方法論記事

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

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DOI：

10.3791/53205

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2015年12月8日

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。

要約

アルツハイマー病や関連するタウオパチーを含むいくつかの神経変性疾患における病理の開始と進行のメカニズムとして、有毒なタンパク質凝集体、またはプロテオパシー種子の細胞内増殖を支持する証拠が増えています。疾患の進行におけるタウシードの潜在的に重要な役割は、生物学的サンプル中の播種活性を容易に検出する高感度アッセイの必要性を強く支持しています。

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の特異性、フローサイトメトリーの感度、モノクローナル細胞株の安定性を組み合わせることにより、超高感度の播種アッセイが考案され、ヒトやマウスの脳ホモジネートを含む組換えまたは生物学的サンプルからのシード検出に適合します。このアッセイでは、疾患に関連するP301S変異がCFPまたはYFPに融合したタウの凝集しやすいリピートドメイン(RD)を安定して発現するモノクローナルHEK 293T細胞を使用し、タンパク質の凝集時にFRETシグナルを産生します。プロテオパシータウシード(他のタンパク質ではない)のバイオセンサー細胞への取り込みは、RD-CFPおよびRD-YFPの凝集を刺激し、フローサイトメトリーはこの凝集誘導FRETを高感度かつ定量的にモニターします。このアッセイは、組換えタウシードのフェムトモル濃度(モノマー相当)を検出し、3桁のダイナミックレンジを持ち、タウオパチートランスジェニックマウスおよびヒトタウオパチー被験者の脳ホモジネートに適合します。わずかな変更を加えるだけで、このアッセイは、α-シヌクレインなどの他のプロテオパシー種子の播種活性も検出でき、初代ニューロン培養物とも適合します。FRETフローサイトメトリーの容易さ、感度、および幅広い適用性により、幅広いタンパク質凝集障害の研究に役立ちます。

概要

細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ16の微小レベルの定量を可能にします。

安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取....

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プロトコル

注：このプロトコルは、マウスの生体サンプルから播種活性を検出するためのFRETフローサイトメトリーの使用を強調しています。それはまた、組換え原線維と人間の生物学的サンプルと互換性があります。マウスを安楽死させ、脳を収穫はIACUC承認手順に従って実施しました。

1.脳抽出

  1. イソフルラン（2％）との深い麻酔の後、0.03％のヘパリンを含む氷冷PBSでマウスを灌流し、ゲージら詳細後の脳を抽出します。18
  2. クライオバイアル中で抽出された組織を置き、液体窒素中に配置することによって、凍結スナップ。また、ドライアイス上の組織を凍結します。一度、必要であれば、長期間にわたって-80℃とストアに組織を転送し、凍結しました。
    注：このプロトコルは、全脳ホモジネートまたはマイクロ解剖脳領域と互換性があります。萩原らを参照してください。詳細な顕微解剖プロトコル19のために。

生物種材料の作製

  1. 1×TBS（10ミリリットルあたり1錠）にプロテアーゼ阻害剤（EDTA無料）を溶解することにより、均質化緩衝液を準備します。勢いよくボルテックスし、氷上で保存します。プロテアーゼ阻害剤は、バイオセンサーの細胞生存率を維持するためにEDTAを含まないものでなければなりません。
  2. 使い....

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結果

FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオセンサセルは、可溶性、モノマー形態（ 図1B）でタウを維持します。シードの存在下で、しかしながら、バイオセンサ細胞はフローサイトメトリーを用いてセル単位で検出されたFRET応答を生成し、凝集状態（ 図1C）にτを変えます。定量的評価は、バイオセンサセルは、シード材料のフェムトモル濃度に応答し、そのシード活動が効果的に3桁の大きさ（ 図1D）にわたって測定することができることを示しています。

ゲーティングパラメータは、TRの検出を確実にするために確立されましたUEは、低シード濃度で、.......

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ディスカッション

FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。さらに、タウのためのin vitroアッセイは、播種のみ半定量的およびシード材料23,24のナノモル以下のレベルに一般的に鈍感です。フローサイトメトリーFRETしかし、組換えまたは生物学的サンプルのいずれかから播種活性の定量と絶妙に敏感な尺度を提供します。また、プロシージャの適応は、タンパク質凝集疾患の様々な検討することが有用なものにすることができます。

本明細書に記載されたプロトコルは、タウの播種に焦点を当てているが、単純な修正が必要とされるトンO proteopathic種子の別のタイプから播種アクティビティを監視することを可能に。ホームズとファーマンらが.......

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開示事項

このアッセイはヤンセン・ファーマシューティカルズにライセンス供与されています。

謝辞

この作業はTau Consortium (M.I.D)の支援を受けました。National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.)、国防総省の助成金 PT110816 (M.I.D.へ)、1F32NS087805 (J.L.F.へ)、1F31NS079039 (B.B.H. へ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
TBSSigmaT5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)Roche4693159001
Cryo-vialsSarstedt72.694.006
Analytical BalanceMettler ToledoXSE 105DU
WeighingBoats Fisher Scientific13-735-743
15 ml コニカルチューブUSAサイエンティフィック1475-0501
オムニソニックラプター 超音波ホモジナイザーオムニインターナショナル18-000-115
超音波ホモジナイザー用マイクロチップオムニインターナショナルOR-T-156
2-プロパノールフィッシャーサイエンティフィックA451
ノイズキャンセリングイヤーマフフィッシャーサイエンティフィ19-145-412
キワイプフィッシャーサイエンティフィックS47299
1.5 mlチューブUSAScientific1615-5510
Microcentrifuge エッペンドルフ5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
ウシ胎児血清HyCloneSH30071.03
ペニシリン-ストレプトマイシンLife Technologies15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
トリプシン-EDTAの生命技術25300-054
50のml円錐管フェニックスの研究SS-PH15
25のmlの試薬resevoirsVWR41428-954
多チャンネルのピペットフィッシャー科学TI13-690-049
96の井戸の平底版コーニング3603
Opti-MEMの生命技術31985-070
リポフェクタミン 2000Invitrogen11668019
96 ウェル丸底板コーニング3788
16% パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学RT 15710
PBSシグマ-アルドリッチP5493
EDTAシグマ-アルドリッチED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Sorvall ST 40 遠心分離機Thermo Scientific75004509
BIOLiner スイングバケットローターThermo Scientific75003796
血球計算計VWR15170-172
MACSQuant VYB Flow CytomterMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 RackMiltenyi Biotec130-094-459
Flow Jo 解析ソフトFlow Jo
20 μl ピペットチップレイニンGPS-L10
200 μl ピペットチップレイニンGPS-250
1 ml ピペットチップレイニンGPS-1000
200 μlピペットチップUSAサイエンティフィック1111-1800
5 ml血清ピペットニックス研究SPG-606180
10 ml血清ピペットニックス研究SPG-607180
25 ml血清ピペットフェニックス研究SPG-760180
ック フェフェ

参考文献

  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neu....

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