このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

マウス脳血管の精製

24.2K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/53208

⸱

2015年11月10日

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

この記事について

サマリー

マウスの脳の血管コンパートメントの浄化を可能にするプロトコルを記述します。単離された脳血管には、タイトジャンクションによってリンクされ、連続した基底層、周皮細胞、血管平滑筋細胞、および血管周囲星膠膜に囲まれた内皮細胞が含まれます。

要約

脳内、血管系の大部分は、選択的障壁から成り、脳と血液との間の分子および免疫細胞の交換を調節する血液脳関門（BBB）。また、巨大なニューロンの代謝要求は、血流のその時々の規制が必要です。注目すべきは、これらの規制の異常が最も脳の病理の病原特徴です。 、脳腫瘍、ならびに、多発性硬化症、髄膜炎、および敗血症によって誘発される脳機能障害のような炎症状態：神経膠芽腫、脳梗塞、浮腫、てんかん、変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病例）を含みます。このように、脳血管生理機能を調節するシグナル伝達事象を理解することは大きな課題です。脳血管系を構成する種々の細胞型の細胞および分子の性質に非常に洞察を新たに分離した脳組織から選別初代培養または細胞から得ることができます。しかし、このような細胞極性、形態や細胞間の関係のような特性は、このような製剤中で維持されていません。ここで説明するプロトコルは、構造的完全性を維持しながら、脳血管断片を精製するために設計されています。我々は、単離された血管が連続基底膜で囲まれているタイトジャンクショ​​ンで封止された内皮細胞から構成されていることを示しています。周皮細胞、平滑筋細胞ならびに血管周囲のアストロサイトのエンドフィートの膜は、内皮層に付着したままです。最後に、精製された脳血管に免疫染色実験を実行する方法について説明します。

概要

中枢神経系（CNS）の適切な機能は、高度に調節された細胞外環境を必要とし、その代謝要求は、他の臓器1に比べて巨大です。 CNSはまた、一般的に末梢器官に無害それに、神経毒性の化学物質の広い範囲、に非常に敏感です。正しい機能を保証するために、CNS「血管系のほとんどは、内皮障壁を形成します。分子およびイオンの流れ、並びに、血液と脳の間の免疫細胞の通過を制御する血液脳関門（BBB）は、このようにして治療を妨げ、それによって適切な2ホメオスタシスを維持するだけでなく、治療薬の侵入を制限します神経疾患の3。細胞レベルでは、BBBは、主に内皮細胞、排出トランスポーターの偏発現と非常に低いトランスサイトーシス率4との間に大規模なタイトジャンクションによって維持されます。 BBBの性質や機能は、主にNEによって誘導されますighboring細胞4。具体的には、周皮細胞は、BBB 5,6を誘導し、維持する上で重要な役割を果たしています。大血管の周囲の平滑筋細胞がそうであるように、収縮された細胞、周皮細胞は、血液の流れ7を制御します 。最後に、アストロサイト、脳の主要なグリア細胞、脳血管系8のほとんどの周りにエンドフィートという名前の大きなプロセスを送信し、BBBの完全性と免疫静止9を調節し 、ニューロン10の代謝物の転送、および神経活動の間に緊密な結合を誘導し、血流11,12。

脳血管系の分子や細胞の性質を研究する能力は、脳生理学や生理病理への貢献をより良く特徴付けることが重要です。この質問に取り組むためには、脳の脳血管系を隔離するための戦略は、無傷の脳血管フラグメントの調製を可能にする、開発されています。脳血管Purificationは当初、特にげっ歯類14で、他の種にウシ脳13を用いて説明し、改善し、適応させました。この最後の研究では、様々なサイズのフィルターの使用は、異なる直径の容器内で濃縮画分に脳血管を分離するために導入されました。興味深いことに、このような製剤には、内皮細胞は、それらの代謝特性15、トランスポーターの機能16と、偏光17を保ちました。ここでは、具体的に、このプロトコルを記述し、さらに単離血管が自分の中でその場構造のほとんどを維持することを示しています。内皮細胞は、タイトジャンクショ​​ンによってリンクされ、連続的な基底膜に囲まれたままです。周皮細胞および平滑筋細胞、内皮層、ならびに血管周囲の星状細胞膜に付着したままです。しかし、アストロサイト、ミクログリア細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトが排除されます。最後に、我々は、単離された脳血管に免疫染色を行うための手順を説明します。

これまで脳血管系に関わる分子および細胞研究のほとんどは、細胞選別細胞特異的レポーターマウス系統または免疫染色に基づく手順18,19を使用して精製した解離脳血管細胞上で行われています。これらの技術は、ほぼ純粋な脳血管細胞集団の単離のために可能にするが、単離された細胞は、完全に順番に、非常にそれらの分子や細胞の特性に影響を与える彼らのその場での形態との相互作用を、失います。分離された脳血管の全体的な構造は、それらの分子特性に影響を小さく、したがって、保存されているとして、ここで説明されたプロトコルは、特異的な抗体またはトランスジェニックマウスの汚れの必要のない全脳血管の断片を単離を可能にする、優れた代替手段を提供しています。最近20,21に記載のように単離された容器は、その後BBBにおける遺伝子活性、タンパク質合成および調節を研究するために使用されるかもしれません。最後に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション22,23と比較して、本発明のプロトコルは、安価で実行が容易で、任意の研究室に急速に適応可能です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.ソリューションと材料

  1. 分離容器の溶液を調製する：B1、HBSSの150ミリリットルにHEPES 1M、1.5mlのを追加します。 B2、B1の20ミリリットルにデキストラン3.6gのを追加します。 B3は、B1の100mlに、BSAの1グラムを追加します。
  2. 上部のネジ止め部分から下部を切断してフィルターホルダーを変更します。
  3. 免疫染色ソリューション準備：固定液、pH7.4のPBS中4％パラホルムアルデヒドを、透過処理は、/ブロッキング溶液、5％にヤギ血清を希釈し、pH7.4のPBS中の0.25％のトリトンX100。
    注意：固定は、用いた一次抗体の種類によって異なります。

2.解剖

注意：容器は、細胞培養のために使用されていない限り、滅菌条件は、必要とされません。

  1. B1の20mlで150ミリリットルのビーカーを用意します。氷上に保ち、空気汚染を避けるために、パラフィルムでカバーしています。
  2. 深くint型を追加された純粋なイソフルランの1ミリリットルに浸した小さな紙タオルでボンネットの下にマウスを麻酔ケージO。麻酔は、つま先のピンチに反応の欠如によって確認されました。頸椎脱臼によりマウスを殺します。
    注：これらの手順は、国家や機関の規制に準拠して達成されます。
  3. オプション：血液コンテンツ 24 を除去するために 、PBS 1×20mlで心臓内灌流を行います。
  4. 第鼻に首からメスで皮膚と離れてそれを引っ張ります。 PBS 1Xを持つすべての汚染毛を削除します。
  5. 頭蓋骨を開くには、最初の嗅球に前方にはさみを入れ、2つの部分で頭蓋骨を破壊するはさみを開きます。
  6. 慎重に脳へらを使って脳を削除してください。彼らは血管の準備38を汚染するよう側脳室から脈絡叢を解剖。
    注：オプション：最終製剤は実質および髄膜血管を含んでいます。望まれていない場合、髄膜38によって記載された手順に従って剥離することができます。
  7. Trの氷上B1溶液を含有するビーカーに脳をansfer。最大8脳を一緒に処理することができます。

3.脳組織の均質化

  1. その後、約2mmの小片を取得B1溶液中で脳を破っ手動で、激しく、2メスを使用しました。
  2. 400 rpmで20ストロークを行う、自動化さダウンスホモジナイザーで準備を均質化。エアポケットの形成を防止するように、ガラス管を氷中に維持されると、上下移動時にdouncerの上部が溶液中にあることを確認します。いくつかのサンプルが用意されている場合は、それぞれの均質化の間にイオン水でdouncerを洗います。

4.船の精製

  1. 50ミリリットルのプラスチックチューブにホモジネートを移し、4℃で10分間2000グラムで遠心分離に進みます。何の灌流を行わなかった場合は大きな白いインタフェース（主にミエリン）を容器ペレット（赤の上に形成することになります）。
  2. 上清を捨てます。容器ペレットと白のインターフェイスが一緒に付着したままになります。氷冷B2溶液20mlを加え、1分間手で激しくチューブを振ります。
  3. 4℃で15分間4400グラムで2回目の遠心分離に進みます。ミエリンは、現在上清の表面に高密度の白色層を形成します。
  4. 慎重にチューブを保持し、ゆっくり上清を壁に沿って通過させるためにそれを回転させることにより、チューブ壁からミエリン層を切り離します。上清とミエリンを捨てます。血管を含むペレットは、チューブの底に付着したままです。
  5. 5ミリリットルのプラスチックピペットに巻き付け吸収紙でチューブの内壁をブロットおよびすべての残留流体を除去、血管ペレットを触れないように注意してください。残りの液体を排出するために吸収紙の上にチューブ逆さまにしてください。
  6. 低結合ヒントをピペッティングにより氷冷B3溶液1mlでペレットを中断し、keepiチューブを氷上にngのは、B3液の別の5ミリリットルを追加します。船を極力分散され、凝集体を形成しないことを確認します。

5.ろ過

  1. 氷冷B3液30mlで氷の上でビーカーを準備します。空気汚染を避けるためにパラフィルムでカバー。
  2. ベッカーフラスコの上に修正されたフィルターホルダーに20ミクロンメッシュフィルターを配置し、氷冷B3溶液10mlを適用することにより平衡化。
  3. フィルター上の容器の準備を注ぎ、氷冷B3液40mlで血管をすすぎます。
  4. きれいなピンセットを使用してフィルタを回復し、すぐB3液の入ったビーカーの中に浸します。軽く振ることによってフィルターから血管を外します。
  5. 4℃で5分間、2,000×gで50 mlのプラスチックチューブと遠心分離機でビーカーの内容を注ぎます。
  6. 注：または、ステップ4.6からの脳船舶の懸濁液を100ミクロンメッシュフィルターに濾過することができます。フロースルーは、次いで、上記のように20μmのメッシュのフィルターで濾過された微小血管（主として毛細血管）を含むが、この場合には、より大きな血管が優先フィルター上に保持されます。
  7. 氷冷B3溶液1mlに微小血管のペレットを再懸濁し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれをピペッティングすることにより、それを転送します。 4℃で5分間2000グラムで遠心。

6.固定、透過処理およびブロッキング

  1. 1.0ミリリットル低い結合チップを用いて、PBSを含む0.2ミリリットルのPCRチューブにピペット操作による転送船。彼らは先端の外側の部分に付着し得るような血管を触れないように注意してください。双眼顕微鏡下で、次のすべての手順を実行します。
  2. 以下の培地の変更ごとに、血管が底に到達するまで氷上にチューブを残して、長い事ゲルローディングピペットチップを使用して液体のほとんどをピペット。
  3. PBSの大部分を除去し、固定溶液の200μlを添加します。軽く振ることによって血管を一時停止し、室温で20分間インキュベートします。
  4. 固定溶液をピペット1×PBS（第一洗浄）を200μlと交換し、室温で5分間インキュベートし、この手順を3回繰り返します。たびに、血管が正常血管が触れていない保証し、1×PBSアウトチューブ、ピペットの底に沈んでいることを確認してください。
  5. 最後の洗浄後、随時穏やかに振とうすることにより、血管を再懸濁、透過処理/ブロッキング溶液によって1×PBSを交換し、室温で1時間インキュベートします。

7.免疫染色

  1. 透過化/ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体（材料テンプレートテーブルでここと希釈液を用いた抗体の参考文献を参照）が混在する透過処理/ブロッキング溶液を交換し、4°CO / Nでインキュベートします。
  2. 室温でPBS中で3回洗浄した後、2時間PBS中に希釈した二次抗体の混合物で血管をインキュベートRTで。
  3. 注意：顕微鏡下で毛や埃の混入可能性から血管を区別するために：（2000 1）またはDAPI：私たちは強くヘキスト（2000 1）で核染色を行うお勧めします。
  4. PBS中で3回洗浄した後、PBSを50μlの血管を再懸濁します。

8.取り付けと観測

  1. シリコン処理ガラスキャピラリーで先端を準備します。メスを用いてP200のピペットチップをカットし、内部の毛細血管を調整します。キャピラリーのおおよその量は40μLです。
  2. シリコン処理ガラスキャピラリーを用いてガラススライドに船を移し、慎重に吸収紙の切れ端で液体を除去します。
  3. 船の上に封入剤の一滴を適用し、ドロップがスリップの縁に沿って拡散することを可能にする45°でカバーガラスを保持します。カバースリップをオフに行ってみようと媒体がゆっくりと広がりを可能にします。それ乾燥したO / N室温で光から保護してみましょう。容器はfluoresc下で観察することができENT共焦点顕微鏡。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ここでは、脳血管14の機械的な分離を可能にするプロトコルを記述している。 図1は、この技術の主な手順をまとめたものです。脳血管の構造は複雑であり、いくつかの細胞型を含む、すなわち、内皮細胞のタイトジャンクションによって密封され、周皮細胞、平滑筋細胞、および星状細胞の足突起9によって囲ま。このように、脳血管の単離後、私たちはプロトコルの第2の部分で説明したように免疫染色することにより精製した血管の構造を特徴づけることを目的としました。アグリン、内皮基底膜の成分が連続的かつ均一に内皮表面（ 図2A）で標識しました。ソナはoccludens-1（ZO-1）を、内皮タイトジャンクションの構成要素の一つは、内皮タイトジャンクションが（ 図2B）保存されていたことを示唆し、明らかな不連続で免疫染色しました。周皮細胞の内皮報道、ラベル以前25（ 図2C）に記載されているようNG2により編、ほぼ連続登場。最後に、平滑筋アクチン標識が大き...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

血液脳関門は、CNSの中と外の生理学的物質の通過を調節し、血液中に存在する潜在的に有害な物質に対してそれを保護します。これは、神経変性疾患2と脳腫瘍28を含む、いくつかの中枢神経系の病態に関与しています。 BBBの極めて低い透過性はまた、神経細胞を標的治療薬の通過妨げと可逆的に脳のための有害な結果を伴うBBBを開くしようとする方法の開発は、研究3の非常に活発な分野です。多くの努力は、齧歯類脳から血管を分離するための貴重なモデルとBBBの、細胞の分子的および薬理学的研究を可能技術、特に、プロトコルを開発するために行われています。最初の試みは、単純に、脳実質細胞13を汚染廃棄する可変細孔サイズのメッシュを使用して機械的に分離脳組織からの微小血管を収集します、29、30、31。密度勾配遠心分離は、後の列32、33、15、ナイロンメッシュまたはガラスビーズで脳血管の濾過に関連し導入しました。これらの手順では、ナイロンメッシュ濾過対ガラスビーズは、高速遠心分離はまた、遺伝子発現の15、32に影響を与え

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、Labex MemoLifeによっておよびARSEPによってサポートされていました（財団はラRECHERCHEシュル・ラ・硬化させるアンプラークàL'補佐官を注ぎます）

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ティッシュグラインダー サイズCトーマス・サイエンティフィック3431E25
遠心分離機 5415 REppendorf
遠心分離機 5810 REppendorf5811000320
高性能、モジュール式実体顕微鏡LeicaMZ6
Compact System は、高品質のライカLED1000ライカLED1000
低結合チップを提供します (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm フィルターホルダー PP 8/PkMilliporeSX0004700
ナイロンネットフィルターディスク親水性20 &m 47 mm 100/PkミリポアNY2004700
ナイロンネットフィルターディスク 親水性 100 & マイクロ;m 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Hover ΩTubing SutterInstrument B150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml 薄肉チューブとドーム型キャップThermo ScientificAB-0266
 パラフィルム M (ロールサイズ 4 インチ; 125 フィート)シグマP7793-1EA
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなしライフテクノロジー14175-129
HEPES (1M)ライフテクノロジー15630056
ロイコノストック属のデキストラン Mr. ~70,000Sigma31390
ウシ血清アルブミンSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% ホルムアルデヒド (w/v), メタノールフリー Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
封入剤 Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate;希釈 1/100ライフテクノロジーI21411
アグリン (ウサギ) ; 希釈 1/400Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (マウス、クローン 1A12)ライフテクノロジー33-9100希釈率 1:500
アンチ平滑筋アクチン (マウス、クローン 1A4)シグマA2547 希釈率 1:500
Anti GFAP (マウス、クローン GA5)SigmaG3893 希釈率 1:500
抗AQP4(ウサギ)SigmaA5971 希釈 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 希釈率 1:500
アンチオリッグ2(ウサギ)ミリポアAB9610 希釈率 1:200
Anti NF-M (mouse)は、スイスのローザンヌ大学の Beat M. Riederer 博士によって提供されました。 希釈1:10
アンチイバ1(ウサギ)和光019-19741 希釈率 1:400
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体Life テクノロジーA11029 希釈率 1:2,000
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲートライフ テクノロジーA11034 希釈率 1:2,000
Alexa Fluor 555 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体Life テクノロジーA21424 希釈率 1:2,000
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 555 コンジュゲートライフ テクノロジーA21429 希釈率 1:2,000
提供:

参考文献

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

マウス脳血管の精製
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。