ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

サマリー

このプロトコルは、ゼラチンでコーティングされた皿にヒト胎盤由来の馴化培地のみを使用して、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を増殖させる簡単で効率的な方法を提供します。追加の外因性サプリメントやhPSC特異的な合成基質はありません。

要約

フィーダーフリー培養条件でヒト細胞に由来する馴化培地でのヒト多能性幹細胞（hPSC）の増殖は興味深いものでした。それにもかかわらず、hPSCの理想的なヒト化ex vivoフィーダーフリー増殖法は開発されていません。現在、すべての培地には、hPSCのマスター維持因子である塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む外因性基質が添加され、マトリゲルやラミニンなどの合成基質がすべてのフィーダーフリー培養に使用されています。最近、私たちのグループは、ヒト胎盤に由来するコンディショニング培地のみをゼラチンコーティング皿上で使用し、追加の外因性サプリメントやhPSCに特異的な合成基質を使用せずに、hPSCを増殖するためのシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。このプロトコルはこれまでに報告されておらず、研究者がヒト化培養条件でhPSCを効率的に増殖させることができる可能性があります。さらに、このモデルは、ウイルスや未知のタンパク質などの動物性食品によるhPSC汚染リスクを回避します。さらに、このシステムにより、ゼラチンコーティングによるhPSCの量産が容易になり、取り扱いが容易なため、ex vivo hPSCの維持にかかるコストを大幅に削減することができます。

概要

このプロトコルの目標は、ヒト胚性幹細胞（hESCs）およびヒト人工多能性幹細胞））を含むヒト多能性幹細胞）を、追加の外因性サプリメントおよび合成基質を必要とせずに、完全にヒト化されたex vivoフィーダーフリーの状態で増殖させることです。これまで、幹細胞研究においては、培養製品を臨床に導入するためのex vivo hPSC培養モデルの開発が大きな課題となっていました。具体的には、2つの重大な問題に対処する必要があります。まず、動物細胞製品による汚染のリスクを排除したhPSCの増殖のためのヒト化ex vivo培養システムが必要です。第二に、hPSCの容易で経済的な大量生産を促進するためには、フィーダーフリー培養モデルが必要です。hPSCの治療応用のためには、その自己複製と分化を制御する因子を特定する必要があります。

Xuらが最初にマウス胚性線維芽細胞(MEF)由来のコンディショニング培地(CM)を使用してマトリゲル¹上でhESCを成長させることの実現可能性を報告して以来、多くの研究がhPSC2-4の最適なex vivo増殖方法を検討してきました。しかし、現在の方法では、hPSC維持因子としてよく知られているbFGFやインスリンなどの外因性基質を培地^5-7に追加する必要があるため、理想的なヒト化ex vivoフィーダーフリーhPSC増殖系は開発されていません。さらに、マトリゲルやラミニンなどの合成基層は、すべてのフィーダーフリー培養で使用されます。

このプロトコルの開発と使用の背後にある理論的根拠は、ヒト胎盤絨毛膜細胞がbFGF補給なしでhPSCの増殖を優にサポートするという私たちの以前の研究に基づいています^8-11。このプロトコルには、取り扱いの容易さや費用対効果など、多くの利点があり、外因性の合成基質を使用せずにhPSCの増殖を可能にするほぼ完璧なヒト化培養です。ヒト胎盤由来CM(hPCCM)のhPSCへの適用には、3つのステップがあります。まず、絨毛膜細胞をヒト胎盤から単離し、培養します。次に、hPCCMは培養細胞から産生されます。第三に、hPCCMを用いてhPSCを培養し、その特性を確認します。

このプロトコルは、hPSCの臨床応用とhPSCの増殖と付着のメカニズムの研究を促進します。この論文では、ゼラチンコーティングされた皿上でhPCCMでhPSCをうまく増殖させるためのプロトコルを紹介します。

プロトコル

倫理文：ヒト胎盤研究は、高麗大学（AN09085-001）の人間の研究のための施設内倫理委員会の承認を得て、将来に向かって行きました。すべての実験は、高麗大学医療センターのクリーン無菌室の施設で行われました。 hPSCsを用いた実験の設計および手順は高麗大学医療センターの施設内倫理委員会（AN12277-003）によって承認されました。

楽器、文化メディア、および料理の作製

1. 0.1％ゼラチンでコーティングすべての培養皿。オートクレーブリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と鉗子。手術用はさみ、微量遠心管、および15分以上のための15ポンドのPSIの下で121℃でガーゼを滅菌します。
2. 20％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100グラム/ mlを含む調製予め温めた0.25％トリプシン - エチレンアミン四酢酸（トリプシンEDTA）及び予熱濾過培地（DMEM） streptomyc手順を開始する前に。

ヒト胎盤から2細胞の単離

1. 書面によるインフォームドコンセントを得た後、妊娠7-32週で正常または治療的流産を受けた健康な妊婦から、帝王切開の出産後、胎盤組織を取得します。
2. 胎盤から産科専門外科の別々のヒト胎盤絨毛プレート（HPCの）を持っています。 37℃で20分間、0.25％トリプシン-EDTAでこれらをインキュベートし、次いで5 mlのPBSで洗浄します。
3. はさみを使用してのHPCから絨毛を隔離。絨毛をミンチし、1ミリリットルPBSでそれらを3回洗浄します。ミンチした後、ピペットチップを使用して、マイクロチューブの中に絨毛を置きます。上下にピペッティングにより500μlのPBSでサンプルを洗浄し、3分間120×gでのためにチューブを遠心します。予め温めた培地500μlので二回組織を洗ってください。
4. 37℃、5％CO ₂でゼラチンコーティングしたプレート上で培地中の培養細胞、および湿度95％の下のサブ。 37°Cで1時間0.1％ゼラチンでプレコートすべてのプレート。線維芽細胞様細胞のコロニーを形成し、約5〜7日、同じ培地で培養を開始した後、付着成長します。
5. 第3通路まで2〜3日ごとに培地を交換します。培養中、培養液中に浮遊する細胞の破片を除去します。成長胎盤線維芽細胞はプレートに取り付けます。文化その後、10 ^{番目の通路}にHPCまでに由来し、線維芽細胞様細胞は、トリプシン処理し、マイトマイシンC（10 / mlの）治療後のhESC培養物のためにそれらを収穫します。
6. ストックサンプルとしてのHPCを凍結する前に、のHPCは、通常（M.·ファー、M.のヒオリニス、M.アルギニン、Mがマイコプラズマを含む胎盤、感染性病原体に汚染されていないことを確認するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用し。orale、M.のsalivarium、M.ホミニス、M.プルモニス、M.のarthritidis、M.のneurolyticum、M。ハイオニューモニエ、とM.カプリコラム ）および細菌種、 ウレアプラズマリティクム 、マイコプラズマ検出キットを使用します。
   1. RT-PCRを実行するための製造元の指示に従って、キットで提供されるすべてのプライマーとの混合物を使用しています。マイコプラズマ検出のための36日間培養された細胞の上清を使用してください。 PCR混合物にこれらのサンプルの3μlを添加して、35サイクルの1 ^回目のPCR手順を実行し、30秒間、94℃から成るそれぞれ、55℃で2分間、および72℃で1分間。
   2. 慎重にPCR混合物に1 ^回目のPCR産物を0.5μlを添加し、前と同じ条件を用いて、30サイクルの2 ^回目のPCR手順を実行します。 1％アガロースゲル電気泳動により増幅産物を分析します。ゲルに^第 1および^第 2 ^回目のPCR産物の各10μlのを適用します。
7. のHPCは、病原体に汚染されることがわかっている場合は、これらを排除します製造者の指示に従って、抗生物質（BM-サイクリン）の組み合わせを使用して。 3日間BM-サイクリン110μg/ mlを含む新しい培地を追加し、さらに4日間5μg/ mlのBM-サイクリン2で細胞を処理します。 2回のサイクルを繰り返してから、再度マイコプラズマ汚染を確認してください。

ミディアム馴化3.収穫ヒト胎盤由来細胞（hPCCM）

1. 汚染を除外した後、付着した細胞（85〜90％コンフルエンス治療; 2時間30分間マイトマイシンC（10μg/ ml）で（1.5×10 ⁷細胞/フラスコ）を、10 mlの細胞を3回洗浄しPBSを24時間マイトマイシンCなしで予め温めた培地で細胞をインキュベートします。
2. 処理の1日後に、10ミリリットル培地中の細胞をインキュベート（DMEM-F12が20％ノックアウト血清代替[KOSR]を補充し、0.1ミリモルのβメルカプトエタノール、1％NEAA、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン）。インキュベーションの24時間後、15 mlのコニカルチューブで収穫CMと0.22μmのシリンジフィルターを使用してCMをフィルタリングします。
3. 新しいメディアとのインキュベーションの別の10ミリリットルを追加します。 1週間毎日培養物から全ての上清を収集し、-80℃で回収培地を凍結します。凍結融解を繰り返さないでください。

4.培養ヒトの胚性幹細胞（ヒトES細胞）および多能性幹細胞の誘導（性IPSC）

1. ヒト胚性幹細胞株を取得し、（それぞれ、名前WA01とWA09の下でNIHのhESCレジストリに記載されている）H1およびH9細胞および誘導多能性幹細胞iPS細胞-1：のiPS（包皮）-1とiPS細胞-2（IISH1i- WiCell研究所（マディソン、WI、USA）からのBM）。細胞を、製造者の指示に従って解凍し、培養されるべきです。
2. 対照群では、37°C ​​で広く使用されているフィーダーを含まない無血清の規定された培地中で基底膜マトリックスでコーティングされた皿上で、5％CO ₂で培養細胞。最初は、hPSCs私の80-100塊をシードnは35-mmディッシュ。機械的または酵素的方法（ディスパーゼ）を使用して、すべての5~6日に1回継代培養用の70〜80％コンフルエンスと日常的継代細胞まで、これらの皿で細胞を増殖させます。培地で細胞を2回洗浄し、1：1の割合でそれらをプレート：4。毎日新鮮な培地で培地を交換してください。
3. 実験群では、皿上hPCCMで培養細胞を0.1％ゼラチンで予めコーティングし、5日ごとに一度ルーチン継代を行い、機械的または酵素的に。 6-1：10 1の範囲の比率でプレート細胞。 hPSCsは、転送後2日以内にゼラチンに接続します。毎日新鮮な培地で培地を交換してください。

ヒト多能性幹細胞の5キャラクタリゼーション

注：アルカリホスファターゼ染色、免疫組織化学、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）、およびウェスタンブロッティングなどのいくつかの方法を用いてhPSCsを特徴付けます。

1. 免疫蛍光染色
   1. immunofluorescenc用E染色、培養hPSCsと10分間、4％（w / v）のパラホルムアルデヒドを用いて8ウェルチャンバースライド中の細胞を固定します。次に、（v / v）のトリトンX100を15分間、0.1％を含有するPBS中の3％（v / v）の正常ウマ血清と1時間、細胞をブロック（v / v）の0.1％で細胞を透過処理Tween- 20。すべてのステップの間に5分間のPBSで二回洗浄します。
   2. 4℃、二次抗体を用いて、O / N：一次抗体（千OCT-4、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、1の希釈）で細胞をインキュベートします。
   3. 取り付けの前に、暗所で5分間、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で細胞をインキュベートします。暗闇の中で、完全に5分間、細胞を厳密に3回ずつ、乾燥細胞を洗浄します。蛍光マウンティング培地中で細胞を維持し、蛍光顕微鏡下に観察します。
2. 定量RT-PCR
   1. 製造業者の仕様書に従ってRNeasyミニキットを用いて細胞から全RNAを分離し、ナノドロップ分光光度計を用いて抽出したRNAを定量化します。
   2. オリゴ（dT）プライマーおよびSuperscript II逆転写酵素を含む20μlの反応混合液に2μgの全RNAを添加することによりcDNAを合成。この手順では、製造元の指示に従ってください。
   3. のiQ SYBRグリーン定量PCRマスターミックスと補足表S1に記載されたプライマー配列を用いて、Bio-Rad社のiCycler iQのシステムを用いて合成されたcDNAを増幅します。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のものに目的の遺伝子のサイクル閾値の値を正規化します。
3. アルカリホスファターゼ（AP）染色
   1. 製造業者のプロトコルに従って、ES細胞の特徴付けキットを使用して、AP活性を検出。
   2. 5日目に、培地を吸引し、12分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドでhPSCsを修正。 overfixないでください。より長い2分間細胞を固定すると、アルカリホスファターゼの不活性化をもたらします。固定液を吸引し、1×リンスバッファーですすいでください。しないウェルを工程間乾燥させます。
   3. 各ウエル（35mm皿のウェルあたり1ml）にカバーするのに十分な染色液を加えます。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートします。
   4. インキュベーション後、1×リンスバッファーで皿を洗います。オリンパス顕微鏡を用いて染色された細胞の乾燥を防止し、検査し、画像ために、1×PBSで細胞を覆います。
4. ウエスタンブロット法
   1. 以前に⁹で説明したようにウェスタンブロット分析を行います。簡潔には、細胞溶解物中のタンパク質濃度を決定します。ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル上で等量のタンパク質を解決し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上にタンパク質を移します。
   2. ブロットをブロックし、4℃で、異なる一次抗体/ O Nをそれを調べます。その後、1時間HRP結合二次抗体でブロットをインキュベートします。 10分のインキュベーションの間の各時間のために、膜を3回洗浄します。 ECL試薬を使用して信号を検出します。
5. 短いタンデムリピート（STR）分析
   1. hPSCsは、同じ通路で対照群と実験群から採取しました。ゲノムDNAは、製造業者の説明書に従って、DNAマイクロキットを用いて抽出しました。
   2. メーカーの仕様およびキャピラリー電気泳動によると、AmpF / STR PCR増幅キットを使用して16個の異なる遺伝子座についてのゲノムDNAを増幅すると、遺伝子解析装置を用いて行きました。

結果

このHPSC伝搬法の1つの利点は、ヒト細胞から分泌されたコンポーネントを使用することです。プロトコルの中で最もciriticalステップは、ヒト胎盤由来細胞の単離および培養です。これは、HPC板絨毛の正確な部分から必要とし、正確な解剖。 図1は、ヒト胎盤由来細胞を単離するための手順を示しています。このプロセスは、細胞の単離のための簡単​​で便利であり、かつ容易に1時間以内に行うことができます。 図2で説明したように、ゼラチンコートディッシュおよび線維芽細胞様細胞に付着した組織を確実に発芽しました。トリプシン処理により継代中に破片や腐った組織の除去は、細胞の選択を可能にし、均質な文化を保証します。これらの細胞は、汚染がないことを確認した後のHPSCの増殖のための馴化培地を産生するために使用することができます。最適条件は、その目の後、細胞は80から85までパーセントの集密度まで増殖させたものとして定義しました。E成長は人為的（データは示さず）を停止させました。

フィーダー細胞または合成マトリックス上で培養hPSCsはh...

ディスカッション

ヒト微小環境にhPSCsの操作を可能にする、などのbFGFまたはインスリンなどの外因性組換え増殖因子を添加することなくヒトフィーダーを含まない培養条件で、その特性を維持しながら、このモデルは、正常hPSCsを伝播するために開発されました。外因性のbFGF補充が一般的であり、そのようなマトリゲルまたはラミニンなどの基層の適用はhPSCs ¹⁴の無フィーダー培養のために不可欠です。

このプロトコルは、単純で実装が容易です。しかし、いくつかのステップは、その成功に不可欠です。最も重要なステップは、胎盤からの絨毛膜細胞の無菌単離であります。胎盤の収集方法により、例えば、マイコプラズマなどの病原体の汚染リスクが高いです。したがって、細胞の単離の間の病原体検査と管理が非常に重要です。さらに、すべての手順は、無菌的に実行する必要があります。 conditioneのコレクションヒト胎盤細胞の培養物からDのメディアは、一般的に容易です。その扱いがやや困難であるため、しかし、HPSC培養の経験が必要とされています。もう一つの重要な点として、このプロトコルを使用して、研究者があるこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイトマイシン-C	シグマ-アルドリッチコーポレーション	M4287	10 μg/ml
マイコプラズマ検出キット	TaKaRa Bio Inc.	#6601
マトリゲル	BDバイオサイエンス	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
ディスパーゼ	ワージントン バイオケミカル コーポレーション	LS02100	1 mg/ml
ゼラチン	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-サイクリン	ロシュ	799 050	10 μg/ml
RNeasyミニキット	Qiagen	74104
ナノドロップ分光光度計	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON バイオテクノロジー	25011
QIAamp®DNAマイクロキット	Qiagen	56304
AmpF/STR®Identifiler®PCR増幅キット	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	アプライドバイオシステムズ株式会社

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