ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

サマリー

このプロトコルは、ゼラチンでコーティングされた皿にヒト胎盤由来の馴化培地のみを使用して、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を増殖させる簡単で効率的な方法を提供します。追加の外因性サプリメントやhPSC特異的な合成基質はありません。

要約

フィーダーフリー培養条件でヒト細胞に由来する馴化培地でのヒト多能性幹細胞（hPSC）の増殖は興味深いものでした。それにもかかわらず、hPSCの理想的なヒト化ex vivoフィーダーフリー増殖法は開発されていません。現在、すべての培地には、hPSCのマスター維持因子である塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む外因性基質が添加され、マトリゲルやラミニンなどの合成基質がすべてのフィーダーフリー培養に使用されています。最近、私たちのグループは、ヒト胎盤に由来するコンディショニング培地のみをゼラチンコーティング皿上で使用し、追加の外因性サプリメントやhPSCに特異的な合成基質を使用せずに、hPSCを増殖するためのシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。このプロトコルはこれまでに報告されておらず、研究者がヒト化培養条件でhPSCを効率的に増殖させることができる可能性があります。さらに、このモデルは、ウイルスや未知のタンパク質などの動物性食品によるhPSC汚染リスクを回避します。さらに、このシステムにより、ゼラチンコーティングによるhPSCの量産が容易になり、取り扱いが容易なため、ex vivo hPSCの維持にかかるコストを大幅に削減することができます。

概要

このプロトコルの目標は、ヒト胚性幹細胞（hESCs）およびヒト人工多能性幹細胞））を含むヒト多能性幹細胞）を、追加の外因性サプリメントおよび合成基質を必要とせずに、完全にヒト化されたex vivoフィーダーフリーの状態で増殖させることです。これまで、幹細胞研究においては、培養製品を臨床に導入するためのex vivo hPSC培養モデルの開発が大きな課題となっていました。具体的には、2つの重大な問題に対処する必要があります。まず、動物細胞製品による汚染のリスクを排除したhPSCの増殖のためのヒト化ex vivo培養システムが必要です。第二に、hPSCの容易で経済的な大量生産を促進するためには、フィーダーフリー培養モデルが必要です。hPSCの治療応用のためには、その自己複製と分化を制御する因子を特定する必要があります。

Xuらが最初にマウス胚性線維芽細胞(MEF)由来のコンディショニング培地(CM)を使用してマトリゲル¹上でhESCを成長させることの実現可能性を報告して以来、多くの研究がhPSC2-4の最適なex vivo増殖方法を検討してきました。しかし、現在の方法では、hPSC維持因子としてよく知られているbFGFやインスリンなどの外因性基質を培地^5-7に追加する必要があるため、理想的なヒト化ex vivo

プロトコル

倫理文：ヒト胎盤研究は、高麗大学（AN09085-001）の人間の研究のための施設内倫理委員会の承認を得て、将来に向かって行きました。すべての実験は、高麗大学医療センターのクリーン無菌室の施設で行われました。 hPSCsを用いた実験の設計および手順は高麗大学医療センターの施設内倫理委員会（AN12277-003）によって承認されました。

楽器、文化メディア、および料理の作製

1. 0.1％ゼラチンでコーティングすべての培養皿。オートクレーブリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と鉗子。手術用はさみ、微量遠心管、および15分以上のための15ポンドのPSIの下で121℃でガーゼを滅菌します。
2. 20％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100グラム/ mlを含む調製予め温めた0.25％トリプシン - エチレンアミン四酢酸（トリプシンEDTA）及び予熱濾過培地（DMEM） streptomyc手順を開始する前に。

ヒト胎盤から2細胞の単離

1. 書面によるインフォームドコンセントを得た後、妊娠7-32週で正常または治療的流産を受けた健康な妊婦から、帝王切開の出産後、胎盤組織を取得します。
2. 胎盤から産科専門外科の別々のヒト胎盤絨毛プレート（HPCの）を持っています。 37℃で20分間、0.25％トリプシン-EDTAでこれらをインキュベートし、次....

結果

このHPSC伝搬法の1つの利点は、ヒト細胞から分泌されたコンポーネントを使用することです。プロトコルの中で最もciriticalステップは、ヒト胎盤由来細胞の単離および培養です。これは、HPC板絨毛の正確な部分から必要とし、正確な解剖。 図1は、ヒト胎盤由来細胞を単離するための手順を示しています。このプロセスは、細胞の単離のための簡単​​で便利であり、かつ容易に1時間以内に行うことができます。 図2で説明したように、ゼラチンコートディッシュおよび線維芽細胞様細胞に付着した組織を確実に発芽しました。トリプシン処理により継代中に破片や腐った組織の除去は、細胞の選択を可能にし、均質な文化を保証します。これらの細胞は、汚染がないことを確認した後のHPSCの増殖のための馴化培地を産生するために使用することができます。最適条件は、その目の後、細胞は80から85までパーセントの集密度まで増殖させたものとして定義しました。E成長は人為的（データは示さず）を停止させました。

フィーダー細胞または合成マトリックス上で培養hPSCsはh.......

ディスカッション

ヒト微小環境にhPSCsの操作を可能にする、などのbFGFまたはインスリンなどの外因性組換え増殖因子を添加することなくヒトフィーダーを含まない培養条件で、その特性を維持しながら、このモデルは、正常hPSCsを伝播するために開発されました。外因性のbFGF補充が一般的であり、そのようなマトリゲルまたはラミニンなどの基層の適用はhPSCs ¹⁴の無フィーダー培養のために不可欠です。

このプロトコルは、単純で実装が容易です。しかし、いくつかのステップは、その成功に不可欠です。最も重要なステップは、胎盤からの絨毛膜細胞の無菌単離であります。胎盤の収集方法により、例えば、マイコプラズマなどの病原体の汚染リスクが高いです。したがって、細胞の単離の間の病原体検査と管理が非常に重要です。さらに、すべての手順は、無菌的に実行する必要があります。 conditioneのコレクションヒト胎盤細胞の培養物からDのメディアは、一般的に容易です。その扱いがやや困難であるため、しかし、HPSC培養の経験が必要とされています。もう一つの重要な点として、このプロトコルを使用して、研究者があるこ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイトマイシン-C	シグマ-アルドリッチコーポレーション	M4287	10 μg/ml
マイコプラズマ検出キット	TaKaRa Bio Inc.	#6601
マトリゲル	BDバイオサイエンス	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
ディスパーゼ	ワージントン バイオケミカル コーポレーション	LS02100	1 mg/ml
ゼラチン	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-サイクリン	ロシュ	799 050	10 μg/ml
RNeasyミニキット	Qiagen	74104
ナノドロップ分光光度計	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON バイオテクノロジー	25011
QIAamp®DNAマイクロキット	Qiagen	56304
AmpF/STR®Identifiler®PCR増幅キット	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	アプライドバイオシステムズ株式会社

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