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1.神経文化
注：線維芽細胞の多能性幹細胞におけるリプログラミング、背側終脳の系統へのコミットメント、導出、増幅、及び後期皮質前駆細胞（LCP）の銀行がBoissart ら 4で説明しました。 LCP様細胞の神経分化はまた、わずかな修正を加えたBoissart ら 4に従って行きました。他の手順は、ニューロンへの分化に続いて誘導多能性幹細胞への線維芽細胞の直接再プログラミングのために開発されています。それはピラミッド型グルタミン酸作動性ニューロンの選択的な製造を可能にするため、このプロトコルを保持しました。
- ポリオルニチン（DPBSで1/6に希釈し、原液濃度0.01％）、DPBSで3回洗浄し、O / Nでカバーガラスを6ウェル培養プレートを扱います。その後流フードの下で少なくとも10時間（ストック濃度1mg / mlの、DPBS中で500倍に希釈）ラミニンを追加 。
- DMEM / F12からなる培地3mlの（500 ml）を、N2サプリメントの2バイアル（各5ml）中のガラスカバースリップで6ウェル培養プレート（50,000細胞/ cm 2）低密度でNSCをプレートし、派遣、 B27サプリメントの2バイアル（各10ml）、ペン - ストレプトマイシン（ペニシリン= mlおよびストレプトマイシン= 10,000単位/ mlの10,000単位/）、2-メルカプトエタノール（ストック液：50 mM）の1mlを10ミリリットルとラミニン（1 / 500）、成長因子を含みません。重要なステップ：細胞クラスタリングを減少させるためにゆっくり回転運動を細胞に添加することによって慎重にこの工程を行います。
- 培地を除去します。カバーガラスに付着した神経細胞を維持し、凝集を回避するために、新鮮なラミニン溶液を2μg/ mlを含む新鮮なN2B27培地を追加します。 3日ごとに培地を変更します。乾燥から細胞を防ぐために、新鮮な培地を添加する前に、残りの培地（200μL）の一部を保管してください。また、急速に進行し、全体積（3ml）に変更します。
e_title "> 2。レンチウイルス形質導入
注意：GFPレンチウイルスベクターは、親切にパスツール研究所（パリ）で博士ウーヴェMaskos研究所によって提供され、公表されたプロトコール5に従って調製しました。 GFP発現は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターにより駆動されます。この研究では、ウイルス力価は、400 ngの/μL（PBS 1Xで原液）でした。
- 文化ごとのGFPレンチウイルスベクターウェル（6ウェルプレート）の40 ngのを含むストック溶液1μlを追加することにより、ウイルス粒子による成熟のいずれかの段階で人間のiPS細胞由来の神経細胞を形質導入し、新鮮な培養培地中で48時間インキュベートします。注：このプロトコルでは、インキュベーションの期間は、脊椎構造の良好なラベル付けを可能にします。
3.免疫蛍光
注：全脊椎の形態の標識化を改善するために、免疫蛍光標識は、透過処理条件下で、抗GFP抗体を用いて行きました。
- 培養培地を除去し、室温で10分間、4％パラホルムアルデヒド中でカバーガラス上で形質導入した細胞を固定し、その後、1×PBS中で（10分毎）で3回洗浄します。
- PBS中で飛び込むのカバーガラスが0.05％トリトン（100倍）し、室温で1時間、10％ウマ血清を補充し、その後、1×PBS中で3回洗浄します。
- 1×100μlのPBSを加え、GFPに対して惹起され、各カバースリップ上で1000倍に希釈（1 /千）4％ウマ血清及び一次抗体を補いました。暗箱Oでインキュベート/ N 4℃で、次いで1×PBSで3回洗浄します。
- PBS中でアレクサフルオロ488結合抗体（1/200）を希釈のTween 20の0.5％を補充し、室温で1時間インキュベートします。その後、1×PBS中で3回洗浄し、蛍光顕微鏡用のメディアをマウントして、スライドガラス上にカバースリップをマウントします。
4.樹状突起棘イメージング
- 共焦点レーザー走査顕微鏡で共焦点イメージングを実行します。
- ピラミッド型の形態Aとの健全なニューロンを選択NDフル樹状樹枝状分岐し、別々の実験からの条件当たり少なくとも10のニューロンを定量化します。デンドライトあたり100ミクロン - 60を定量化します。
- 目的とGFPの励起のための488nmレーザーライン、20μWの周りのサンプルレベルでの典型的なピークパワーで40X油NA = 1.3を使用して画像を取得します。 80nmの周りにピクセルサイズが適切に樹状突起棘をサンプリングします。
注意：ノイズは樹状突起と棘の適切なセグメント化を妥協しないで画像の後続の解析コールを。前述の空間サンプリングおよび電力設定では、我々は3.15マイクロ秒の画素滞留時間は、そのようなイメージを構築するのに十分な光子を収集するのに十分であることを観察しました。薄暗いサンプルについては、画質が2〜4のスキャンを平均することによって改善することができます。いくつかのXYタイルの獲得は、処理の前に縫合しなければならない関心領域をカバーするために必要とされ得ます。 - に、Zスタックを取得し、全ニューロンの量を試料にZは20〜30のZスライスを得、150ナノメートルから300ナノメートルの範囲でスペーシング。
注：これらの設定で達成横方向の空間分解能は234 nmであると軸方向分解能は591 nmです。ここで選択されたサンプリングは十分であるが、軸方向の解像度が画像化される脊柱の最小サイズよりも大きいように、分析は、樹状突起から側方に延びて棘を好みます。
樹状突起棘の5 3D定量
注：以下のセクションでは、具体的には、分析のためのIMARISソフトウェアの使用を記載しています。代替の実装では、同様の結果を提供することができますNeuronStudio 15またはをMetamorph 8、を含む、存在します。
次のキー設定を使用します。
- 前処理段階として、ソフトウェアが提供する画像処理施設を通じてガウスフィルタを使用。 画像処理> Smoo経由でガウスフィルタ処理を実行します事>ガウスフィルタ。 X-Yの画素サイズに等しくなるように、フィルタの幅を設定します。
- ソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールを使用して、樹状突起の半自動トレースを実行します。
- まず、ソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用することにより、樹状突起の直径を推定します。
- サーパスタブで、 フィラメントのツールをクリックしてください。優れた堅牢性のために、このプロトコルは、半自動追跡に依存しています。 スキップ自動作成をクリックしてください。モジュールインターフェイスは現在、 描画]タブを示しています。ここでは、タイプ、および入力の方法、 デンドライトと推定デンドライト直径てAutoPathを選択します。
- ボックスにカーソルを回し、ポインタの選択モードを使用します。樹状突起の出発点に、Shiftキーを押しながら右クリックします。注：このソフトウェアは、最初の計算を実行します。
- 樹状突起に沿ってポインタを移動します。出発点から（表します青い球のようにED）、最も可能性の高い樹状突起のパスを表す黄色の線が示されています。樹状突起のエンドポイントで、Shiftキーを押しながら左クリックします。
- 自動化された棘のセグメンテーションを行います。注：トレース樹状突起上の棘は、モジュールインタフェースによって自動的に発見されることになります。
- モジュールインターフェイスでは、 作成タブをクリックします。 リビルドドロップダウンリストでは、 デンドライトの直径を再構築し、キープデータ ]チェックボックスをオンに選びます。 [再構築]をクリックします。
- セグメント化されたボリュームは実際の樹状突起のボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして 、 距離マップからの最短距離を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。
- 最小の背骨の頭の直径と最大長を決定し、再びソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用して、その後突破タブに戻ってくるとパラメータを入力します。 Fあるいはこのプロトコルは、200の周り値 - 最小の直径が300nmであり、最大長さ4μmのは良い出発点です。 許可支店棘ボックスをチェックしないでください。 [次へ]ボタンをクリックします。
- 棘を表す青色の点は、実際の背骨の頭に局在するように、 シード点のしきい値を調整します。 [次へ]ボタンをクリックします。注：コアの計算は、現在行われていると長くなる可能性があります。
- モジュールインターフェイスの[ツール]タブに移動して、棘を分類します。 分類棘をクリックします。プロンプトが表示され、ユーザインタフェースでは、次のようにその形態によって定義された4つのクラスが存在することを確認してください：スタビー：長さ<1μmで、キノコ：長さ（背骨）> 3、最大幅（ヘッド）>（首）の幅を意味する×2。ロング薄い：平均幅（ヘッド）≥平均幅（首）;糸状仮足のような：長さ≤4ミクロン（無頭）。
注：MOduleインターフェースは、分類の結果を含む4新しいフィラメントのオブジェクトを生成します。 - エクスポート統計データ：これらの4オブジェクトインタフェースのいずれかで、[統計]タブに移動します。
ボタンをファイルにエクスポートすべての統計情報をクリックします。
注意：他の統計値は、樹状突起のためにエクスポートすることができます（ 例えば 、長さ、面積、角度、ボリュームを分岐、直径、枝の深さを意味する、 など 。）、および棘のために（明確なの例えば、真直度、添付ファイルの面積、長さとボリューム脊椎部、脊椎直径、密度、 など 。）