エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

サマリー

この研究では、ゼブラフィッシュの幼生に対してEvans Blue Dye(EBD)分析を行う簡単な方法について説明します。 この技術は、骨格筋の完全性の特性評価と筋ジストロフィーのゼブラフィッシュモデルの描写のための強力なツールであり、新しい治療法の開発に貴重な方法です。

要約

ゼブラフィッシュモデルは、神経筋障害の研究のための新しいシステムです。 神経筋疾患の研究では、筋膜の完全性が重要な疾患決定要因です。 今日までに、多くの神経筋の状態が異常な膜の完全性を伴う変性筋線維を示しています。これは、筋ジストロフィーで最も一般的に観察されます。 Evans Blue Dye(EBD)は、変性、損傷、またはアポトーシス細胞に急速に取り込まれる重要な細胞透過性色素です。対照的に、それは無傷の膜を有する細胞によって取り込まれない。 EBD注射は、神経筋疾患のマウスモデルで筋肉の完全性を確認するために一般的に使用されます。 ただし、このようなEBD実験では、分析前に筋肉の解剖および/または切片化が必要です。 対照的に、ゼブラフィッシュのEBD摂取は、生きた無傷の調製物で可視化されます。 ここでは、生きたゼブラフィッシュでEBD注入と分析を行うためのシンプルでわかりやすい方法論を示します。 さらに、EBD分析の有効性を高めるための共注入戦略を実証します。 全体として、このビデオ記事では、神経筋疾患のゼブラフィッシュモデルでEBD注射と特性評価を行うための概要を説明します。

概要

筋ジストロフィーは、特定の組織病理学的特徴^1,2を持つ、一般的で不均一なヒトの筋肉疾患のグループを構成しています。 この壊滅的な疾患のグループに関連する症状には、筋力低下、筋変性、運動性の喪失、早期死亡などがある^1,3。 筋ジストロフィーの主な病態メカニズムは、筋連球を安定化させるタンパク質の喪失、膜貫通複合体のアンカー、および膜を横切る細胞シグナル伝達を媒介するタンパク質の喪失です^4-6。 例えば、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の主要な足場タンパク質であるタンパク質ジストロフィンが完全に失われると、デュシェンヌ型筋ジストロフィー7^では筋膜が不安定化します。 ほとんどの筋ジストロフィーは、細胞外マトリックスとサルコレム細胞骨格との間のリンクに関与するタンパク質の突然変異に起因するという事実のために、細胞レベルでの一般的な観察はサクロレンマル完全性の喪失である^8,9。 筋ジストロフィーに関連する主要な病態メカニズムのこの理解は、動物モデルシステム^2,10-15を用いた長年の研究の産物です。 しかし、この分野の進歩にもかかわらず、ジストロフィーのサブタイプの範囲の治療または管理のための治療選択肢はまだ限られています。 この実行可能な治療法の限界は、いくつかの重要な要因によるものです:1)遺伝子治療戦略の難しさ、2)de-novo疾患症例の高頻度とそれに対応する翻訳可能な動物モデルの欠如、および3)明確で再現性のある結果測定による推定治療薬の生理学的結果をテストするための厳密な戦略の欠如。

>jove_content<これらの制限のいくつかを克服するために、私たち自身を含む多くの研究室が、ヒトの神経筋疾患^をモデル化し研究するためのシステムとしてゼブラフィッシュを採用しています2。今日まで、ゼブラフィッシュは疾患研究において貴重なツールであることが証明されています。 ゼブラフィッシュモデルは、突然変異^16,17を引き起こす新規のヒト疾患を特定し、検証し、特徴付けられていない疾患を引き起こすメカニズム^17,18を解明し、新しい治療戦略^12,19を特定するために使用されています。 これらの進歩は、部分的には、ゼブラフィッシュシステムの標準的な強み、例えば、その光学的明瞭さ、遺伝子操作の容易さ、大量に繁殖する能力などによってなされた²⁰。 ゼブラフィッシュはさらに、新規治療薬の同定のための貴重な方法である大規模な薬物スクリーニング²¹に修正可能であることが証明されています^22-24。 筋疾患の研究に関しては、これらの強みは、解離²⁵を介して単一のゼブラフィッシュ骨格筋線維を分離する能力と、複屈折²⁶と呼ばれる光学現象を使用して生体内で筋線維組織を調べる能力によって補完され、巨視的な筋肉の完全性を迅速に決定することを可能にする。 これらの利用可能なユーティリティに関係なく、調査を進めるためには、さらなるツール開発が継続的に必要とされています。

私たちや他の人々は、ゼブラフィッシュモデルでのEBD注入と分析のためのプロトコルを採用しました。 EBDは、損傷した細胞、変性細胞、またはアポトーシス細胞に取り込まれ、蛍光²⁷で可視化される重要な細胞透過性色素です。 今日まで、EBD分析は、骨格筋および心臓疾患のマウスモデルにおける筋膜完全性を分析するために広く使用されてきた^8,9,27。 しかし、哺乳類の調製物では、採取した筋肉は通常、分析前に面倒な切片化または解剖を必要とします。 ゼブラフィッシュでは、生きた動物と無傷の動物を用いて、大量に直接分析が可能です。 このビデオ記事では、ゼブラフィッシュジストロフィー変異株sapje^15,28におけるEBD取り込みの代表的な画像とともに、生きたゼブラフィッシュの幼生にEBD注入と分析を行う方法論を示します。 さらに、EBD 調製物の定量化を高めることができる同時注入戦略を提示します。

プロトコル

寒天注入プレートの調製（時間：45分）

1. E3培地で2％〜3％のアガロースを煮て、その溶液をベンチにわずかに冷却します。注：準備されている注射板の数は、必要なアガロースの量を決定します。各注入プレートは、アガロース溶液の約35ミリリットルが必要です。
2. 煮沸後に、所望の温度に到達するまで、アガロースが冷却する（ 例えば ^、45°C）射出成形金型の製造者の指示に従って。
3. 100ミリメートル皿にアガロース冷却の約35ミリリットルを注ぎます。
4. 溶液中に好適な射出成形金型の一方の端を置き、その後、（これは気泡の発生を減らすのに役立ちます）アガロース溶液に金型の残りの部分を置きます。
5. アガロース溶液を約30分間、室温または^4℃のいずれかで固化することを許可します。
6. 固体アガロースから金型の一方の端部を分離するために、スパチュラを使用します。ゆっくりメートルの残りの部分を削除古い。

エバンスブルー色素（EBD）注射ミックスの調製（時間：30分）

1. 1Xリンゲル液中EBDの1％の株式を行います（; 5のKCl、155 mMの塩化ナトリウムを2 mMの_塩化カルシウム、1mMのMgCl _2、2 mMの_の Na 2 HPO _4、10mMのHEPES、10mMのグルコース、7.2のpH）、これは室温で保存することができます。
2. ^-20℃で1×リンゲル液およびストアに25 mg / mlの時MW万キロダルトン-デキストランフルオレセインイソチオシアネート（FITC）の原液を作ります
3. （ すなわち 、100μlの最終作業容量のために：FITCデキストラン株式の90μlの1％EBD10μlのミックス）FITC-デキストラン株式の原液で直接0.1％にEBDを希釈することにより、注射ミックスを調製します。
4. 徹底的にボルテックス注射ミックス（それがグリーンに点灯します）とアルミ箔で注入ミックスチューブをラップすることによって、直接光のうちに保ちます。

3. EBD注入準備（時間：約30分）

ENT ">注：プロトコルは3-7日後に受精（DPF）から幼虫に最適です。

1. RTへの事前暖かい注入プレート。
2. 金属板にマイクロマニピュレーターを配置することにより、射出装置を設定し、注入のために使用されている顕微鏡の隣に立っています。空気駆動マイクロインジェクションコントローラーの電源をオンにします。注：優先噴射システムは、ラボによって変化し、分析の結果を変更しないでください。
3. バックEBDミックスの約2〜4μlの注射針を埋めます。
4. EBDミックスの約5 NLに注入量を調整します。注：注入量の校正が校正方法に依存するであろう。ガス圧力がインジェクタマイクロメータを使用してボリュームを介して較正されたボーラス注入量を必要とするのに対し、ピストン駆動注射、直接指定された噴射量に設定することができます。
5. 1Xリンゲル液で濡れ注入プレート、ウェルから過剰を取り除きます。
6. 0.04％の3-アミノ安息香酸エチルメタンサルによる前治療の幼虫噴射の開始に先立って、幼虫を固定する1Xリンゲル液中に希釈トン（トリカイン）。注意：適切な注入が任意の残留運動では困難であるとして、幼虫が完全に動けないです確保することが重要です。
7. ガラスピペットを用いて寒天注入プレートのウェルに麻酔幼虫を置きます。幼虫が完全にウェル内とその側に横たわっていることを確認してください。注：ウェル当たり幼虫数は実験者に任されています。
8. 幼虫をウェルに入れられた後、ウェル内の幼虫の動きを最小限に抑えるために、過剰なリンガー溶液を除去します。幼虫は脱水しないように、溶液の残量を残します。

EBDとゼブラフィッシュ幼虫の4心膜注射（時間：幼虫注入の数に依存し、推定1-3時間）

1. 注射が行われる解剖スコープの幼虫を含む注入プレートを置きます。
2. 含む注入ピペットの針を置きEBDは、ゼブラフィッシュの幼虫の上に混ぜます。
3. 位置を再注射針は、幼虫の心の近くにあり、約^45°の腹側に前後軸からので、それを回転させることによって注入プレート。
4. 静脈が最初に背側方向に旋回している卵黄（ 図1）の前部に静脈の領域に共通の主静脈（CCV）に注射針を挿入します。注意：最大40倍までの倍率がはっきりCCVを参照することが有用であり得ます。
5. EBDミックスの5 NLを注入し、EBDミックスの即時漏れを最小限にするために5-8秒の位置に注射針を保ちます。注：良い注入が心室（ 図1）で見られる色素の着色を持つことになります。 EBDミックスを中心に観察されない場合には、EBDミックスさらに5 NLを注入し、色素の取り込みを誘導するのに十分であり得ます。あるいは、胚を廃棄することができます。
   注意：いくつかの状況では、心臓が鼓動を停止することがあります。このOの場合ccurs、20〜40秒間の幼虫を監視し続けます。色素が循環系を通って移動するように一般的に、心臓は鼓動を再開します。
6. 次の幼虫と繰り返しに移動します。
7. （ 図2）注射直後に血管系におけるFITC-デキストランの存在を観察することによって成功した注入された胚を特定します。

5.インキュベーションおよびEBD取り込み（時間：4-6時間）

1. 幼虫の所望の数が注入された後、戻り値は、100mm皿にトリカインなし1Xリンゲル液に幼虫を注射しました。
2. アルミホイルで包んで料理をしてください。注：キーピングが著しく生存率が増加し、信号強度の最大の一貫性を確実に暗所で幼虫を注射しました。アルミ箔でラッピングは幼虫がインキュベーターの外にある一定の期間のために特に重要です。
3. 幼虫は十分EBD取り込みを確実にするために4-6時間^28.5℃でインキュベートすることを許可します。

筋肉内EBD 6.可視化（時間：幼虫注入顕微鏡の種類の数に応じて、推定0.5〜3時間）

1. 画像化の前に、移動を防止するために、0.04％のトリカインで幼虫を麻酔。
2. EBDの取り込みが骨格筋（ 図3）で発生しているかどうかを判断するために赤色蛍光の下にあるViewの幼虫。

結果

EBD注入ミックスは3 DPFでsapjeホモ接合変異体および野生型同胞のCCVに注入しました。 （ 図1B）は、心臓チャンバを充填注射は、次に緑色蛍光（ 図2）の下に血管系にFITCデキストランを可視化することによって成功した注射のために分析しました。

4時間のインキュベーション期間の後、EBD取り込みは蛍光顕微鏡を用いて体節のレベルで調べました。 sapjeホモ接合変異体は筋肉膜^15（ 図3B）への損傷を示す、EBD取り込みを示した野生型の兄弟は、目に見える筋線維（ 図3A）内にはEBD蛍光を示さありませんでした。

図1.ジェクトEBD注入ミックスゼブラフィッシュエンブリーの総主静脈（CCV）へO。 （A）非注入胚。矢印は、CCV注入のための理想的な場所を示します。 （B）CCVに成功した注射。染料は、心腔（矢印）に入り、血管系を通って圧送され始めます。失敗したCCV注入は胚（矢印）の卵黄嚢に入る色素の一部または全てになります（C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.胚は、直ちに注入前EBD取り込みに以下の血管系全体に緑色蛍光下のFITC-デキストランの分布を観察することによって成功した注射用ソートすることができます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：EBDは、損傷した膜を有する繊維によって取り込まれる（A）野生型兄弟が筋線維にはEBD蛍光を示さありません。 （B）は、複数の筋線維（矢印）内EBD蛍光とSapje ​​ホモ接合変異体。すべての幼虫がEBD注入ミックスを注射し、3 DPFで4時間のインキュベーション期間後に分析しました。兄弟および変異体は、CCVの注入前に筋線維脱離することにより選別した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、神経筋疾患^2,29の研究のための強力なツールとして浮上しています。現在までに、ゼブラフィッシュ系は、新たな筋疾患を引き起こす突然変異^{16,17,30を検証する}新規な発症機序^{を解明18、}及び潜在的に新しい治療薬^{12,24を識別}するために使用されています。これらの集団的努力は、人間の神経筋疾患をモデル化するためにゼブラフィッシュの有用性を確立しています。しかし、ゼブラフィッシュおよび哺乳動物モデルで作られた進歩にもかかわらず、神経筋条件の広いスペクトル内の患者のための限られた治療の選択肢があります。そのため、高い需要が壊滅的な疾患のこのグループの治療法の開発のために存在します。治療のためのこの要求を並列接続すると、新しい動物モデルおよび推定治療戦略を検証するための継続的な実験技術革新だけでなく、厳密な分析のための対応が必要です。

EBDの分析は、一般的にマウスモデルで使用されています組織や脳、心臓、骨格筋^27,31における細胞損傷を研究。最も顕著なのは、EBDは、筋膜の不安定性の深刻度を示し^{、8を損傷}するために様々な筋ジストロフィーのサブタイプのマウスモデルにおいて広く使用されています。筋膜損傷を明らかにするEBDの使用は、ヒトの疾患状態⁹に動物モデルの類似性を確立支援するパラメータです。マウスではEBDの電力は、開発し、神経筋疾患のゼブラフィッシュのモデルにEBDを適用するために、私たち自身を含むいくつかの研究室が、リードしてきました。原因EBD分析の適用に、この技術は積極的にヒトの疾患状態^{11,15,22,24,32}にゼブラフィッシュモデルを裏付けるために実施されています。損傷した筋肉の膜との幼虫は、筋線維内EBD取り込み、したがって、赤色の蛍光を持つことになります。蛍光は、繊維間の空間内に観察されたが、個々の筋線維内でTにおける基底膜から脱着繊維の有益かもしれません膜損傷の彼が不在、有用な診断の詳細を提供します。 EBD分析は、動物モデルの検証を超えた潜在的な用途を有しています。私たちの研究室からの努力は、最近EBD分析は、潜在的に新規の治療薬^{24を検証する}のに有益であることを実証しました。潜在的な治療処置が軽減または関連する治療作用^8を意味することができます神経筋疾患モデルにおけるEBD取り込みを廃止するかどうかの確認。このタイプの分析は、治療薬の機構（単数または複数）を確立する助けとEBD解析の適用を拡大することができます。

多くの技術と同様に、EBD解析は、実験計画と実践の間に観察するには、いくつかの注意点を持っています。例えば、それは、経年組織の肥厚にCCVを識別するために挑戦することができます。加えて、実験的な数を減少させ、幼虫の多数プリパレーションする必要性を増大させる、心膜注入前との間に調製物中の幼虫を損傷することは容易です。損傷した筋肉はEBDを取ることができますようにまた、取り扱いおよび注入中の幼虫に行っ物理的な損傷は、偽陽性になる可能性があります。これらの障害のいくつかを克服するために、我々は、注入の前、その後の分析に成功した直後に、色素注入と幼虫の簡単かつ信頼性のある同定を可能にするこのビデオ資料に共射出戦略を記載しています。前の筋線維によるその取り込みを血管系内のEBDの確認を可能にすることによって成功した注射用の共射出コントロールFITCデキストラン。筋線維に回収されていない場合EBD蛍光は、数時間後に幼虫に非常にびまん性になるように、これは特に有用である可能性があります。このように、検出するのが困難であることができます。また、CCVが欠落し、卵黄または体腔にEBDを注入して、インキュベーション後、胚を制御するために同様の拡散赤色蛍光で、まだ損傷した筋線維による取り込み可能性の減少をもたらすことができます。まとめると、これらの洞窟ATSはEBD注入が一貫して信頼性の高い結果を得るためには忍耐と練習が必要示唆しています。

すべてでは、我々は、ゼブラフィッシュの幼虫にEBD分析を実行するための実用的かつ簡単な方法を説明します。現在までに、モデル系としてゼブラフィッシュの使用は、特にヒト疾患モデルとして、急速に拡大しています。この拡張は、ゼブラフィッシュシステムの現在の利点を改良実験技術の継続的な開発と変更に部分的に起因しています。 EBD注入技術は、ゼブラフィッシュ筋疾患モデルの検証と研究のための研究者の兵器庫に追加し、強力なツールを提供します。この技術の継続的な実施と修正は、新規治療戦略だけでなく、疾患を引き起こすメカニズムを解明するのに役立つ可能性を秘めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フルオレセインイソチオシアネート-デキストランMW 10,000	グマ	FD10S
エバンスブルーダイ	シグマ	E2129
チル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩	シグマ	A5040
100ミリメートルシャーディッシュ	フィッシャーブランド	FB0875712	インジェクションモールドベース
薄肉ガラスキャピラリー	ワールド精密機器	TW100F-4	注射針
用 アガロース	バイオショップ	AGA001	射出成形金型
マイクロインジェクション金型	適応科学ツール	TU-1	射出成形金型
塩化ナトリウム	バイオショップ	SOD001	リンゲル液
塩化カリウム	バイオショップ	POC888	リンゲル液
塩化マグネシウム六水和物	シグマ	M2670	リンゲル液
リン酸ナトリウム 一塩基性一水和物	シグマ	S9638	リンゲル液
HEPES	シグマ	H4034	リンゲル液
グルコース	バイオベーシック	GB0219	リンゲル液
塩化カルシウム	シグマ	C1061	リンゲル液