冷却されたDMEM / F12培地12 mlに200μlのECMソリューションを追加します。コー​​ト希ECM溶液1 mlの12ウェルプレートの各ウェルに。 37℃でコーティングしたプレートO / Nをインキュベートします。使用前に予め温めておいたDMEM / F12培地でコーティングされたプレートを洗浄します。
3. 髪の根元に近い指を置き、1迅速かつ滑らかな動きで髪を摘採して、個々の頭から一次ヒトの毛髪を収集します。各収集髪はそのまま毛包が含まれていることを確認し、毛アンの成長期を決定するためにチェック解剖顕微鏡（ 図1）を DER。
   1. ケラチノサイトを抽出するために、各個体から5-10成長期毛を収集します。プロセスは、ケラチノサイトの正常な誘導を確保するために、できるだけ早く毛を摘み取ら。
      注： 図1は、成長サイクルの異なる段階にある毛の形態を示しています。成長期毛をORSとして知られている髪の長さを、周囲の上皮の目に見える外側の層と、成長段階にあります。一方、休止期の毛は休止期にある毛を表し、可視ORSはありませんが、休止期の膨らみとして知られている毛の根元を覆う細胞の明確なボールを持っています。
4. 室温で5分間洗浄するために抗生物質ミックスの10ミリリットルを含むペトリ皿に毛髪サンプルを置きます。
5. 毛幹の1センチメートル - 滅菌ハサミとピンセットを使用して、無傷の毛包と約0.5とヘア断片を残し、過剰な毛をカット。
6. 慎重TRAピンセットを用いてECMコーティングされたプレートの各ウェルに1ヘア断片nsfer。
7. 毛髪試料に - （200μL〜100）を1mlピペットを用いて、ノックアウト血清代替（KSR）培地の約3滴を追加します。
   注：添付ファイルとそれに続くケラチノサイト成長を可能にするために、プレートの表面に密着して毛髪断片を保管してください。この段階で過度のメディアを追加すると、髪の断片を浮遊させ、成功した髪の添付ファイルの可能性を減少させることができます。
8. 5％CO ₂で37℃インキュベーターで毛髪サンプルをインキュベートし、毛包は、O / Nを添付することができます。湿った毛髪サンプルを維持するために - （200μL〜100）は、次の日に、静かにKSR媒体の他の3滴を追加します。
9. 毛包が正常に取り付けられていることを確認するために毎日の毛髪試料を観察します。一般的に毛包の付着は、1-3日以内に明らかです。細かい毛が高い持っているように太い毛は、通常、微細な毛に比べて取り付けが容易です添付ファイルのプロセスを妨害するフロートする傾向。
   1. 髪をコーティングしたプレートに取り付けられた後、ウェルにKSR培地500μlを添加します。毛髪サンプルがしっかりと取り付けられていない可能性がありますようにメディアを追加するときに細心の注意を払ってください。この点から、2日おきにメディアを変更します。
      注：ケラチノサイト増殖物は3-7日（ 図2A-B）後の毛髪断片のORS領域から見えるはずです。ケラチノサイトは、次のセクションで説明するように細胞を継代14日前までに成長することを可能にします。

2.メンテナンスとケラチノサイトの継代

1. プレコートコーティングマトリックスキットを使用して、6ウェルプレート。コー​​ティングのマトリックス溶液6.8μlを、続いて、キットの各ウェルに希釈媒体の680μlを添加します。プレート上にコーティングマトリックス溶液の均一な分布を確実にするためにプレートを振ります。
2. コー​​ティングされたプレートを室温で30分間インキュベートすることができます。削除しますケラチノサイトのメッキコーティング前Matrixソリューション。
3. 37℃で2〜5分間、ウェル当たり0.25％トリプシン500μlので単一細胞懸濁液にケラチノサイトを解離します。血清（ 例えば、ウシ胎児血清（FBS）培地）を含む培地500μlにトリプシンを不活性化し、滅菌15mlチューブに集めます。滅菌ピンセットを用いて毛の断片を削除します。
4. 血球計数器を用いて採取した細胞の数を決定します。
5. 遠心分離機200×gで3分間の細胞。 PBSを繰り返し、遠心分離で細胞を洗浄します。 PBSを吸引し、新鮮なケラチノサイト培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
6. ダウン4×10 ⁴ケラチノサイトケラチノサイト培地の存在下でECMコーティングされたプレートの1ウェルにプレート。 5％CO _2（ 図2C）を用いて37℃のインキュベーター内でケラチノサイトをしてください。文化があるときに、メディア毎日通路の細胞を変更〜80％コンフルエント、WHIchがケラチノサイトの通過数と増殖率に応じて約2-7日かかる場合があります。由来ケラチノサイトは、標準的なスロー凍結凍結保存方法^16を使用して十分な凍結ストックを生成するように拡張されるべきです。
   注：記載の培養条件は、典型的な敷石状の形態（ 図2C）と角化細胞の均一な集団の拡大をサポートしています。時折、いくつかの分化した大規模かつフラットな形態のケラチノサイト、および複製能力を失っているが、文化の中で観察することができます。以前^17に記載されているように、ケラチノサイトの特徴付けは、サイトケラチン14に対する抗体を用いて免疫染色することにより行うことができます。確立されたケラチノサイト細胞株はまた、市販のキットを使用して1~3継代後マイコプラズマについて試験されるべきです。

エピソームベクターを使用したケラチノサイトからhiPSCsの3世代

1. 6ウェルプレートでプレコート0.1％のゼラチン（2ミリリットル/ウェル）。室温で少なくとも20分間コートにゼラチンを許可します。
2. 再プログラミング実験のために、遅くとも通路6よりもケラチノサイトを使用しないで解離は、37℃で2〜5分間、ウェル当たり0.25％トリプシン1mlで単一細胞懸濁液にケラチノサイト。血清（ 例えば、FBS培地）を含む培地1mlのトリプシンを不活性化し、15mlチューブに集めます。
3. ケラチノサイト培地中で200×gで再懸濁した細胞で3分間遠心分離した細胞。板ゼラチン化プレートO / Nでウェル当たり1×10 ⁵ -1.5×10 ⁵ケラチノサイト。
4. 次の日（0日目）に、細胞が50〜60％コンフルエントであることを確認するためにプレートをチェックしてください。
   注：ケラチノサイトが、彼らはトランスフェクション後によく成長しない可能性があり〜50％コンフルエント未満である場合。
5. 0日目に、2μgの全プラスミドDNAに8μlのトランスフェクション試薬の比を用いて、ケラチノサイトのエピソームリプログラミングベクターのトランスフェクションを行います。
   1. 4プラスミド（pCXLE-EGFP、pCXLE-hOct3 / 4-shP53F、pCXLE-HSK、pCXLE-HUL）のそれぞれについて、0.5μgのを取り、低血清培地（ 例えば、OPTI-MEM）100μlに希釈します。
      注：プラスミドpCXLE-EGFPは、ケラチノサイトにおけるトランスフェクション効率をモニターするために使用され、成功した再プログラミングのために必要とされません。
   2. 希釈したDNAへのトランスフェクション試薬の8μlを添加します。チューブをフリックすることにより混合します。 DNA反応混合物は室温で15分間邪魔されずに休ませることができます。
   3. 新鮮な培地とケラチノサイト培地を交換してください。
   4. ゆっくりケラチノサイト培養物にDNA反応ミックスを添加し、4時間、5％CO _2、37℃のインキュベーター中でインキュベートします。
      注：それは彼らが低生存トランスフェクション後に示すように、ケラチノサイトに長期のトランスフェクションのO / Nを実行することは推奨されません。
   5. 4時間後、トランスフェクションした後、新鮮な培地でケラチノサイト培地を交換してください。
6. 1日目（1日後、トランスフェクション）、ケラチノサイト培地を変更し、蛍光顕微鏡下でのeGFP陽性細胞の割合を推定することにより、トランスフェクション効率を確認してください。典型的には> 60〜70％のトランスフェクション効率は、このプロトコルを使用して、初代ケラチノサイトで観察されます。
7. ステップ3.5で説明したように2日目に、トランスフェクションを繰り返します。二つの連続した​​トランスフェクションは、典型的には> 90％のトランスフェクション効率を達成します。ケラチノサイトの培養は、通常、第二のトランスフェクションの終了までにコンフルエンスに達しました。
   1. 各再プログラミング反応のために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダーの10cmの皿を準備します。以前に^18を説明したように、有糸分裂不活性化MEFフィーダーを準備します。
   2. 少なくとも20分間、0.1％ゼラチンを5 mlのプレコート10cmディッシュ。 FBS培地中で10cmディッシュあたりプレート4×10 ⁶有糸分裂的に不活性化MEF。細胞は、5％CO ₂で37℃のインキュベーターでO / Nを解決し、添付することができます。
8. 3日目に、HARステップ3.2および3.3に記載されているように、0.25％トリプシンでケラチノサイトを権利が確定します。 KSR培地中のケラチノサイトを再懸濁し、KSR培地で10センチメートルMEFフィーダー皿に6ウェルプレートの1ウェルからケラチノサイトの90％をプレート。
9. 以降4日目から、毎日KSR培地を変更します。
   1. あるいは、18日目の後に、一日おきに培地を交換してください。
      注： - 21ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の似ている定義された境界を有するhiPSCコロニーは14日目から出現する一方、非再プログラムケラチノサイトは、増殖しなくなります。
10. 以降21日目からの手動切開によりhiPSCコロニーを分離します。密接に一緒にクラスタ化されたhiPSCコロニーを避けるだけ明らかに他のものから分離されたhiPSCコロニーを選択します。
    注：hiPSCコロニーは早く取り出すことができますが、定義された境界を有するコロニーは、小さなコロニーサイズ指定された以前の時点では明らかではないかもしれません。再プログラミング効率はデフの間で異なる場合がありますerent患者の角化細胞、およびそのような継代数またはケラチノサイトの増殖速度などの他の要因によって影響されます。
    1. hiPSCコロニーのマニュアル解剖について、解剖顕微鏡下でhiPSCコロニーを切断するために26G針を使用しています。長さが600ミクロン - 約300小片にhiPSCコロニーをカットします。 hiPSCsのクローン株を確立するために、新しいMEFフィーダープレート（2.5×10 ⁴ MEF / cm ^2）を1にhiPSCコロニーから作品を転送します。最初に、文化は12ウェルプレートまたは器官培養皿の1つのウェル内の各hiPSCクローン株は、その後、6ウェルプレートフォーマットに展開します。
    2. MEFフィーダー上KSR培地中hiPSCsの確立クローン系を維持します。 hiPSCコロニーと80％の密集度、直径〜1.5ミリメートル、製造者の指示に従って、標準的な酵素継代方法（のAccutase、ディスパーゼまたはコラゲナーゼIV）を使用して、通路hiPSCs - 文化たら70に到達します。
11. 確立されたhiPSCラインを特徴づけますSは多能性と、in vitroおよび / ​​またはin vivo ^13,19 で三胚葉の細胞の代表に分化する能力を確認することができます。また、日常的にテストは、それらが病原体を含まないであることを確認するために、市販のキットを用いて、マイコプラズマのためのhiPSCラインを確立しました。日常核型分析またはアレイベースのコピー数変動（CNV）解析によりhiPSCラインのゲノムの安定性を監視します。

結果

成長期（成長期）、退行期（退行期）および休止期（休止期^）20,21：髪は成長サイクルの3つの異なる段階を通過します。成長期毛包上皮の複数の層を含んでいます。これらの層は、ORS、IRSと毛幹（ 図1）を含みます。成長期の毛は最終的ORSと毛幹分化の終了のアポトーシスによってマークされて退行期への移行受けます。最後に、アポトーシスが停止し、休止期の毛包が休止期特性^20,21の膨らみと静止なり休止期、退行期の毛に遷移。

図1は、休止期の毛および成長期毛の形態を示しています。当社は通常、ケラチノサイト誘導のため成長期毛を利用します。このプロトコルに続いて、ケラチノサイト増殖物は早くも3日間ヘアアタッチメント（ 図2A）の後に観察することができるとpしていきますroliferate（ 図2B）。我々の経験では、いくつかの成長期毛は、ケラチノサイト成長を観察するために添付したり、失敗に失敗することがあります。成功...

ディスカッション

患者特有のhiPSCsの生成は、in vitroでの病気の細胞型において病因を研究するためのユニークなアプローチを提供し、また、疾患の表現型を救出することができる新規分子を同定するための薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供します。 hiPSCsを使用して、この疾患のモデリングアプローチは、QT延長症候群、ハンチントン病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症²²を含む様々な疾患のための有望な結果をもたらしました。いくつかの取り組みはすでにアメリカ、ヨーロッパ、オーストラリア、中国、韓国と日本^23,24でコンソーシアムを含む患者固有hiPSCsの大規模なライブラリーを確立するために進行中です。

ここで、毛髪由来ケラチノサイトからhiPSCsを確立するためのプロトコルは、疾患特異的hiPSCsの大規模ライブラリーの構築を容易にし、高速追跡する可能性を有する、記載されています。このプロトコルは、2つの利点があります。まず、エピソームをこのプロトコルで利用されるシステムは、6つの再プログラミング因子のカクテルを使用し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗生物質ミックス:
250 ng/ml 抗真菌薬アムホテリシン B	Σ	A2942-20ml	抗生物質ミックスはPBSで構成されています。
1X ペニシリン/ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
ノックアウト血清補充 (KSR) 培地:			KSR培地は、使用前にStericup(Millipore、#SCGPU05RE)を使用してろ過されます。bFGFは、使用前に培地に新鮮に添加されます。
20% ノックアウト血清補充 (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 with glutamax	Invitrogen	10565-042
1×MEM非必須アミノ酸	Invitrogen	11140-050
0.5倍;ペニシリン/ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122
0.1 mM &β;-メルカプトエタノール	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, 新鮮添加)	Millipore	GF003
ケラチノサイト培地:
EpiLifeと60 &マイクロ;M カルシウム	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1回;ヒトケラチノサイト増殖サプリメント(HKGS)	Invitrogen	S-001-5
ウシ胎児血清(FBS)培地:			FBS培地は、Stericup(Millipore、#SCGPU05RE)を使用してろ過してから使用します。
10%ウシ胎児血清(FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x ペニシリン/ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122
2 mM L-グルタミン	Invitrogen	25030
0.25% トリプシン-EDTA	Invitrogen	25200-056
細胞外マトリックス (ECM):
マトリゲル	コーニング	354234	Aliquot Matrigel 在庫と-80°Cの保管。C次メーカーの指示。マトリゲルのストック濃度はバッチごとにわずかに異なります(~9mg/ml)。200µの使用をお勧めします。l 12ウェルプレートをコーティングするためのマトリゲル(~150µg/well).
コーティングマトリックスキット	Invitrogen	R-011-K
プラスミド:			pCXLE-eGFPはトランスフェクション効率のモニタリングにのみ使用され、リプログラミングには必要ないことに注意してください。
⇒        pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-         pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-         pCXLE-hSK	Addgene	27078
-         pCXLE-hUL	Addgene	27080
トランスフェクション試薬 Fugene HD	Promega	E231B
ゼラチン (豚の皮から)	Sigma	G1890	蒸留水で0.1%ゼラチンを作ります。使用前にオートクレーブを打つ
減少した血清培地:OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー			MEFは、前述したようにマイトマイシンC治療または照射により不活化することができる16。
26G ニードル	テルモ	NN2613R
6 ウェルプレート (組織培養処理)	BD Biosciences	353046
12 ウェルプレート (組織培養処理)	BD Biosciences	353043
10 cm ディッシュ (組織培養処理)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	10 mg/mL
で使用コラゲナーゼIV	Invitrogen	17104-019	mg/ml
で使用 TRA-160 抗体	ミリポア	MAB4360	5 μ で使用;g/ml
OCT4 抗体	Santa Cruz	SC-5279	5 & micro で使用。g/ml
NANOG抗体	R&Dシステム	AF1997	10 & マイクロで使用。g/ml
MycoAlert 検出キット	ロンザ	LT07-418