熱画像は、非侵襲的に拘束されていない鳥でストレスを研究します

サマリー

ストレスの非侵襲的評価のための必要性が存在します。本稿では、軽度の急性ストレッサーに野生青おっぱいで目領域の温度で有意な応答を検出するための熱画像を使用して単純なプロトコルを記述します。

要約

ストレス、生物学の中心的な概念は、課題への緊急対応のスイートを説明します。他の応答の中で、ストレスが重要な臓器への血液の正味の流入およびコア温度の増加をもたらす血流の変化をもたらします。このストレス誘発性高体温は、ストレスを評価するために使用されます。しかし、コアの温度を測定することは、侵襲性です。血流がコアにリダイレクトされるように、体の周囲を冷却することができます。本稿では、末梢体温を赤外線サーモグラフィを使用して野生青おっぱい（Cyanistes caeruleus）で非侵襲的に測定されているプロトコルについて説明します。フィールドでは、セットアップ餌ボックスを使用して、カメラの前で理想的な位置に鳥をもたらすを作成しました。カメラは、軽度のストレッサー（ボックスを閉じるため、鳥を捕獲する）を適用する前に邪魔されずに鳥の短い熱録画をとり、トラップさに鳥の応答が記録されています。目領域の素肌があります画像内の暖かい地域。これは、エラーの最も一般的な原因を取り除く手動のデータフィルタリング（モーションブラー、点滅）のさらなるステップに続いて、各画像フレームからの最大の目領域の温度の自動抽出が可能になります。このプロトコルは、私たちは非侵襲的ストレス応答のダイナミクスを研究することを可能に細かい時間分解能で、目領域の温度の時系列を提供します。さらなる研究は、眼領域の温度応答がストレッサーの強さに比例しているかどうかを調査するために、例えば、ストレスを評価する方法の有用性を実証する必要があります。これを確認することができれば、動物のストレス評価の貴重な代替方法を提供し、動物福祉の研究者に生態学者、保全生物学者、生理学の研究者の広い範囲に有用であろう。

概要

ストレスはホメオスタシス^1,2を復元しようとした環境課題に応じて、生物の緊急対応を記述した、生物学の中心的な概念です。ストレス、血液グルコース、脂肪酸およびアミノ酸レベル、心拍数、呼吸速度および代謝速度のすべての増加、及び血液下芯器官²に周囲からそらされます。生理学的変化のこの一般的なパターンは、社会的、生理的な課題の配列に迅速かつ適応的に対応することができるように動物をプライミング。ストレスを認識し、理解することは純粋な動物応用研究の両方の中心にありながら、気ままな動物のストレスを評価することは課題です。

ストレスの広く使用されている生理的マーカーは、コルチゾールおよびコルチコステロン^、1,2-グルココルチコイドホルモンの循環レベルの増加、です。このアプローチの大きな強みは、その濃度は、私が大きくなることですn個の割合は、ストレスを定量化することができるように、強度をストレッサーします。しかし、グルココルチコイドは、「ストレス」のホルモン自体ではなく、エネルギー貯蔵のmobilisers ^2。グルココルチコイドレベルは、エネルギー必要量、一日の時間、年齢や生殖状態^3,4と、ならびにそのような機会^5を交配として明らかに正の状況に応じても変化するように。グルココルチコイドレベルは、したがって、慎重に、コンテキストの中で解釈されなければなりません。急性ストレスに対するグルココルチコイド応答を測定することもいくつかの制限があります。急性ストレッサーは、最初にグルココルチコイドレベルを増加し、その後ベースラインレベル^1,2に戻るの動的応答を引き起こします。グルココルチコイドのサンプルは、一般的に測定されたグルココルチコイドレベル^{6に影響を与える可能性があり} 、したがってそれ自体がストレッサーであり、採血により、侵襲的に得られます。さらに、グルココルチコイドレベルは、1つまたは非常に少数の時点Pで測定することができます。個人内の動的ストレス応答の時間を通じて変化を調べるために我々の能力を制限、ピークレベルとタイミングや応答時間の変化をキャプチャしない場合がありoints、。このような、毛または羽毛^8は 、慢性的ストレス要因を研究するために有用ではあるが、数日または数ヶ月の長い時間スケールでの平均グルココルチコイドレベルを測定する急性ストレスの研究に適用されない糞⁷からなどのホルモンサンプリングの非侵襲的な方法、 。でも最高の確立された方法は、個人の間で急性ストレスの変化にのみ限られた視点を提供したように、生理的応力測定における代替方法が必要とされています。

ストレス応答は、生理学的効果の数を必要とするなどのストレスを示している可能性があり、他の候補があります。中でも体コアへの周囲から、交感神経媒介血管収縮チャンネル血。様々な形と一緒に血液ので、この熱の集中、ストレス誘発性熱産のSは、 ^コア 9 ^を暖めます。このような、コア温暖化としては、（SIH）ストレス誘発高体温と呼ばれる、医薬研究¹⁰における急性ストレスのマーカーとして使用されています。 SIHは通常、急性のストレッサー¹⁰の10〜15分以内に0.5〜1.5°Cで深部体温を上昇させます。 ^{17 -}それは動物をキャッチし、取り扱いの一般的に適用される実験的ストレッサーは、哺乳類と鳥類¹¹の範囲の中核体温を上昇させることができる比較的よく文書化現象です。重要なことは、SIHは、心拍数^18、グルココルチコイドレベル¹⁹および行動^20,21などのストレスの他の確立指標と相関します。また、グルココルチコイドレベルのように、コア温度が直線的にいくつかの種²²の応力レベルに関係しています。しかし、採血のように、コア温度の測定は、挿入Oを必要とする、それ自体が侵襲的であり^プローブ 10のr個の注入。ベースラインコア温度は徐々にストレス誘導処理またはプローブ挿入^23を繰り返さなければならないたびに増加します。遠隔データにアクセスできるように、温度記録装置における最近の開発は、少なくとも²⁴大型動物のために、解決策を提供してもよいです。

SIHを生成し、同じメカニズムの中で、しかし、ストレスのさらに別の潜在的なマーカーにある：血液を移動させ、末梢血管収縮を、その熱で、コアに同時に皮膚^{17を冷却します。}コア温度とは異なり、皮膚の温度は、赤外線サーモグラフィ（IRT）によって、完全に非侵襲的に測定することができます。 IRTは、温度^25内に物体の表面から放射される赤外線を変換します。動物の表面は、典型的には、皮膚の温度を直接誘導することができるいくつかの裸パッチを持っているとして、それはトンの周りの自然に露出した皮膚（例えば、領域へのアクセスを必要とします彼の眼）または毛皮や羽をトリミングすることによって裸パッチを作成します。皮膚や動物の適切な露出領域に提供されるアクセスは、カメラの視野内に保つことができ、IRTカメラが撮影し、個人間で比較することが、おそらく完全な温度応答を可能にする、リモート連続皮膚温度測定値を収集するために使用することができます。既に温度応力^26を急性に応答表面ニワトリにおいて示されているが、本研究の新規性は、以前の研究よりも細かい時間分解能での野生動物の表面の体温を測定し、また予想される皮膚温度降下ができることを示していることです温度、湿度、天候が可変であるフィールドで検出されます。本稿の目的は、熱画像を使用して、制約のない動物の皮膚温度を測定するために必要な方法論を記述することです。私たちは、自由生活ブルーおっぱい（Cyanistes caeruleus、リンネ1758年軽度の急性ストレスを誘導するためにキャプチャを使用）と穏やかなストレッサーに応答して、鳥の皮膚温度の著しい冷却を実証するその時間に対する温度応答曲線を生成するために、適切なイメージをキャプチャ画像を分析し、データを処理する方法について説明。これは、動物福祉の研究者に生態学者、保全生物学者と生理学の研究者の広い範囲に役立つ野生とキャプティブ動物のストレスを評価するための貴重な代替方法を提供することができます。

この研究は、2013年12月17 ^番目までの期間で実施され、された^第 4落葉樹オークで2014年1月（ コナラ属）エコロジーのためのスコットランドのセンターと自然環境（シーン）で、森林、グラスゴー大学東の海岸でローモンド湖、中央、西スコットランド（56.13°N、W°4.13）の。 （1）放し飼いの動物からの熱画像をキャプチャするために下に適切な条件を設定する、（2）applyi：プロトコルは、主に3つの手順を必要とします熱動画を撮影しながら、急性ストレッサーngの、及び（3）その後、急性ストレッサーに対する動物の応答を特徴付けるために使用することができる熱画像からデータを抽出し、処理。私たちのケースでは、熱画像キャプチャの条件を最適化した後、鳥が中にあったときにリモートで供給ボックスを閉じてキャプチャストレスを適用された供給ボックス（撮影セット・アップ）に自由生活スズメ目、青報復を集め。熱画像キャプチャおよびデータ抽出の説明は、我々が使用する機器に固有であり、そして熱画像システム間で変化してもよいです。データ処理は、オープンソースソフトウェアを用いて説明します。

プロトコル

倫理の声明：

仕事は鳥類のための英国の信託鳥で軽度のストレスを誘発キャプチャプロトコルによって承認された自由生活の小さなスズメ目のルーチントラップ法は、英国内務省のライセンスの下で行われた関与しました。

ビデオ撮影のために1.セットアップ

1. 鳥がカメラ（ 図1）の前で自分自身を配置することが奨励されている撮影のセットアップを作成します。鳥は、一方の端部壁の穴からセットアップに入り、反対側の端壁に近い食料へのアクセス権を持っています。
2. セットアップに鳥を慣らすためには、記録前に数週間フィーダに適切な食品（例えば、ピーナッツカーネル）を提供します。別に食品の提供から、セットアップが妨害されないままにしておきます。この期間中に、鳥が、カメラに慣れることができるようにフィーダの前にダミーの三脚を置きます。
3. 記録の日に、availabiを減らしますフィーダから残りのすべての食品を除去し、鳥が食べ物にアクセスするための上部の中央にあるだけの小さな穴に透明な容器に収容された食品とそれを置き換えることにより、セットアップ中にピーナッツカーネルのリティ。エントランスホールとは反対側の端に位置ケージの中心部に位置する食品容器を。
4. それはすべての画像に表示されますので、箱のメッシュの四隅のいずれかで自然な外皮のものに既知の放射率の黒い絶縁テープの小さな正方形を置きます。 0.1℃毎に1秒の解像度で黒い絶縁テープの温度を記録温度ロガーに接続された熱電対に黒い絶縁テープを取り付けます。
5. ボックスのすべてがカメラの視野内に収まると、透明容器から供給する鳥は、焦点のカメラのゾーン内に配置されるように、ボックストラップの中心からの熱画像カメラ50センチ置きます。カメラを設定し、ノートパソコンにカメラを接続 （タイムスタンプ付き）毎秒7.5フレームの平均で画像を記録し、そこに保存するノートPCのハードディスクに画像を送信します。
6. セットアップの回転ドアに釣り糸を取り付け、実験者は、鳥の視界から隠されているが、セットアップがまだ観察できる位置にそれをロールアウト - 約20メートルのセットアップから。

2.軽度急性ストレスに鳥の対応をビデオ撮影

1. 鳥は供給ボックスに入ると、 約 5秒間ボックスに邪魔されずに鳥を残します。
2. 鳥は供給ボックスを閉じるには、ボックス内に約 5秒を過ごした後に釣り糸を引き出します。鳥は鳥への損傷のリスクを最小限にするために、ボックスの遠端のままであることに注意してください。
3. 直ちに供給ボックスに近づき、約3分間、カメラの後ろに動か立ちます。次に、ボックスからの鳥を取得し、それを手放します。

熱画像から眼領域の温度の "> 3。抽出

1. 各フレームから最高温度を抽出します。注：最大温度は、事実上、常にperiophthalmicリング（ 図2）の露出した皮膚で囲まれ、目の周囲の領域内から記録し、以後、目領域の温度と呼ばれています。
   1. 熱画像解析ソフトウェアは、画像の上で右クリックして、画像の最大のための新たなプロット」を追加します」。次に、右のCSVファイルにデータ（アイ領域の温度とフレームが撮影された時間）をエクスポートし、プロットをクリックしてください。
2. CSVファイルから鳥の目領域が見えなかったフレームからのすべての行を削除します。
3. ^R 27で時間に対してプロット最高温度、手動で識別どこoutsid低い値を持つ2つの連続した瞬膜が目の上に引かれた測定値（点滅）と点の間の温度の急上昇が> 0.2ºCポイントE鳥²⁸のための身体温度の範囲（ すなわち、目領域が複数のフレームのための運動を通して見えるが、ぼやけた場合）と、ステップ3.1の間に生成したCSVデータファイルから関連する行を削除します。
4. 周囲温度を測定します。
   1. スプレッドシートにコンピュータと輸出に温度ロガーからデータ（時間とロガー温度）をダウンロードしてください。
   2. 熱画像から周囲温度を取得するには、熱画像解析ソフトウェアで温度ロガープローブをカバー黒絶縁テープの上に四角形を描画し、右の正方形をクリックして選択し、正方形の平均気温のための「新しいプロットを追加します」。
   3. 次に、右のCSVファイルにデータ（時間とIRT温度）をエクスポートし、そのプロットをクリックします。 1スプレッドシートに時間温度ロガーと熱画像マッチングのための2つの結果の温度時系列をマージします。
5. 正しい目領域temperatu周囲温度に対する再。時間のために一致するCSVファイルにステップ3.4で作成したスプレッドシートをエクスポートします。同時に測定 - 各保持目領域の温度に温度ロガーと熱画像に由来する温度値（IRT温度ロガー温度）との差を追加します。
6. 自動的にデータで最も高い（したがって、最も正確な）点を抽出するために、ピークサーチアルゴリズム（補足コードファイルを参照）を使用して、より精度の低い低目領域の温度値を削除するには、自動化されたフィルタリングを行ってください。
   注：ピーク検索アルゴリズムは、ユーザ定義された幅（スパン）を有するベクター中に温度データを再編成し、推奨スパン= 3を、数字のいずれかの側、すなわち、下側である場合、行のピークを中央値を抽出します。
7. ピークが抽出されなかったときの配列によって左のギャップを閉じるために線形補間を使用し、目領域が見えなかったとき。コマンドna.approxを使用します（動物園パッケージv1.7-11 R ^27）は、各個体について毎秒単一の温度値を得ました。
8. CVSデータファイルに、メッシュを通して画像を撮影する効果を補正するために、それぞれの目領域の温度に0.2の値を追加します。
   注：試験は加熱黒体は、その活性相^28〜41ºCの鳥の体温を意味近似するときに撮影セットアップで使用されるように、同一のメッシュサイズを有するメッシュ窓を通してによって記録された温度に撮像されたことを示しましたワイヤで隠されていない領域における赤外線カメラは、介在メッシュ（0.085±SD違いを意味する= -0.2ºC、nは黒体の= 30、温度範囲= 41.6から42.5ºC）することなく、得られた値よりも0.2ºC低かったです。
   注：これは、この研究の状況に特有の補正係数であり、楽器作り、型および動物とカメラの間のメッシュの幅に応じて変化する可能性があり、かつそれぞれの状況において、SPのために確立される必要がありますecific研究条件。
9. 箱の前から記録された最大の目領域の温度から邪魔されずに鳥のベースライン目領域の温度を構成する最高値を、選択し閉鎖されました。 CVSファイル（ベースライン）に新しいカラムとしてこのベースライン目領域の温度を追加します。次にそれぞれからのベースライン値を減算CVSデータファイルの新しい列を生成し、最大の目領域の温度値を保持します。
   注：この新しい値は現在、乱されていないベースライン温度からの偏差として軽度の急性ストレスに鳥の応答を発現します。
10. トラップはコマンドggplot（R ²⁷パッケージggplot2 v1.0.0デベロッパー）を使用して閉じた後から全個体のベースライン目領域の温度からの最大の目領域の温度の偏差をプロットします。オプションmean_cl_boot（R ²⁷パッケージggplot2 v1.0.0デベロッパー）を使用して、ブートストラップの95％信頼区間を生成します。詳細は補足コードファイルを参照してください。

結果

9自由生活青おっぱいの結果は、熱画像から得て、鳥の目領域の温度における応力の予測信号が放し飼いの動物で検出できることを実証できる情報を説明が提示されています。各鳥が箱の前に5.1±0.9秒（N = 9）の平均のために撮影された「ドアが閉じられました。これは、すべての後続措置と呼ぶことができた平静な俯瞰領域の温度（基準温度）の計算を可能にしました。トラップ内に到着し、給乱されていない青おっぱいの20秒熱ビデオクリップに実施された試験（N =軽度のストレッサーの用途に使用されるものとは異なる9羽）において、R> 0.7の相関が最大との間に存在することが判明しました目領域の温度は、最初の5秒の間に記録され、最大値は最初の10、15および20秒（ 図3）に記録されます。これは、最大VAことを示していると解釈されましたトラップエントリの後、最初の数秒で記録されたLUEは、より長期的なレベルの代表的なものであった、とすぐに箱の閉鎖の前に約5秒の間の平均の目領域の温度は、ベースライン値として使用しました。このサンプルの青おっぱいは38.4±0.5℃（平均±SE）の平均ベースライン目領域の温度を有しており、35.8から39.9°Cの範囲であった（N = 9）。鳥は、ベースライン目領域の温度の計算を可能にするために5秒間供給されると、ボックスのドアは、実験者によって閉じられました。すべての鳥は彼らの試みエスケープ便によって証明されるように箱の閉鎖に気づきました。

トラップの閉鎖時に、目領域の温度が急激に低下し、約10秒（ 図4）の後にベースライン温度以下の最小目領域の温度〜1.3℃に達した。4は最大eye-に基づいて、複合曲線を示しています9つすべての個人の領域温度は、毎秒の平均。としてタイミングおよび目領域温度降下の大きさは、個人の複合曲線マスク温度応答の真の範囲との間で変化します。各個人について計算した平均温度低下は、別途2.0±0.2℃、最低点は9.4±2.8秒（平均±SE）の後に到達します。その時から、目領域の温度は徐々に次の2〜3分かけてベースライン目領域の温度に向かって戻ったが、非常に裁判の終わりまでにベースラインに達しありませんでした。

図1.撮影の舞台。フィールドのセットアップは、供給ボックスを使用して、軽度の急性ストレッサーを適用することができるカメラの視野に鳥を誘致するために設計されました。セットアップは、開口SIZと亜鉛メッキワイヤーメッシュのフロントパネルで、合板から構築された25 14によりセンチ16.5センチの高さのボックスから構成され1 2.5によるCMの電子。メッシュは、それが可能なセット・アップ内部ながら鳥を撮影すること、赤外線を通過させます。ワイヤーメッシュはガラスのように、選択されたほとんどのプラスチックは赤外線を送信することはありません。直径60mmの穴がセットアップに入る鳥を可能にし、ボックスの右端に配置された食品にアクセスするために、左端壁に切断しました。 （黒い矢印でマーク）黒色絶縁テープの2つの正方形の間に挟まれた温度ロガープローブを基準温度を記録するために、フロントパネルの右上隅に取り付けられています。軽度の急性のストレッサーは、箱を閉じることにより、鳥の内側に塗布されます。エントランスホールで回転ドアに取り付けられた釣り糸を引っ張ると鳥が内部の場合に実験者がボックスを閉じることができました。トラップの前に設定された赤外線カメラは、イベントの全配列を記録します。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図F。

ブルーティットの図2.熱画像。スズメ目の体の大部分は十分に（または足のスケールによって、より少ない程度に）羽毛で絶縁されていますが、目の周りの皮膚を露出し、通常の状況下で最も熱を放射し、ですクーラー外皮や背景に囲まれています。これは、目の周りの黄色（最高温度）することで、この熱画像に表示され、オレンジ、赤、紫、青の色はクーラーと低い温度を意味している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

oを測定し、ベースライン温度の図3. Repeatabilities時間の版異なる期間。クリップの最初の1-8秒との最初の10、15、20秒間記録された最高値の0.5º '内の最大値の平均値」に記録された最大温度との相関係数クリップ（それぞれ、赤、青、緑の線で表されます）。すべてのクリップは、期間中に20秒であった（N = 9）。大きなデータセットを使用して初期分析の間、「最大値の意味」の数は、わずか1値から計算し、全ての比較全体のローに同じ値を与えました。これらのクリップは、唯一の手段は、3つ以上の測定値から算出したところ、それらを残して、分析から除外した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4.レスポンストラップに目領域の温度の。トラップイベントの非常に明確かつ顕著な信号が時間をかけて、目領域の温度の変化に反映しています。それらのベースライン温度は、残留目領域の温度が変化した個体を横切って比較するために、実際の温度とその個体のベースライン温度の差として、縦軸上にプロットされています。これが0に設定され、トラップの閉鎖と3分後に、トラップから除去鳥で時間に対してプロットされています。赤い線は、平均残留温度を示し、灰色のバンドは95％信頼区間を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

本稿の目的は、急性ストレッサーに応じて自由に生きている動物の皮膚温度の変化を測定するために必要な方法論を記述することです。この研究では、野生の鳥類における急性ストレス応答に関連する皮膚の温度の急激な変化は、IRTを用いて非侵襲的に捕捉することができることを実証しました。この手順では、5つの重要な段階適切なフィールドセットアップ携帯性に優れた熱画像システムを使用して、ベースライン温度の（2）測定、セットアップで鳥を捕獲伴う軽度のストレッサーの（3）アプリケーションの（1）設計を、関与しました（4） ポストホック目領域の温度と抽出温度データ（5）校正のサンプリング自動。ここで説明する方法は、野生のブルーおっぱいの捕獲に適用しました。代表的ベースライン目領域の温度はわずか5秒でキャプチャすることができます。フィールドに1鳥を記録するのに必要な時間（推定）を処理するために必要な更なる時間で、約1時間でした3分間の熱映像シーケンス。

動物の皮膚温度で良好なデータを収集すると、高品質の熱画像を必要とします。赤外線カメラは、彼らだけが検出電磁放射の波長の観点から可視光カメラとは根本的に異なり、写真に適用された概念のこうして多くの（例えば、ビュー、被写界深度のフィールド）は、サーモグラフィに適用されます。一般的動物訪問予想通り、天然（例えば、巣サイト）または人工（例えば、フィーダ）は、熱画像を収集するために使用することができる任意の場所、野生生物の写真家によって実践。カメラに動物を誘致ではなく、彼らの生息地は、私たちは、すぐに動物が見えてくるように最小限の妨害で高品質の画像を収集するために、事前にカメラを設定することを可能にするという利点を有しているものの、それらに従うことを試みます。しかし、このアプローチでは、の影響を調べたり、アカウントに不可欠ですストレスや皮膚温度の測定の具体的な状況。例えば、ここでは、鳥は送りコンテキストで測定し、食品を積極的にセット・アップに青色のおっぱいを誘惑するために使用されました。鶏の研究は、低目の温度²⁹も連想学習試験において、食品の報酬の期待と消費としてその急性肯定的な経験を、することができますを示唆しています。このように、この特定のセットを入力する個人の「ベースラインレベル」は報酬とこの行為の結合によって影響を受ける可能性があります。存在する場合、ベースラインレベルからのドロップ既に観察を強化することが期待されるが、これの可能性は、さらなる調査を保証します。また、熱発生は、ベースライン測定中に消費される食物の具体的な効果は大きく3分のトラップ期間³⁰内の温度を上昇することが期待されていないものの、食物の消化で発生します。

この制限は、とのすべての動物を測定し、考え同じコンテキストでもこのアプローチの大きな強みです。代表的な結果は、急性ストレッサーが適用される前（ベースライン目領域の温度）個体間の目領域の温度に大きな変化があったことを示しました。ベースライン目の温度（変動係数= 3.9％）の変化が一因測定誤差の間、または、個人差の真の反射である可能性があります。期間はIRTカメラがテープの温度が変化しなかった5秒かけて黒い絶縁テープの温度を記録し、平均変動係数は0.26パーセントは、（レンジ0.59パーセントに0.08％）でした。測定誤差が移動鳥が大きくなる可能性があるが、それにもかかわらず、ベースライン目領域の温度におけるこの変化のほとんどは、個体間で実際にあることを示しています。移動鳥類に比較的小さな測定誤差の概念は、さらに、（ベースライン測定の間に20秒間にわたって眼領域の温度の高い再現性により支持されています図3）。コンテキストに制御することにより、我々は、すべての鳥が同じ活動に従事されたことを確認することができます。我々はまた、例えば、局所性は、熱画像形成のために、動物の表面温度の過大評価をもたらす交絡入射放射線から保護されることを確実にすることによって、皮膚温度の間で、個人差の測定時の環境への寄与を最小にすることができます。これは、日陰でまたは赤外波長をブロックする最も透明プラスチックを含む戦略的に配置された色合いで作業を行うことができます。ここで紹介するプロトコルは、簡単に青色のおっぱいを越冬の状況に適用することができる簡単なセットアップを示しています。青シジュウカラは、直射日光への曝露を避ける固体屋根の供給ボックスにある間に撮影されました。このセットアップはまた、定期的に、今年の特定の時間に人工フィーダに来て、他の多くのスズメ目に適用される可能性があります。青色巨乳が比較的小さな動物であるので、それら詳細の良好なレベルを捕捉するためのクローズアップを撮影する必要があります。実際の距離と倍率の面で両方 - - 写真、カメラ、被写体に近づいと同じように劇的に、フィールドの深さを低減します。視野内のできるだけ大きな鳥を持ってするには、このケースでは500ミリメートルであり、40ミリメートルに被写界深度を減少カメラの最小焦点距離、からそれらを撮影必要。そのため、撮影セットアップのすべての機能が使用される特定のカメラの鋭い焦点の比較的狭い領域内で自分の頭を表示するために動物を奨励するように設計する必要があります。

動物によく確立された急性軽度のストレッサーに対する応答では、皮膚温度^{17を減少させる}交感神経媒介血管収縮を経て周囲からコアへの血流のパターンの急激な変化を期待しました。これは非絶縁た体の領域のみを提供し、ASSOあるとして眼窩領域が選ばれました小血管の豊富な混ざりネットワーク、目³¹からの熱損失に影響を与える可能性乳頭間ophthalmicumでciated。熱videoing技術の高速フレームレートが3分以内にベースラインの0.5℃以内に温度のその後の上昇が続く10秒で約2℃の目領域の温度の低下を示すことができました。軽度のストレスに応答して周辺の冷却は、約1分間隔で以前に^{17,26、32が記録}されているが、ここでの技術は、温度の最大低下が非常に迅速であり得ることを示しました。低い時間分解能でこの効果の大きさは、見逃されてもよいです。異なる個体のストレス応答の差異を比較した場合、これは重要であり得ます。鳥の再温暖化鳥は鳥が生理学的ストレスに残っていることを示すボックス内に留まったとして急速な「戦いまたは飛行」応答は、ベースラインレベルに戻らなかった後。鳥がリリースしました約 3分の任意に選択されたカットオフ点後の実験設定からdは自由生きている動物の拘束期間を最小限に抑えることができます。しかし、将来的には、試験では、ロジスティックに可能であれば、動物の目領域の温度は、ベースラインレベルに戻るまで、完全な温度応答を記録するために長くする必要があるかもしれません。

前とストレッサーが現在適用された後に回収した一連の画像を含むこの新しいプロトコルは、詳細な急性ストレスへの応答のダイナミックの研究、および個々の動物間の複数の時点の比較を可能にします。異なる季節や環境条件以上の個人内でこの試験を繰り返すこと、ベースラインまたはポスト急性ストレス皮膚温度の環境の影響も同様に慢性的なストレスの評価に可能な道として、ほぐされることを可能にします。 。

鳥の皮膚温度は、代謝熱産生のみならず依存しており、血流だけでなく、日射、風速及び湿潤²⁵から熱交換に。これは、正確なサーモグラフィ記録からウェットと風の強い条件を排除します。赤外線カメラによって記録された目領域の温度は、時間のいずれかでは、（負のエラー）または過大評価（正の誤差）を過小評価することができます。実質的な正の誤差は、エネルギー入力を必要とするが、これは太陽からシールドされている供給ボックス内の鳥によって回避されました。鳥が点滅するとき正の誤差のもう一つのソースが含まれています。時折鳥は簡単に目領域にわたってその瞬膜を引き出し、それが体コアのそれに近い温度で内部に格納されているように、それは眼球をカバーしていたとき、点滅が異常に高い温度測定値を提供します。これは、しかし、それは非常に顕著な署名を残し、影響を受けたフレームを除去することができるように、容易に検出されます。私たちの記録で負の誤差の主な理由は、モーションブラーました。 SHARを捕獲するにはあまりにも迅速あらゆる動きカメラのフレームレートによってプライは、目領域温度の過小評価で、その結果、周囲の涼しい場所（モーションブラー）のものと、画像の小さな温かい目領域から取得されたデータを混乱させる。このように正の誤差を除去した後、これが最も正確な測定、目領域から測定された最高温度を行い、ピーク機能コマンドを使用して、自動化されたフィルタリングが最大の目領域の温度にくい低い値を削除します。

赤外線放射が水蒸気に​​吸収されるように加えて、記録された表面温度は、環境の相対湿度に影響されます。これは、分析熱画像解析ソフトウェアにobjectに気温、相対湿度と距離を入力することによって説明することができます。しかし、より正確で効率的なアプローチは、（ここで行ったように）視野内に既知の温度と放射率の基準体を含むことがあります。我々の場合では、これはありました自然の外皮³³のそれとほぼ同等である0.97の放射率を持つ黒の絶縁テープの二乗。これは、絶縁テープのために測定された実際のおよび熱画像誘導温度値の差を用いて、目領域の温度を校正することができます。黒体の表面温度は、測定期間中連続的に画像を較正するために使用することができます。

彼らは今、長期間にわたって毎秒フレーム数を収集することができ小型軽量カメラとして展開することができ、熱カメラで開発中の技術の進歩に感謝します。熱画像は、鳥類の研究²⁵で広く使用される技術であるが、大きさと熱画像システムの費用は、野生での使用が制限されています。本研究では、システムは、携帯性に優れた約かかります。 £6,000と非侵襲的に正確なTEを捕捉することができる提供される高解像度サーマルビデオ鳥の取り扱いを必要とせずに自由に生きている動物からmperatureデータ。毎秒複数のフレームで記録すると、周辺温度の高解像度の時系列の測定を可能にするため、急性ストレス反応のダイナミックを探求する可能性を提供します。これは、時間の期間内に取り込むことができるサンプルの数によって制約される従来のグルココルチコイドサンプルでは達成することは困難です。ここでは、急性ストレッサー（キャプチャ）に目領域の温度応答性を示すのに十分であった1秒の間隔で目領域の温度の時系列を抽出したが、より高い時間分解能も可能であろう。多数の画像の蓄積が、しかし、画像からの情報の抽出における自動化のいくつかのレベルを必要とします。プロトコルは、各画像から最高温度を抽出する簡単な半自動化方法が記載されています。私たちは、目レジオ関心領域としてこれを行うことができましたnは、常に画像で暖かい場所でした。関心領域は、より複雑で、カスタム設計されたパターン認識ソフトウェア（例えば^、34）を必要とする可能性があれば分析がより問題である可能性があります。本研究ではいくつかの手動のフィルタリングは、目領域温度が過剰または過小推定が、これらは容易に検出されたた状況で必要とされたが、もちろん、さらに自動化が望まれています。熱イメージングによるストレス誘導周辺冷却の測定は、ストレスとこの技術の非侵襲的な態様の他の生理学的措置に貴重な追加はキャプティブと野生動物を含むさらなる研究のために非常に有利である提供しています。

完全なストレス応答をキャプチャ、赤外線サーモグラフィは明らかにストレス評価のためのツールと​​して大きな可能性を秘めています。しかし確立ホルモンとコア温度アッセイの非侵襲的な代替手段になるためには、これらの施策の中で、クロス検証する必要がありますし、皮膚温度は、ストレッサーの強度と同じ比例関係を示しているかどうかを決定する、 すなわち、皮膚温度応答の程度は、ストレッサーの強さを反映することができます。今後の研究はまた、皮膚温度が慢性的なストレスをキャプチャするかどうかに対処する必要があります。急性ストレッサーに応答して、SIHが一過性であることが期待される一方で、物理的または心理的な急性のストレス要因への再発性の暴露は、コア体温^35,36の慢性上昇を生成することができます。現在進行中の血管収縮は、このコアの上昇に寄与するかどうかは明示的にテストされていません。しかし、慢性的なストレス関連疾患に罹患している人間の相関研究は減少し、指の温度^{37を示して}ください。負の事象から正区別する能力：探索する最終的な属性は、原子価です。ホルモンアッセイは、具体的には、励起のレベルではなく、ストレスを反映して表示されるグルココルチコイドレベルで、原子価^{5を区別することはできません} 。櫛気性に関する研究嫌悪と正の刺激にさらさ国内ニワトリのatureは、皮膚温度は、一般的な覚醒^22,29と同様に似たかもしれ示唆しています。 ^{38を驚かせ}たが、全体的に^39を笑ったときに皮膚温度を低下させたときしかし、ヒトでは、異なった感情の状態は、例えば、皮膚温度の地域の特定の変化、眼窩周囲温暖化や頬の冷却を誘発します。異なる地域間の比較は、まだ感情の状態を明らかにすることができます。本論文でレイアウトされた勧告を使用して、それは、これらの問題のすべてに対処し、ストレスの非侵襲的マーカーとして皮膚温度を確認することが可能となります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
熱画像カメラ	FLIR	A65(f = 25 mm)	コンパクト(106 x 40 x 43 mm)および低コスト
熱画像分析ソフトウェア	FLIR	ResearchIR v3.4	高速熱ビデオ録画と熱パターン分析を可能にします
温度ロガーGemini	データロガーTinytag	Talk 2 TK-4023-PK	-40から+125 °までモニターします。付属の温度プローブを使用したC

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