エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不透過性小分子の送達は、多くの生物学的またはバイオテクノロジー用途（細胞イメージング、機能的アッセイ、細胞の再プログラミングなど ^）1-4でしばしば望ましいです。多くの送達アプローチは、既にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはキャリア剤の使用を含め、報告されている（ 例えば 、例えば、TATのような細胞透過性ペプチド、脂質^）5-7。各技術は、典型的には、特定のアプリケーションのためではなく、他人のために、これらのアプローチが適切になるかもしれない特定の長所と短所を持っています。一般的な問題は、 例えば （全人口の貧しい配信の効率化および/ ​​または^8,9を配信されるどのくらいの材料の制御の欠如、毒性または有害な生理学的影響^10,11、時間的制御の欠如、少数の細胞での配信ではなく、を含みます。、マイクロインジェクション^）12、および複雑な化学的結合または製剤スキーム^11。

S = "jove_contentは">最近​​、我々はこれらの制限を回避する新たな配信戦略を開発しました。この戦略は、dfTAT（二量体蛍光^TAT）13という名前のペプチドに依存しています。 dfTATは周知の細胞透過性ペプチド（CPP）TATに由来します。 dfTATは、フルオロフォアのテトラメチルローダミンで標識TATの2つのジスルフィド結合したコ​​ピーが含まれています。その類似性にもかかわらず、TATおよびdfTAT活動に大きく異なります。 TATは、典型的には、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化されます。このCPPは、しかし、大部分（蛍光顕微鏡で検査したとき、これは通常、細胞内ペプチドの点状の分布につながる）、エンドソーム内に閉じ込められたままになります。 TATのように、dfTATを効率的に細胞によってエンドサイトーシスされます。しかし、dfTATはエンドソーム内に閉じ込められたままにしません。その代わりに、それは非常に効率的な方法でエンドソーム漏れを媒介します。 dfTATのエンドソーム溶解活性は、単純なインキュベーションアッセイにより高分子を提供するために活用することができます。

dfTATで達成高エンドソーム漏れ効率は、現在までに試験した細胞の多くと非常に無害です。エンドサイトーシス小器官は細胞の重要な構成要素であり、1つはdfTATによって媒介劇的な漏れが有害な細胞応答を伴うことであろうと予想されるので、これは驚きです。しかし、処理された細胞は、未処理の細胞と同じ速度で増殖し、そのトランスクリプトームの有意な変化は表示されません。また、配達は、細胞が失わずに許容されたり、配信プロセスから回復するかことを示し、再現性の配信効率で数分以内に繰り返すことができますエンドサイトーシスまたはエンドソーム漏れ能力。微妙な細胞応答はdfTAT配信およびこれらの応答が探求されないままであるかもしれないものの分子の詳細の間に行わ可能性があります。しかし、高効率、プロトコルの利便性、および毒性の欠如を組み合わせることで、この配信アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションですぐに有用であることを証明する必要があります。本明細書に提示プロトコルは研究団体にこの技術がアクセス可能にすることを目的としています。

1. SPPS：CK（TMR）TATG（fTAT）の合成

注：dfTATを形成するジスルフィド結合二量体化に続いて、固相ペプチド合成によってfTATモノマーの合成：dfTATは二段階で製造されます。

1. 1時間の標準的な50 mlのSPPS容器中にジメチルホルムアミド（DMF）中のRinkアミドMBHA樹脂500mgの膨潤。
2. 20％ピペリジン溶液（DMF中20％ピペリジンを10ml（0.30ミリモル）中のFmoc保護樹脂をインキュベートすることによってFmoc脱保護を行う。使用した洗浄工程で（1×5分間および1×15分）で2回脱保護工程を実行し反応の間にDMF（洗浄工程は、約150 mlのDMFの総容積で樹脂を複数回洗浄し、真空ろ過により溶媒を除去することを含みます）。
3. RinkアミドMBHA樹脂にCK（TMR）RKKRRQRRRG（fTAT）を合成。使用したFmocは、アミノ酸の保護以下：Fmoc-Lys（Mtt）-OHを（N末端のみに）、のFmoc-Lysのカルボニル（Boc）を-OH、のFmoc-Glyを-OH、のFmoc-Argの（はPbf）-OH、のFmoc- GLN（Trtの）-OH、およびFmoc-Cysを（Trtの）-OH。反応を攪拌するN _2（20 PSI）を使用して反応を行います。室温で全ての反応を実行します。
   1. 4時間、各アミノ酸カップリング反応を行います。各カップリングのため、のFmocアミノ酸（1.2ミリモル）、N、N、N '、N' -Tetramethyl- O-（1 H -benzotriazol -1-イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）（0.44グラム、1.1ミリモル保護使いますDMFに溶解）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（0.51ミリリットル、3.0ミリモル）。 4時間のカップリングに続いて、ステップ1.2で説明したようにDMFで樹脂を洗浄し、Fmoc脱保護ステップを実行します。
   2. 合成した：fTATの直鎖状ペプチド鎖（CKRKKRRQRRRGなしTMRリニアペプチド鎖が）まで繰り返します。
   3. そして、徹底的に最初にDMFを使用して、ジクロロメタン（DCM）であることを以下の樹脂を洗浄。 DMFまたはDCMの約150ミリリットルの全容量で樹脂を複数回すすぎ、真空濾過により溶媒を除去します。
   4. USE MALDI-TOFは、得られたペプチドは、適切な分子量を有することを確認しました。
      1. 水溶液とアセトニトリル50μlの0.01％TFAを50μlからなる溶液にマトリックス1mgを追加することにより、マトリックスミックスを行います。
      2. 直鎖状ペプチド鎖の質量、使用αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を確認します。粗ペプチドの分析HPLCを実行し、純粋なピークの頂点から50μLを集めます。
      3. MALDIプレート上にプレートに試料を調製するために：乾燥または37℃の熱板上を空気にMALDIプレート上にマトリックス溶液と場所の2μlにペプチドの8μLを追加します。
         注：アルギニンは、SPPS中のカップルに困難なアミノ酸であることが知られています。成功したカップリングはKaiser試験^14（例えば、ニンヒドリンテスト）を実行することによって確立されます。このテストでは、樹脂上にカップリングしていないままになることがあり遊離アミンの検出を可能にします。場合に青色が（遊離アミンの存在を示す）を検出し、結合のTEPSを繰り返します。
4. CKのために（-NH-TMR）TATG（fTAT）、1％トリフルオロ酢酸（TFA）、2％トリイソプロピルシランからなる溶液でCKでのLysのアミノ基で（-NH-MTT）をTATGのMtt保護基を開裂DCM（TIS）。
   1. MTT保護基の除去には、黄色の色が観察されなくなるまでこれを繰り返して、5分間、上記溶液20mlで樹脂をインキュベートし、イエロー色の外観をもたらすように。間に、DCM、DMFで樹脂を洗浄します。 TISは、MTTを清掃うスカベンジャーであることからさらに、一度何の黄色はMTTの存在下で、溶液中で表示されません。
   2. これ以上MTTが削除され、溶液は透明のままであることを保証するための樹脂に、DCM中の1％TFA（無TIS）と追加の溶液を加えます。
5. DMF中のカルボキシ（TMR）、HBTU、およびDIEA（（）MG中の樹脂の量に対して4、3.9および10等価）、この混合物を追加します。3成分を溶解樹脂に、反応を実施O / Nで攪拌を提供するために、乾燥N _{2を用いました} 。
6. Fmocの脱保護およびアミノ酸結合後、DCMで樹脂を洗浄し、乾燥させます。樹脂からのペプチドの完全な切断のために、3のためのペプチジル樹脂を92.5％TFA、2.5％H _{2 O、2.5％TIS、2.5％}のエタンジチオール（EDT）（総容積= 4 ml）を含有する溶液を加え樹脂からグローバルな脱保護および切断を達成するために、室温で時間。
   1. Et 2 O 40ミリリットルにステップ1.6からの溶液を排出することによって冷たい無水エチルエーテル_（Et 2 Oで）を使用して、粗ペプチド産物を沈殿させ、4℃でスピンダウンし、20 4,000 XG - 25分。冷たい無水_Et 2 Oで沈殿物を洗浄できるようにするには、この手順を繰り返し
   2. 水（5 mlまたは沈殿物が完全に溶解するまで）、および凍結乾燥の沈殿物を再懸濁します。その後、0.1％TFA水溶液/アセトニトリル中で得られた生成物を再懸濁します。
<李は>各ペプチドを分析するための分析C18カラム（5ミクロン、4×150ミリメートル）でHPLC分析を行います。 1ml /分、および214nmで検出し、550nmでの流量を使用します。
7. ペプチド精製のためのC18 10×250mmカラム上の分取用HPLCを実行します。 214 nmおよび550 nmでのフロー4ミリリットル/分の速度、および検出を使用してください。すべての実行については、0.1％TFA水溶液（溶媒A）、90％アセトニトリル、9.9％の水、0.1％TFA（溶媒B）の直線勾配を使用しています。
8. fTAT、予想質量：2,041.17、観察された質量：2040.66、製造業者のプロトコルに従って、MALDI-TOFによりペプチドの正確な身元を確認してください。 DEAC-K9、予想質量：1,415.59：1,412.97は、質量を観察しました。 MALDI-TOF用のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用してください。

2.酸化反応：dfTATジェネレーション

1. 1時間（以下の反応のための少なくとも5 ml）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に通気。
2. AERにfTAT（0.3ミリグラム、1.5×10 ^-4モル）を溶解PBSのpHを7.4（5 ml）をated。ペプチドを添加した後、7.5 - pHが7.0の間にあることを確認してください。バック7.4までのpHを - （5μlの1 M、少しずつ1）水酸化ナトリウムを追加しない場合。
3. 注：PBSに溶解した酸素はfTAT上のチオール基を酸化し、ジスルフィド結合を形成するように作用します。
4. それが完了（HPLC分析に基づいて、100％の収率）まで反応することを可能にする反応章動O / N。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、ステップ1.9のように質量分析法（MALDI-TOF）によって分析します。期待質量：4,084.21：4,080.34は、質量を観察しました。
5. 凍結乾燥純粋dfTAT（0.71×10 ^-4 mmol）および200μlの水に再懸濁し（濃度純粋dfTAT = 356.3μM）。

3. dfTAT濃度を測定

1. 50 mMのTCEP溶液を149μlの精製したdfTAT（精製されたペプチドの量に応じて、通常は1マイクロリットル）のアリコートを再懸濁します。
2. 注：このステップではdfTATは、そのMOに還元されます原因dfTATでTMRの蛍光団（dfTATにおけるTMRの吸光係数εが減少fTATにおけるTMRのεと比較して減少している）の近接に発生した吸光度消光を排除するnomer対応fTAT。
3. （分析HPLCはfTATの形成を確認するために使用することができる）、サンプルを約20分間反応させます。
4. 石英キュベットにすべてのソリューションを追加し、556 nmの吸光度を測定します。
5. ベールの法則を用いて（A =εcl：ε= 91500 ^M -1 ^cm -1で^）は 、fTATの濃度を計算dfTATの濃度を決定し、2で[fTAT]分割します。

4.細胞配信実験

1. 90％（例えば、8ウェルまたは24ウェルディッシュ） - 80の密集度でシャーレ内の細胞（HeLa細胞、HDF など ）をシード。 37℃で90％の密集度-適切な培地中で細胞を増殖させる80まで（例えば、DMEM、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）5％のCO _2を含む加湿雰囲気。
2. （200μlのPBSを追加し、それを3回除去することによって）、PBSで細胞を3回（3回）洗浄します。
3. （8のためによく全量を200μlのでなければならない一品）NRL-15培地中で（水中）dfTATの株式を希釈することによりdfTATの作業濃度5μMを行います。 5μMdfTATの濃度は、現在までに試験されたほとんどの細胞型で効率的な配信（皿の中に存在する細胞の90％以上で細胞質ゾルデリバリーのハイレベル）（ 図3）につながります。しかし、より低いまたはより高い濃度の浸透に高いまたは低い傾向を持つ細胞タイプのためのより適切な場合があります。
   メディアに関する注：それはdfTAT中のジスルフィド結合を減らすことができるシステインを含んでいないため、NRL-15はdfTATの送達のために使用されます。しかし、我々のデータは、通常のL-15（システイン）及びDMEM両方が送達媒体として使用することができることを示しています。 L-15は、還元アミノ酸システインが、システインpresumabが含まLYは（DMEMがシスチンを用いて製剤化された）、シスチンを形成するために、培地中で酸化します。 dfTATしたがって、これらの媒体内にそのまま残り、配信はnrL15で得られたものと同じ効率で動作します。
4. 伴うまたは積荷なしdfTAT（5μM）（ 例えば 、EGFP（10μM））で細胞をインキュベートし、（インキュベーション時間を低減することができるが、dfTATは、典型的には、エンドソームの漏出を誘導するために、約30〜45分を必要とし、1時間37℃で維持）。
5. 細胞の細胞膜に結合したdfTATを削除する（3回の洗浄が推奨されている）L-15中のヘパリン（1 mg / ml）で細胞を洗浄。
6. に従ってのSytoxブルー、。 例えば、細胞不透過性の核染色で細胞をインキュベートし、のSytoxグリーン（NRL-15で2μM）、細胞の細胞膜が損なわれているかどうかを判断する（生細胞ではないだろうが、死細胞を染色されます）製造業者のプロトコル。
7. 蛍光顕微鏡（100倍の油浸または20X対物レンズ）を用いて、画像セル。 RFPフィルタを用いた画像dfTAT（例=560±20 nmで/エム= 630±35 nm）で。
   注：正常配信は（目的のタンパク質またはペプチドの送達を評価する用途に依存する）は、細胞全体dfTAT蛍光の拡散につながります。 fTAT（サイトゾルエントリ時dfTATの還元生成物）による核小体の染色が検出された蛍光が細胞内であることを指標として用いることができます。 fTATは数時間以内に低下します。この時点で、分解フラグメントの蛍光は点状として表示されます。これはdfTATが失敗した（dfTATは濃度が低すぎるで存在する場合、この現象が発生することができます）、エンドソーム内に閉じ込められたまま場合にも見られている点状分布のために混同してはなりません。

配信MOIの5 Controling濃度

1. 使用した細胞型におけるdfTATの効率的な細胞質の放出を達成するために必要な「最適な配信」の濃度を特定します。 increasinとインキュベートした細胞に蛍光顕微鏡を実行しますdfTAT gの濃度。最適dfTAT濃度はサイトゾル消去につながる最小濃度として定義されている培養物中の細胞の約100％にTMR蛍光を「拡散します」。
2. （dfTATの最適な送達濃度を用いて、例えば ）dfTAT一定の濃度を維持しながら、MOIの濃度は、共インキュベーションプロトコルで使用される変化します。 1時間未満にインキュベーション時間を変更すると、MOIは、配信の量を変化させるためのオプションであってもよいです。

fTAT dfTATとの間の差を評価するために、HeLa細胞は、その細胞内局在の違いを決定するために、それぞれのペプチドで1時間インキュベートします。 2 CPPのの内在化は、蛍光顕微鏡を用いて評価した。 図2は fTAT（20μM）は点状の分布に局在することを示しています。この分布は、エンドソームの内部に閉じ込められたままのペプチドと一致しています。これとは対照的に、dfTAT（5μM）の蛍光シグナルは、細胞質ゾルおよび核全体に均一な分布が表示されます。 図3 dfTATの細胞質ゾル分布がCOLO 316、NIH 3T3、HaCaT細胞、を含む種々の細胞株の数で観察されていることを示していますニューロ-2A、MCH58、一次細胞ラインHDF、DRG-F11とNCL-H1299をトランスフェクトすることが難しいです。 20X画像なし細胞毒性を持つdfTATの細胞質ゾル分布（なしのSytox青核stainin皿の表示でその割合が非常に高い（> 80％）を示していますG）。

dfTAT媒介エンドソーム漏れが細胞の細胞質ゾルに大きなタンパク質を提供するかどうかを判断するには。 EGFP（26キロダルトン）をモデルタンパク質として選択されます。その蛍光は、（正確に折り畳まれている場合）、緑色蛍光の局在を観察することにより、細胞内への送達を検出するために使用することができるからです。 図4に示すように、このアッセイを行うために、EGFP及びdTATは、細胞と1時間インキュベートし、EGFPは、観察可能な毒性なしに細胞の90％以上でdfTATについて観察されるものと同様の細胞質ゾルおよび核の緑色蛍光の分布を示しました。

dfTAT媒介分子送達の原理を示す図1の回路図 。左から右へ。回路図は、細胞不透過性の貨物と一緒にdfTAT細胞送達を示しています。まずdfTATはuptakになり、エンドサイトーシスを誘発エンドサイトーシス小胞への貨物と一緒にdfTATの電子。第二段階ではdfTATはdfTATの放出および細胞の細胞質ゾルへの細胞不透過性分子をもたらすエンドサイトーシス小胞から脱出。哺乳動物細胞の細胞質ゾルは、したがって、細胞質ゾルdfTATでのモノマーの対応fTATに還元され、還元環境である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

20μMのfTAT（左パネル）および5μMdfTAT（右パネル）100Xの目的を使って。fTATのモノクロ画像はdfTATイメージが細胞を示している蛍光斑点状の分布を示す細胞を示しているとインキュベート両方HeLa細胞の図2.蛍光と明視野画像均質な細胞質ゾルおよび核fluorescencを表示電子分布。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ライブ細胞へdfTAT図3.効率的な配信には、複数の細胞株で達成されました 。 HeLa細胞、NIH 3T3、COLO 316及びHaCaT細胞、神経-2A、MCH58、HDF、DRG-F11とNCL- H1299：試験した細胞株は、以下の通りでした。細胞は、プロトコルおよび撮像さに応じて洗浄工程、続いて1時間、5μMdfTATと共にインキュベートしました。検出された蛍光シグナルは、細胞質ゾルおよび細胞の核（：20Xの目的、底部パネル：100Xの目的上のパネル）でした。細胞不透過性の核染色SYTOXブルーdfTAT処理後の細胞生存率を評価しました。スケールバー、20Xの目的：50ミクロン。 100Xの目的：10μmです。jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4. dfTATは、異なる細胞株に無傷EGFPを提供します。（A）HeLa細胞（上のパネル）およびNIH 3T3（下のパネル）細胞を1時間EGFP（10μM）とdfTAT（5μM）とインキュベートし、以下のステップを実施しましたプロトコルに従って。画像は、両方の細胞株におけるEGFPの均質な細胞質の蛍光分布を示します。スケールバーは10μm。（B）HeLa細胞および初代HDF細胞は、EGFP（10μM）とdfTAT（5μM）と共にインキュベートしたプロトコルに従って。 20X画像はHeLa細胞および初代HDF細胞におけるEGFPとdfTATの均質な細胞質の蛍光分布を示します。オーバーレイ（疑似カラー：白）（疑似カラー：紫）dfTATの存在を示し、EGFP（pseudocolまたは：両方のHeLa細胞およびHDF細胞の細胞質ゾル空間で緑）。 （青色で表示）のSytoxブルーは、細胞生存のためにロバに使用されました。スケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。