新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

サマリー

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。

要約

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）14％の生涯有病率を持っており、50歳未満の男性のための最も一般的な泌尿器科診断である、まだそれは少なくとも、慢性骨盤痛障害を理解し、研究しています。著しく視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の機能および調節に影響を与える可能性が初期生活ストレスや虐待を経験した慢性骨盤痛の報告、患者のかなりの部分集合。両方の尿中で増加することが示されており、CP / CPPS患者の前立腺分泌物を発現しているマスト細胞の活性化は、部分的にHPA軸の下流の活性化によって調節されます。新生児母性分離（NMS）は、HPA軸と内臓感度の変更を含む、齧歯類モデルで初期生活ストレスの成果を研究するために20年以上前から使用されてきました。ここでは、雄のC57BL / 6マウスにおいて、CP / CPPSの前臨床モデルとしてNMSを使用するための詳細なプロトコルを提供します。我々は、方法論を記述しますNMSを行うため、perigenital機械的異痛症、及び肥満細胞の活性化の組織学的証拠を評価します。また、初期の心理的ストレスがマウスにおいて男性の泌尿生殖器系の長期的な効果を持つことができるという証拠を提供します。

概要

慢性骨盤痛自体は病気ではなく、過敏性腸症候群（IBS）と診断された患者が経験した継続的な自発的および/または誘発痛、間​​質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / PBS）、外陰部痛に関連した用語、または慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）。これらの症候群は、機能不全が、免疫系、中枢神経系および末梢神経内のシステムは、これらの疾患¹の維持および進行に寄与することが示されているが、彼 ​​らは、いかなる関連する病状または同定根底にある病因を持っていない多くの場合、合併され、その中に多くの特徴を共有します^-3。慢性骨盤痛を有する患者は、視床の変更された機能に関連付けられている不安、うつ病、パニック障害^4-6を含む追加の非骨盤に関連する機能性疼痛障害および気分障害の症状で存在する可能性が高いです下垂体副腎（HPA）軸^7-10。初期生活ストレスやトラウマへの暴露がHPAの異常と関連する慢性疼痛症候群^10,11と、などを開発するための重要な危険因子であり、機能性骨盤痛障害を有する患者のかなりの部分集合は、虐待やネグレクトなどの有害幼年期の事象を経験したと報告します^12-14。

離乳前の期間に設定された時間のために彼らのダムから子犬を除去することを含む、新生児母体の分離（NMS）のげっ歯類モデルは、初期の生活上のストレスの成果を研究するために過去20年間のために使用されています。一般に、NMSは、直接視床下部内での遺伝子発現に影響を与えるだけでなく、辺縁構造^15-18から下流調節を破壊することによって、HPA軸の活性化、及び得られた不安様行動を増加させることが示されています。適切なHPA軸機能の破壊が増加大腸^19-22に寄与することが示されていますと膣¹⁶の感度は、げっ歯類NMSモデルによって表示されますが、出生後の膀胱炎^23-25 ​​の長期的な効果の大規模な特性評価にもかかわらず、早期の生活上のストレスの影響は、主に尿生殖器官で自然と口から出た行ってきました。そのため、以下の研究は、マウスにおけるNMSを実行し、それ以降のCP / CPPSのための前臨床モデルとしての雄NMSマウスの使用を検証するために、前立腺にperigenital機械的感度および肥満細胞の浸潤/活性化を評価する方法について説明します。

診断慢性骨盤疼痛性障害のすべての、CP / CPPSは、おそらく最もよく認識し、シンドロームを特徴とする、約^14〜26％の生涯有病率を有し、4400ドルで推定年間患者のコストにもかかわらず、（その倍腰痛やリウマチの関節炎^27）。 CP / CPPS報告会陰部の痛み、直腸、前立腺、陰茎、睾丸、および/ ​​または腹部²⁸の患者は、ハイテクを体験しますgher対照患者よりも心理的ストレス度^29、およびまたは症状と共通して存在が併存する慢性骨盤痛や気分障害^5,29-31と診断されています。再発感染、漏れやすい上皮、神経性炎症、および自己免疫は、すべての潜在的な基礎となるCP / CPPS ^2,32,33の原因だけでなく、肥満細胞の活性化および脱顆粒³⁴として推測されてきました。 CP / CPPS有する男性から発現前立腺分泌物は、マスト細胞トリプターゼおよび神経成長因子（NGF）のレベル^34が増加した、後の研究では（CPA3）のトリプターゼおよびカルボキシペプチダーゼことが確認され、マスト細胞活性化のマーカーもで増加しましたCP / CPPS患者³⁵の尿。 CP / CPPSの発症と維持に肥満細胞の潜在的な役割は、これまでにこの症候群の動物研究の主要な焦点となっています。 CP / CPPSを研究するために使用される最も一般的に用いられる齧歯類モデルは、実験的自己免疫性前立腺炎（EAP）モデルGENです^34,36-39使用される種および株に依存前立腺の炎症の多様度になり、完全フロイントアジュバント、前立腺抗原の皮下注射によってerated。マスト細胞の浸潤および活性化/脱顆粒は、EAP ^34,35,40の次の誘導を増加させることが示されています。マスト細胞³⁴またはトリプターゼ受容体PAR2 ³⁵のいずれかを欠損したトランスジェニックマウスは、野生型EAPマウスとは異なり、EAP次の前立腺戦術感度を開発することはありません。この前臨床モデルがヒトのCP / CPPSの特徴の多くを複製しながら、誘導プロトコールは、多様な病因を持っており、多くの場合、直接炎症、感染、または前立腺の傷害を伴わない人間の状態、を示すものではありません。

ヒトでのCP / CPPSの開発に初期の生活上のストレスの影響は、主に未調査行ってきました。しかし、胡ら ⁴¹による研究では、私のことを実証しましたN人は、物理的、感情的、および/または性的虐待の子供時代の歴史は、CP / CPPSを示唆する症状を経験する可能性が有意に高かったと報告しました。さらに、彼らは痛みや尿のスコアの両方が物理的および精神的虐待の既往歴のある患者において増加していることが示されました。我々は以前の雌C57BL / 6マウスは、膣および機能不全HPA軸出力¹⁶の両方を示唆する膀胱内、膣過敏症および異常な遺伝子発現を生成するのと同じNMSパラダイムことを実証しました。より明確に初期生活ストレス暴露^12-14と関連していることが示されているIC / PBSおよび気分障害を含む他の併存疾患^42、と提示CP / CPPS患者の有病率が高いと組み合わせてこの証拠は、使用するための理論的根拠を提供しますNMSモデルは、マウスにおけるCP / CPPSを調査します。

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての実験は、カンザスメディカルセンター制度動物実験委員会の大学で指定されたガイドラインに従ってNIHガイドラインに準拠しています。

1.新生児母子分離（NMS）

1. ごみの出生のために毎日妊娠ダムを監視します。
   注：ゴミが生まれた日はP0と考えられています。
2. P1には、ホームケージからダムを削除し、クリーンな二次容器内に配置します。
3. ホームケージの香りを維持するために、クリーン手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。
4. きれいな、適切に標識された2リットルのガラス製ビーカーにホームケージ寝具2cmの1 - 1の深さを追加します。ガラスビーカーに、ホームケージ内に存在する任意の追加の濃縮寝具材料、 例えば、nestlet、クリンクル紙の約半分を追加します。
5. 静か同じビーカーに、個別に、単一のごみから仔のすべてを配置します。
6. すぐに場所インキュベーター中でビーカーを180分間、33 ^{O C}および50％の湿度で開催されました。
7. 第2の容器からダムを外し、ホームケージに彼女を返します。ビバリウム内での適切な住宅の場所にホームケージを返します。
8. 各リットル/ダムのために清潔な手袋と二コンテナを使用して、NMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。
9. 180分の分離時間の終わりに、それらを除去したのと同じ順序でそれらのホームケージにリターを返します。
10. 以前の日に分離した最初のごみのホームケージを取得します。ホームケージからダムを取り外し、きれいな二次容器内に配置します。
11. インキュベーターから第1のビーカーを削除し、子犬の処理中にホームケージの香りを維持するために、きれいな手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。
12. 静かにビーカーからホームケージに、個別に、子犬を移動します。
13. のビーカーに残っている濃縮および寝具を返しますホームケージ。
14. ホームケージに第2の容器からダムを返し、ビバリウム内の適切な住宅の場所に戻してください。
15. 水でビーカーをすすぎ、インキュベーターに戻します。分離手順を通して各ごみに同じビーカーを使用してください。
16. 彼らはインキュベーターに入れたのと同じ順序でNMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。
17. 各リター受けるNMS P21を介して、毎日のために、この手順全体を繰り返します。
18. 食料と水との完全なクリーンケージに一緒に同性の同腹仔を配置することによって、P22のNMSとナイーブ子犬を離乳させます。ナイーブ仔が生まれ、収容されたNMSマウスと同様の条件ではなく、通常の畜産タスクの外で追加の取り扱いを受けるべきではありません。

2. Perigenital機械的感受性

1. フォン·フレイ装置のセットアップ
   1. 試験室にマウスを持参し、それらを30順応することができます分は、ホームケージのまま。
   2. 研究者は、マウス、高さ約55センチ驚くべきことなく、下側から接近できるようにするために十分なスペースを提供して上昇したワイヤーメッシュトップ·テーブル（79​​センチメートル×28センチ）の下に、吸収性アンダーパッドを配置することにより、テスト領域を準備します。
   3. ワイヤーメッシュテーブルの上に透明な、穿孔プラスチックチャンバー（12センチ×5センチメートル×3.5 cm）の下で、個別に、12匹まで入れます。逃げるのマウスを防止するために、チャンバーの上に重い物を配置します。
   4. 離脱閾値の評価に先立って、画面上でさらに30分間、マウスを順応させます。
2. Perigenital機械的感受性評価
   1. 傾斜のvon Freyモノフィラメント⁴³の標準セットを使用して、アップダウンの方法を実行します。 1.65グラム、2.36グラム、2.83グラム、3.22グラム、3.61グラム、4.08グラム、4.31グラム、および4.74グラム以下のモノフィラメントを使用します。
      1. 3.22グラムモノフィラメントのベースを持ち、後退モノを公開フィラメント。
         注：一部のモデルでは、退避モノフィラメントがない場合があります。
      2. モノフィラメントが垂直に配向されるようにプローブを置くとマウスは、警告不動であり、その体重は後足の間で均等に分散されたときに、わずかになるまで、正中線を避け、陰嚢の左側または右側のいずれかに適用します曲げフィラメントで観察されます。
      3. 10秒間、または動物が陽性反応を示すまで、所​​定の位置にモノフィラメントを保持します。
         注：正の応答がモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはモノフィラメントに向け痛烈な行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプであると考えられています。これらの動作を表示せずに10秒モノフィラメントアプリケーションの間マウスが移動した場合、モノフィラメントは、最小1分、長い休止期間後の再テストする必要があります。マウスはどちらも移動でも10秒モノフィラメント中に記載されているアプリケーションの挙動上記のいずれかを示す場合には、否定応答とみなされます。
      4. 実験ノートまたはラップトップに、正または負のいずれか、応答を記録し、3.22グラムのモノフィラメントを用いて、残りのマウスのすべてでこの手順を繰り返します。
      5. 再び次の適切なモノフィラメントを用いて、全てのマウスをテストします。注：マウスは3.22グラムモノフィラメントに負の応答を示した場合は、同様にして3.61グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。マウスは3.22グラムモノフィラメントに陽性反応を示した場合は、2.83グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。
   2. 最初の陽性反応が観察された後、さらに4アプリケーションのために、必要に応じて、次に大きいか小さいモノフィラメントを用いて、各マウスのテストを続行。
   3. ホームケージにマウスを返します。
   4. Chaplan ら ⁴³に記載されているように、50％のG引っ込め閾値を計算するためにログ単位で裁判シリーズに適用され、最終のvon Freyモノフィラメントの値を使用してください。

タイトル "> 3。酸性化トルイジンブルーマスト細胞染色

1. 組織処理
   1. 心臓内の氷冷4％パラホルムアルデヒド⁴⁵で灌流されたマウスからの前立腺組織^44を解剖。 PostfixのRTで1時間、4％パラホルムアルデヒド中で組織した後、4°CO / Nに1×PBS中30％スクロース中cryoprotect。
   2. ヘプタンの小さい（30ミリリットル）バスを準備し、ドライアイス上に置きます。
   3. 1×PBS中の前立腺組織をすすぎ、軽量ワイプ使用して乾燥させます。
   4. それが凍結されるまで冷ヘプタンに前立腺組織を挿入します。
   5. 凍結まで直ちにドライアイス上に取り付けるメディアと場所を含むcryomoldで凍結前立腺組織を配置します。
   6. ストアを-20℃でcryomolds。
   7. 横クライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さの凍結切片に前立腺組織を切断します。
   8. 正に帯電した顕微鏡スライド上に、組織の長さに及ぶ12の非連続凍結切片 - 8を配置します。
   9. ストアは、さらなる処理まで-20℃でスライドを終えました。
2. 酸性化トルイジンブルーの準備
   1. 1％ストック溶液を調製し、溶液中まで100ミリリットルの70％エタノールと渦にトルイジンブルーO 1gを加えます。ストック溶液は、最大3週間室温で保存することができます。
   2. 撹拌プレートの上に置いたビーカーに100mlの水に1グラムのNaClを加えます。
   3. 1.0が達成される - 0.5のpH範囲をするまで12 M HClを用いてNaCl溶液のpHを調整します。
   4. トルイジンブルーストック溶液8mlの1％NaCl溶液32 mlで組み合わせることによって、0.25％トルイジンブルー使用液を調製します。トルイジンブルーストック溶液の総取り込みを確保し、ボルテックスを用いて混合するために上下にピペット。作業溶液は、新たに作製し、使用後に廃棄しなければなりません。
3. 前立腺凍結切片を染色
   1. 冷凍庫から処理対象のスライドを削除し、約30メートルを室温に平衡化することを可能にしますです。
   2. 個々のスライドに取り付けられた組織切片を完全に水没されることを保証するために、1×PBSの十分な量を含む50 mLのコニカルチューブに約1秒間スライドを浸漬することにより組織切片を洗浄します。スライドをペーパータオル上で空気乾燥することができます。
   3. 15 rpmで設定プラットフォームロッカー上ながら15分 - スライドに取り付けられた組織切片が完全に水没されていることを確認し、10インキュベートするのに十分な0.25％の作業トルイジンブルー溶液を含むガラス染色ジャーに入れスライド。
   4. ディップは、過剰なトルイジンブルーを洗い流すために、約1秒間、1×PBS中でスライドします。
   5. スライドは、排水を可能にするために彼らの側にあるような方法でスライドボックスやラックにスライドを置きます。
   6. 2時間または室温でO / Nの最低37℃のオーブンでスライドを乾燥させます。
   7. スライドはアルコール露光間の完全に乾燥させ、アルコールを使用して、迅速にスライドを脱水。ペーパータオルAに排出することによってドライスライドND軽量で拭い背中とエッジが拭いてください。
      1. 約1秒間95％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織が紫より青乾くまで10回 - この手順1を繰り返します。
      2. 約1秒間100％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織は、中青に濃いが、紫色でなくなるまで10回 - この手順1を繰り返します。
   8. 3分間、100％キシレン中でスライドをインキュベートすることによって汚れを修正しました。乾燥することができます。
   9. グリセロール、PBS、またはキシレン系永久マウント培地でスライドをカバースリップ。 RTで余分なメディアや店舗を排出します。
4. マスト細胞の定量化
   1. 光学顕微鏡（ 図2）を用いて20X倍率でトルイジンブルー染色した組織切片を視覚化。
   2. 可視化領域内に存在するマスト細胞の合計数をカウントし、非脱顆粒および脱顆粒マスト細胞を区別。 40Xのマニフィカイオンはいくつかのマスト細胞における造粒状態を確認する必要があるかもしれません。
      注：非脱顆粒肥満細胞は、核の輪郭および/または細胞の周囲の無顆粒押出ないか、かすかに密な異染性を示します。脱顆粒肥満細胞は、あまり強く異染性を示し、細胞質内およびセル境界の外核および/または遊離顆粒の明らかな明確な輪郭を持っています。
   3. 現在の組織切片の全体が非脱顆粒および脱顆粒肥満細胞の総数を評価し続けています。長さを各組織にまたがる、少なくとも7追加の別のセクションでこの手順を繰り返します。
   4. 以下の式に従って各組織/マウスの合計肥満細胞の脱顆粒（DG）の割合を計算し（DGマスト細胞/総肥満細胞）×100。

結果

NMSを受けたマウスは、CP / CPPSを示す行動の証拠を示しました。フォン·フレイモノフィラメント、8週齢のマウスNMS一連の段階的に試験した場合（N = 4）ナイーブ対応物と比較した場合、perigenital機械的異痛を表示（N = 5、 図2）。モノフィラメントに向けモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはかむ行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプとして記録、正の行動反応を誘発し、機械的引っ込め閾値で、これは有意な減少（スチューデントのt検定P <0.01）のように証明されます。

NMSに曝露されたマウスはまた、CP / CPPSの組織学的証拠を示しました。前立腺組織のクリオスタット切片を、肥満細胞（ 図3A-D）内に収容されたトリプターゼ顆粒を観察するために酸性化o-トルイジンブルーで染色しました。活性化の証拠を示した肥満細胞の割合、 例えば、拡散metachromaSIA、セル境界（ 図3D）の顆粒外に存在は...

ディスカッション

このプロトコルは、成体雄マウスにCP / CPPSを示す症状を誘導するために、NMSの形で、新生児のストレスを使用するための方法を提供します。大人として、NMSマウスはかなりのperigenital機械的異痛、ならびに前立腺組織における肥満細胞の脱顆粒の証拠が表示されます。 NMSを使用すると、として、それは多くの場合、慢性骨盤痛^12-14の患者によって報告された初期の生活上のストレスを、複製することで、CP / CPPSの前臨床モデルを開発するだけでなく、非侵襲性の誘導を組み込むための新規なアプローチでありますより一般的に使用される、化学的におよび前立腺^34,36-39の免疫学的に誘導される炎症に反対しました。さらに、マウスにおけるNMSが変化した不安様および快感喪失の行動を含む共存症状を産生することが示されており、排尿速度を増加させ、および過敏症の後肢^（16;データは示さず）によって示される併存の体性、気分、および内臓疾患に類似CP / CPPS patieNTS ^4-6。

マウスにCP /...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
妊娠中のC57BL/6匹の雌マウス	チャールズ	リバー027	時間指定または時間指定なしの妊婦は、自社出産のために毎日監視する必要があります。
2 Lガラスビーカー	Sigma-Aldrich	CLS10002L	各NMSリターは、21日間の分離期間中、同じビーカーに保持されます。
VWR強制空気インキュベーター、ベーシック	VWRインターナショナル	414005-124	キュベーターは33°Cで保持する必要があります。Cと50%の湿度。
タッチテスト感覚評価器、20個キット(タッチ評価用Semmes-Weinstein von Frey麻酔計)	Stoelting	58011	次のモノフィラメントは、生殖器周囲の感度評価に使用する必要があります:1.65 g、2.36 g、2.83 g、3.22 g、3.61 g、4.08 g、4.31 g、および4.74 g。
動物囲い(マウス12匹、ラット6匹)	IITC	435	マウスが逃げないように、個々のアクリル動物囲いの上に重いものを置いてください。
マウスとラット用のメッシュスタンド(12匹のマウス6匹)	IITC	410	安定したテーブルトップにスタンドを置くと、快適にアクセスできます。
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	P5493	10x PBSストックを1x PBSに希釈します。
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	マウスの心内灌流やマスト細胞染色の準備として組織を後置するためには、4%パラホルムアルデヒド溶液が必要です。
スクロー	スSigma-Aldrich	S5016	Cryoprotectは、4°Cの30%スクロース溶液中の組織を固定します。C一晩。
ヘプタン	Sigma-Aldrich	246654	乾燥氷の上でヘプタンを冷やして組織を凍結します。
標準クライオモールド	VWR International	4557	クライオスタット切片化前の前立腺組織の凍結を支援するため
Tissue-Tek OCT コンパウンド	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Biological Stain Commission によって認定されています。肥満細胞のメタクロマティック染色剤としての使用に適しています。
エタノール、絶対 (200 プルーフ)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% および 100% 溶液は、肥満細胞の可視化前に染色された凍結切片を脱水する必要があります。
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9888	酸性化NaCl溶液は、凍結切片を染色する前に新鮮にする必要があります。
GeneMate 滅菌 50 ml 遠心チューブ	BioExpress	C-3394	トゥーリジンブルーエレメントを混合したり、スライドを1xPBSに浸したりするために使用される使い捨てチューブ。
すりガラスカバー付きスライド10枚用のコプリン染色皿	フィッシャーサイエンティフィック	08-815	最大10個の標準3 x 1インチを保持します。(75 x 25mm)は背中合わせにスライドします。トルイジンブルーワーキングソリューション、95%EtOH、100%EtOH、キシレンには別々のディッシュを使用してください。
キシレン(組織学的)	フィッシャーサイエンティフィック	X3P	水後、組織はキシレンでクリアされます。
顕微鏡スライドボックス、100-Place	VWR International	82003	ボックスは、スライドの保管と輸送に使用できます。
フィッシャーブランド顕微鏡スライドボックス	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-400	これらのスライドボックスは、通常、凍結状態内に収まるほど小さいです。
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516	グリセロールは従来の封入剤です。
埋込用メディウム、Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	マウンティングメディウムは、カバーガラスをスライドにしっかりと接着します。
マイクロカバーグラス、長方形、No.1	VWR International	48393-106	脱水および透明化された組織にカバースリップを当ててサンプルを保護します。
光学顕微鏡	ニコン		当研究室で使用していたAdvanced Automated Research Microscope Eclipse 90iは、Eclipse Ni-Eを廃止し、代替となりました。