前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

サマリー

この原稿は、循環腫瘍細胞(CTC)から前立腺癌患者由来異種移植片(PDX)を生成するために使用される方法を詳述しています。CTCからのPDXモデルの生成は、前立腺がんを研究するための代替実験モデルを提供します。最も一般的に診断される腫瘍であり、男性の癌による死亡原因として多い。

要約

患者由来異種移植片(PDX)モデルは、がん研究で人気を集めており、前臨床の薬物評価、バイオマーカーの同定、生物学的研究、および個別化医療戦略に使用されています。循環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍転移において重要な役割を果たしており、いくつかの腫瘍タイプの患者から単離されています。最近、CTCは乳がんおよび前立腺がんのPDX実験モデルを生成するために使用されています。本稿では、当グループが開発したCTCから前立腺がんPDXモデルを生成する方法について詳述しています。従来のPDXモデルと比較した場合のこの方法の利点は、外科的サンプル収集からの独立性と、さまざまな疾患段階での実験モデルの生成です。密度勾配遠心分離とそれに続く赤血球溶解およびCD45陽性単核細胞のフローサイトメトリーの枯渇は、転移性疾患の患者から収集された末梢血サンプルからのCTCを濃縮するために使用されます。次に、CTCを免疫不全マウスに注射します。その後生成された異種移植片は、機能研究に使用したり、分子特性評価のために回収したりできます。この方法の主な制限は、CTC濃縮に使用されるネガティブセレクション法です。このような制限にもかかわらず、CTCからPDXモデルを生成することで、前立腺がんの研究に適用できる新しい実験モデルが得られます。

概要

患者由来の異種移植片は、癌の研究のために使用ますます人気の実験モデルです。彼らは、バイオマーカーおよび生物学的経路の特性、薬効の前臨床評価、およびパーソナライズされた癌治療のための^1,2のアバターを作成するために使用することができます。以前は、他の研究グループは、免疫不全マウス¹に単一の腫瘍細胞懸濁液または全腫瘍外植片を移植または注入のいずれかによってPDXモデルを開発しました。これらのPDX モデルは高価でもあると医原性罹患のリスク増加に患者を公開し、外科的処置を受けている患者からの新鮮な固形腫瘍、悪性腹水や胸水の外科的コレクションを必要とします。

癌研究における重要な最近の開発は、循環腫瘍細胞の検出、単離および特徴付けされています。これらの腫瘍細胞は、原発腫瘍塊から脱出し、循環に入ります彼らは転移や再発に重要な役割を果たしている場合には、癌の最も一般的な原因は、死亡率^3を関連します。いくつかの固形腫瘍タイプからCTCの評価および特徴付けは、診断、予後、および残留疾患^{3を監視するための}臨床情報を提供しています。物理的特性は、バイオマーカーの発現、またはCTCの機能的特徴のいずれかに依存する現在使用されている様々なアプローチは、効率的に⁴のCTC ^{を単離することができます} 。既存のマクロスケールCTCの単離方法は、密度勾配遠心分離、フィルター孔と表面分子に対する物理的な分離と濾過を含みます。最も広く使用されているCTCの分離方法は、CTCの抗体ベースのキャプチャに基づいています。細胞表面マーカーの正と負の両方の選択は、末梢血からのCTCを単離するために使用することができます。末梢循環中のCTCのための正の選択は、一般的に上皮マーカー （例えば、EpCAMを）を使用しますCTCのではなく、造血細胞上に発現再度。この方法の欠点は、転移の可能性を持つのCTCは、多くの場合、上皮-間葉³上皮表面マーカーを下方制御の移行（EMT）、受けているということです。白血球の正常な細胞集団を枯渇させる、転移の可能性、造血表面マーカー、CD45を用いた負の選択方法でのCTCを単離するために^5を使用することができます。

前立腺癌は、最も一般的に診断される癌、男性⁶における癌関連死の主要な原因です。腫瘍進行及び攻撃性のメカニズムは完全には理解されていないので、発生および前立腺癌の分子不均一性を再現実験モデルの特徴は、かなりの関心があります。前立腺癌のPDXモデルがされています immunocomにヒト前立腺癌細胞の移植によって以前に生成されましたマウス^7,8を約束しました。しかし、このようなモデルの生成は、主に疾患の無痛の性質に起因する免疫不全マウスへの前立腺癌の低い生着率によって妨げられてきました。最近、のCTCは、乳癌^9、肺がん¹⁰および前立腺癌¹¹ PDXモデルを生成するために使用されてきました。これらの概念実証研究では、外科的なサンプル収集の必要性とは無関係に、PDXモデルを生成する可能性を紹介しました。この記事では、具体的にこの新規実験モデルを生成するための方法について説明します。

プロトコル

このプロトコルは、制度の研究倫理委員会から承認を得て、私たちの施設で行われ、人間の福祉のためにすべての、機関、国、国際的なガイドラインに準拠しているされています。

進行前立腺癌患者からの末梢血の1コレクション

注：転移性前立腺癌患者を選択します。書面による患者の同意を得て、分離時の年齢と前化学療法とホルモン治療など、患者の臨床的特徴を、記録します。転移性疾患を有する患者は、潜在的に、末梢血中のCTCの最高濃度を持っています。

1. インフォームドコンセントの後、適切な治験審査委員会は、プロトコルを承認の下に血液サンプルを収集します。作業中のラテックス手袋、白衣を着用してください。
2. 25のG翼状針とチューブは、針ホルダに接続します。の面積をきれいにアルコール綿を使用して上腕と前腕の間の肘正中静脈は、その後、患者の上腕に止血帯を適用します。
3. 肘前静脈に翼状針を挿入し、収集を開始するために、ニードルホルダーに採血管を押してください。凝固を防ぐために、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する回収チューブ内の血液の約10 mlのを集めます。
4. 患者から翼状針を外し、1分間静脈穿刺部位の上に滅菌ガーゼパッドで圧力をかけます。滅菌包帯でカバーサイト。

単核細胞の単離2。

注：ステップ1から採取した血液は、単核のCTCに加えて、末梢血単核細胞（PBMC）（例えば、リンパ球および単球）が含まれています。

1. 5ミリリットル血清学的ピペットで50mlポリスチレンコニカルチューブにピペットの全血を1にハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加：1の比率。静かにピペット混合物を均質化します。
2. 空の50 mlのポリスチレンコニカルチューブに低速密度勾配遠心分離により、血液成分を分離するために、商業的に調製した溶液（フィコール - パック）を15mlを加えます。
3. 静かに明確なトップ層を形成するために、ステップ2.2からポリスチレンチューブに、ステップ2.1から、全血およびHBSS混合物をピペット。溶液の混合を最小限にするために、最も低い設定に設定ピペット、これは、効率的な分離を確実にします。
4. RT（25℃）で30分間、400×gで遠心分離します。分離後の溶液の混合を防止するために、最も低い設定に設定減速度。加速度を任意の速度に設定してもよいです。
5. 遠心分離した後、チューブの底の上部と分離ソリューションにプラズマとの間の層に挟まPBMCおよびCTCの薄い白灰色のストライプを識別します。
6. プラスチック製トランスファーピペットを用いて50mLのポリスチレンチューブにステップ2.5でホワイトグレーストライプから細胞を収集します。
7. PBMCおよびCTCをとCで50mlポリスチレンコニカルチューブにHBSSを追加10分RTは洗浄するために、400×gで再びentrifuge。
8. 洗浄するために、室温で3分間400×gで再びHBSSと遠心50mlの液体再懸濁ペレットをデカントします。
9. 上清を捨て、赤血球溶解緩衝液5mlで残ったペレットを再懸濁し、室温で5分間この溶液をインキュベートします。
10. RTで3分間、400×gでの遠心分離によって赤血球溶解緩衝液を除去します。
11. 上清を捨て、1mlのPBS 1Xでペレットを再懸濁前に抗体染色にブロックするために、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。

蛍光活性化細胞選別（FACS）のためのCD45-FITC抗体で染色3.単核細胞

1. 血球計数器または自動細胞カウンターを用いて（ステップ2.11）から実行可能（トリパンブルー陰性）細胞の数を定量化します。 （10％FBSを含むPBS 1Xで）1×10 ^6細胞 / mlの懸濁液を調製し、1時間氷の上に置きます。
2. 定量化を配布2つのチューブに前のステップからの細胞懸濁液。制御およびCD45染色などのラベルチューブ。
3. 250：コントロールチューブでは、1の希釈でIgG1κ型-FITC（2.5μgの/ ml）を追加します。 CD45染色チューブでは、1の希釈でCD45 FITC（2.5 / mlの）結合一次抗体を追加します。250、30分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートします。 CD45抗原の標識は、造血細胞を排除するために使用されます。
4. 4℃で3分間400×gで細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
5. 滅菌1×PBSで各ペレットを懸濁させることによって、細胞を2回洗浄し、4℃で3分間、400×gで遠心分離し、10％FBSを補充しました。
6. 10μg/ mlの濃度の4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含むPBS 1×1mlの溶液中に細胞を再懸濁。
7. 12ミリメートル×75ミリメートルのポリスチレン管に35μmのストレーナーキャップを通して最終的なソリューションをフィルタリングします。

前立腺CTCの4単離することによってFACS

注：ライブCD45負のCTCを収集するために、フローサイトメーターを利用しています。

1. 「コントロールを。」と表示されたチューブからの細胞を使用して補償制御を設定
2. 破片や、適切な前方散乱および側方散乱パラメータを使用して、細胞のクラスターを除外ゲートを作成します。
3. ラベルされたチューブから、細胞懸濁液を用いて、FITCゲートを確立する「CD45-FITC。」
4. パシフィックブルーチャンネルを用いたゲート実行可能（DAPI陰性）細胞。
5. ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640の2ミリリットルを含む滅菌15ミリリットルポリスチレンコニカルチューブにCD45陰性集団を収集し、10％FBSを補充しました。
6. 10％FBSを補充したRPMI500μlの - 遠心3分間400×gでソートされた前立腺腫瘍細胞懸濁液は、その後、200でペレットを再懸濁します。

マウスおよび異種移植片の成長のモニタリングにCTCの5インジェクション

注意：制度的動物管理委員会により承認されたプロトコルに準拠したすべての動物の手順を実施します。このプロトコルは、すべての関連する規制や制度機関、規制やガイドラインに従ってやコンプライアンスに私たちの動物ケア委員会によって承認された特定の動物を使用する議定書の下で私たちの施設で行われています。

1. 氷上で1比と場所：1で、細胞外マトリックスとソートされた前立腺腫瘍細胞懸濁液を混ぜます。
2. 酸素を1L /分で5％（v / v）の吸入イソフルランを供給するチャンバで皮下移植する前に、マウスを麻酔。マウスでは、角膜やつま先反射の消失を確認することにより、適切な麻酔を確認してください。
3. 25 G針および1mlシリンジを用いて、8~10週齢の雄の免疫不全マウスの両方の上部側面に前立腺腫瘍細胞および細胞外マトリックスの細胞懸濁液を皮下の250μLを注入します。注入量をiとして関係なく、CTCの濃度の250μLを注入mportant値。マウスの最大のSQ投与はわずか1 mlです。  
4. 皮下結節性密度の成長のためのマウスの注射部位の毎週触診を行うことによって、および週2回、マウスの体重を測定することにより、マウスを監視します。
5. 腫瘍の大きさは、分子分析および連続継代のために十分な腫瘍組織を確実にするために、以上0.5 cmであり、最大直径が1cm未満である場合に頸椎脱臼および収穫皮下ヒト前立腺癌異種移植片に続く二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させます。無腫瘍にもかかわらず、苦痛または15％の体重減少の徴候を有するマウスを安楽死さが触知可能です。

結果

このプロトコルは、単離されたCD45陰性の前立腺癌のCTCからPDXモデルの生成につながります。我々のプロトコルで使用されるネガティブ選択法に基づいて、それはDAPI染色を用いて死細胞を排除することが必要です。フローサイトメトリーにより検出されたCD45陰性細胞の割合は可変であり、患者（ 図1A）の腫瘍量に依存します。白い矢印（ 図1B）に示されるように、CD45及びDAPI（細胞核を識別するために）を使用してソートされていない細胞の免疫蛍光染色は、CD45陰性細胞を明らかにする。 図1Cに 、皮下結節密度は、マウスの両脇腹に見ることができます。各結節密度は、異種移植片の成長を示し、それは、マウスの背側筋から突出し、質感でより強固であるように、健康な組織から区別できるように理解することができます。注入および異種移植片の開発との間の時間間隔はpatieのCTC負担に応じて大きく異なる場合がありますNTサンプル、移植された細胞の数と、CTCの生物学的攻撃性。 CTCから生成された前立腺PDXは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって示され...

ディスカッション

この原稿は、CTCのから前立腺癌PDXモデルを生成するための方法を説明します。 PDXを生成するためのCTCの使用 既存の方法と比較した場合のモデルはいくつかの潜在的な重要な利点を有します。まず、末梢血からのCTCのアクセスコレクションは、異なる疾患段階で同じ患者からの実験モデルを生成することができます。第二に、血液採取は、腫瘍細胞の収集のための外科的処置を必要とする既存の方法と比較すると、腫瘍細胞を単離するために安全で安価な方法を表します。

CTCの濃縮の複数の方法は、しかし多くは資金とリソース制限のために、すべての研究室にアクセスすることはできません記載されています。私たちは、FACS、多くの研究室のために、便利な手頃​​な価格でアクセス可能な方法論を使用することに生かすことができ、私たちの研究室でのアッセイを開発しようとしました。この方法の潜在的な制限があります高い腫瘍負荷を有する患者にこのプロトコルの使用が制限される可能性が希少細胞の検出のための不十分な感度。上皮細胞の物理的または生物学的特性を利用するいくつかの追加の技術が上にこの制限を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640	ブコライフテクノロジーズ	11875-093
シ胎児血清(FBS)	ギブコライフテクノロジー	ズ10437-028
ニシリンストレプトマイシン	ギブコライフテクノロジー	ズ15140-122
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	コーニングセルグロ	21-031-CM
35&マイクロ;m Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml ポリスチレン コニカルチューブ	Crystalgen	23-2263
赤血球溶解バッファー	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm ポリスチレンチューブ セルストレーナーキャップ付き	BD Falcon
BDバキュテナーラベンダー採血チューブ(EDTA
) BDウィングド採血セット(プッシュボタン付き) リトラクトニードル 23ゲージ
BDバキュテナー ワンユースニードルホルダー
使い捨てラテックス止血帯
ラテックスまたは非ラテックス手袋
アルコール綿棒
2 x 2綿ガーゼパッド粘着
包帯
25G針
1ml注射器

ギウペ352235付き