方法論記事

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

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DOI：

10.3791/53217

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2015年11月13日

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

この記事について

サマリー

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。

要約

機能不全骨格筋ミトコンドリアは、加齢、肥満およびII型糖尿病で観察し、変化した代謝の役割を果たしています。分離されたミトコンドリア調製物からのミトコンドリア呼吸アッセイは、薬物や代謝を調節するタンパク質の作用メカニズム（複数可）のミトコンドリア機能の評価だけでなく、決意を可能にします。現在の単離方法は、多くの場合、呼吸アッセイに必要な高品質のミトコンドリアを得るために組織を大量に必要とします。本明細書に提示される方法は、（〜450μgの）は、高スループットの呼吸測定に使用するために、マウスの骨格筋の最小量（〜75-100ミリグラム）から単離することができる方法を高品質精製ミトコンドリア説明します。私たちは、分離法は、分光光度法、クエン酸合成酵素活性を測定することにより、92.5±2.0％、完全なミトコンドリアをもたらすことを決定しました。また、単離ミトコンドリアにおけるウェスタンブロット分析は、cytosoのかすかな発現をもたらしましたLICタンパク質、GAPDH、およびミトコンドリアタンパク質、COXIVの強い発現。単離されたミトコンドリアにおいて顕著GAPDHのバンドが存在しないことは、単離手順の間の非ミトコンドリア源からの少量の汚染の指標です。最も重要なのは、O 2消費率の測定マイクロプレートベースの技術とし、結合された呼吸アッセイのための呼吸調節比（RCR）を決定するには、高度（RCRを、全てのアッセイのための> 6）に接続ショーや機能ミトコンドリア。結論として、独立したミンチ工程の追加とはかなり以前に報告された方法のモーター駆動均質化速度を低下させることにより、高機能と呼吸性の高い結合されたミトコンドリアになり、マウス骨格筋の少ない量から高品質、精製されたミトコンドリアの単離を可能にしましたマイクロプレートベースrespirometircアッセイ中に。

概要

ミトコンドリアの主な機能は、酸化的リン酸化からATPを生成することです。しかし、ミトコンドリアには、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアカルシウムの調節、オルガネラの輸送、イオン恒常性、アポトーシスへの関与など、他にも多くの重要な細胞機能があります1,2。したがって、機能不全のミトコンドリアが、老化、神経変性疾患、心血管疾患、癌、肥満、糖尿病などの多くの疾患の病状に関与していることは驚くべきことではありません3,4。重要なことに、骨格筋のミトコンドリアは、特にこれらの病状の多くに関与しています3-5。

単離されたミトコンドリアを使用した

ミトコンドリア呼吸アッセイは、電子伝達鎖と酸化的リン酸化機能の評価、および代謝を調節する薬物とタンパク質の作用機序の決定を可能にします。ミトコンドリアの単離手順は、さまざまな種の複数の組織および細胞タイプに対して存在します6,7。しかし、これらの手順では、従来の呼吸測定アッセイに必要な高品質のミトコンドリア収量を得るために、大量の組織/細胞が必要になることがよくあります。

マイクロプレートベースのレスピロメティックアッセイは、最小限の単離ミトコンドリア(多くの場合、ウェルあたりわずか数μg)を使用したハイスループット測定を可能にします8。したがって、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイで使用するために、少量のマウス骨格筋から高品質のミトコンドリアを単離できるようにするために、以前に発表された方法7の修正を示します。さらに、ミトコンドリア単離調製物の品質およびミトコンドリア膜の完全性を確立するための方法が提供されている。骨格筋のミトコンドリアが多くの病的状態に関与していることを考えると、機械論的研究におけるO2消費の測定は、生物医学研究においてより一般的になってきています9,10。

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プロトコル

動物実験は、動物実験によって承認されたプロトコルの下で行われ、バージニア工科大学で委員会を使用しました。

1.セットアップ（時間：〜45分）

  1. 37℃の水浴中で0.25％トリプシン、単離ミトコンドリアのバッファ（IBM）1 IBM2の凍結貯蔵を解凍。
  2. ガラス製品をすすぎ、高純度水に続いて70％エタノール中で楽器を解剖。
  3. 4部IBM1で1部のトリプシンを希釈することにより、0.25％のトリプシンの株式0.05％トリプシン溶液を準備します。
  4. スクリューキャップ1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内：（100比1）細胞溶解バッファーでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを混ぜます。
  5. アリコートを5 mlの15 mlのプラスチックチューブに、0.05％トリプシン（5ミリリットル/マウス）。
  6. 80 RPMにモータ駆動の組織ホモジナイザーを設定します。

骨格筋ミトコンドリアの2分離（時間：〜90分）

  1. CO 2でマウスを安楽死させます吸入、。
  2. 大腿四頭筋と腓腹筋から赤筋を削除するには、以下の手順で説明するようにヒラメ（〜75-100 mgの合計）が含まれています：
    1. マウスの方の皮膚の皮をむきます。
    2. 大腿四頭筋原点の上に脂肪パッドを取り外します。細かい傾いてハサミで膝蓋骨に接続されている四頭筋腱をカットします。
      注意：大腿四頭筋は、大腿骨近位部の前方部分に、その解剖学的位置によって識別されます。
    3. 骨から大腿四頭筋を解放するために、大腿動脈を回避しながらゆっくりと、骨と大腿四頭筋腱膜の間を切り取ります。大腿四頭筋を解放し、冷PBSで大腿四頭筋を配置するために、大腿骨上の原点で細かい傾いてハサミで腱をカットします。
    4. ハサミで大腿四頭の上に目に見える脂肪組織を削除します。大腿骨の上に位置された筋肉の部分はUを向くように上で大腿四頭筋をフリップP。ファニングの運動でピンセットで大腿四頭筋を開きます。チルドIBM1の5ミリリットルを含むビーカー中に微細な先端ハサミと場所で各葉から2可視赤色筋肉部分を削除します。
      注意：大腿四頭筋は、各葉の側縁付近に位置する赤筋のストリップで2つのローブとして表示されます。
    5. 細かい先端に付いたハサミでアキレス腱を覆う皮膚を切り、マウスに向かって皮をはがし。露出したアキレス腱を切って、マウスの体内に向けて筋肉を剥離。
    6. 腓腹筋を解放し、冷却PBS中の腱に取り付けた腓腹筋を配置するために、微細な先端ハサミで大腿骨の外側顆および内側顆で腱をカットします。
    7. 以上の腓腹筋を裏返し、ヒラメ筋を剥離し、冷却IBM1の5ミリリットルを入れたビーカーに入れます。ファンは腓腹筋を開きます。細かい傾いてはさみで3種類の視覚的な赤い筋肉部（二つの側方および1内側表面的な赤のストリップ）を削除しますSとは、冷却IBM1の5ミリリットルを含むビーカーに転送します。
  3. マウスの他の脚部から赤筋の別〜75-100 mgの削除（ステップ2.2）およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルおよび細胞溶解緩衝液を用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れる（50mMのTris-HCL、1 mMのEDTA、150mMのNaCl、1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％ポリオキシエチレン（9）ノニルフェニルエーテルは、直ちにウェスタンブロッティングにおける後の使用のために液体窒素中でこの第二のサンプルをフラッシュ凍結分岐（ステップ6.1参照）。
  4. 大きなバケツに氷上で予冷し、平らなプラスチック表面を置きます。プラスチック表面上にIBM1の低下を注ぎ、IBM1滴に区分赤筋（ステップ2.2.4および2.2.7）のすべてを配置するためにピンセットを使用しています。カミソリごとに40秒を変更することにより、3つのシングルエッジかみそりの刃を使用して、2分間の筋肉組織をミンチ。
  5. 目の上にプラスチック表面を保持することによって、新鮮なIBM1 5mlで新しいビーカーに刻んだ組織を転送Eビーカーやかみそりの刃でビーカーに筋肉をこします。このソリューションを取り、50mlコニカルチューブ上に配置さ100μmのセルストレーナーを介して排出します。
  6. 繊細な作業ワイパーで組織をブロットした後、0.05％トリプシン溶液5mlにそれを転送します。タスクワイパーから組織を除去するためにピンセットを使用してください。
  7. 0.05％トリプシン溶液中で30分間氷上で筋肉組織をインキュベートします。
  8. 4℃で3分間200×gで15ミリリットルコニカルチューブ含むトリプシン/筋肉の混合物をスピン。
  9. 廃棄物容器にトリプシン上清を注ぎ、氷冷IBM1 3mlでペレットを再懸濁。 45ミリリットルのガラスホモジナイザーチューブに組織を移します。残りのサンプルを収集し、ガラスホモジナイザーチューブにこれを追加するために、別の1.5ミリリットルIBM1で15ミリリットルにコニカルチューブを洗浄します。
  10. ガラスホモジナイザーをビーカー内で最​​小限に移動して、氷を入れたビーカーやプラスチック容器満たし途中にガラスホモジナイザーチューブを置きます。
  11. 80 rpmで10パスしてモータ駆動の組織ホモジナイザーに接続されているPTFE製乳棒で組織/ IMB1混合物を均質化します。 〜2秒間、各パスの底を持ってください。
  12. 新しい15ミリリットルコニカルチューブに組織ホモジネートを移し、IBM1 6.5 mlのガラスホモジナイザーチューブをすすいでください。組織ホモジネートを含む15ミリリットルコニカルチューブにIBM1を注ぎます。
  13. 4℃で10分間700グラムで15ミリリットルコニカルチューブをスピン。静かにガラスの高強度遠心管に上清を注ぐし、ペレットを廃棄します。
  14. 4℃で10分間8000×gで、上記のステップからの上清をスピン。
  15. IBM1の上清を除去し、ゆっくりIBM2500μlのを追加することにより、ペレットを再懸濁。ピペットチップの先端をカットし、軽く運動を混合し、攪拌しながらIBM2でペレットを均質化します。ペレットが完全に中断された後、混合物にIBM2の別の4.5ミリリットルを追加します。
    注：tと大きなペレット片を破壊しながら、過度の摩砕を避けます彼は、ミトコンドリア膜を損傷することがあります。
  16. 4℃で10分間8000×gでIBM2 /組織ホモジネートをスピン。
    注：残留BSAは、総タンパク質含有量に寄与することができるので、このステップは、ステップ4において、単離されたミトコンドリアのより正確なタンパク質定量のためのクリーンな高強度遠心管中で繰り返してもよいです。
  17. 上清を除去し、静かに、しかし完全に遮断、その点にピペットチップでIBM2の225μlの増分を追加することにより、ペレットを再懸濁。ゆっくりIBM225μlのそれぞれの添加後にペレットを攪拌、混合します。氷の上でこのミトコンドリアの在庫を置きます。

全組織溶解物の3均質化（時間：〜45分は、ステップ7の間に行うことができます）

  1. それがステップ2.3から液体窒素の中に入れたから筋肉を外し、完全に解凍するまで室温でインキュベートします。
  2. 細かい傾いてハサミで氷上で〜30秒のための組織をみじん切り。
  3. ジルコ二100μlのスクープを追加みじん切りの組織が含まれているステップ3.2からのスクリューキャップ1.5 mlのマイクロ遠心チューブにニウム酸化物ビーズ。 4-6（メディア設定）の速度設定で2 5 3分のサイクルを使用して、ビーズミル組織ホモジナイザー中で組織をホモジナイズします。
  4. 4℃で10分間12,000×gでステップ3.3からの混合物をスピン。スピンした後、千μlのピペットチップを使用して上清を除去し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。ペレットを捨て、氷の上に上清を配置します。

4.タンパク質の決意（時間：〜30分）

  1. 製造業者の仕様に従って、BCAタンパク質アッセイキットを使用して、全組織溶解液（ステップ3.4）とミトコンドリアの株式（ステップ2.17）のタンパク質濃度を決定します。

5.ミトコンドリア膜の完全性、クエン酸シンターゼ（CS）活動（時間：〜15分）

  1. 高純度水におけるミトコンドリアの株式の20希釈液：二つの別々の1を作ります。追加一つのサンプルにトリトン100-Xの0.1％と低く設定（765ワット、2の振幅）でそれを超音波処理します。氷の上の他の希釈のままにしておきます。超音波処理した後、氷にサンプルを返します。
  2. でクエン酸シンターゼアッセイを行う両方の非超音波処理し、以前に記載されているように11,12を分光光度アッセイを用いてミトコンドリアの希釈液を超音波処理しました。
  3. 以下の式を用いて、無傷のミトコンドリア膜の割合を決定します。
    （超音波処理CS活性÷非超音波処理CS活性）* 100


100- N（上から達成パーセント）

6.ミトコンドリアの分離品質。ウェスタンブロッティング（時間：ラボプロトコルによります）

  1. 以前に説明したように12全組織溶解物および単離ミトコンドリアにウェスタンブロッティングを行います。
    注意：GAPDHのための使用の一次抗体を（1：1,000希釈5％のBSA / TBS-T）とCOXIV（1：1,000希釈の5％無脂肪ミルク/ TBS-T）（1それぞれ、抗ヤギ、ウサギ二次抗体が続く：10,000）。

7.呼吸アッセイを実行します（時間：〜90分）

  1. 前述したように、マイクロプレートベースのO 2消費の測定技術を用いて所望の呼吸アッセイを実行します（関連記事やロジャースを参照ら8）。
  2. ステート40（RCR）によって状態3を分割または州40によって状態の3Uを分割することにより、呼吸制御比（RCR）を決定します。 RCRを決定する際に、ポイントツーポイントトレースからミドル（平均）点、または最高の（状態3）および最低宿泊料金（状態40）のいずれかを使用してください。

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結果

クエン酸シンターゼはミトコンドリア内膜に位置しており、したがって、無傷の膜を有するミトコンドリアの懸濁物に存在してはならないので、クエン酸合成酵素活性は、膜の完全性のための尺度として役立つ。 図1を超音波処理と比較して、非超音波処理し、ミトコンドリア試料中のクエン酸合成酵素活性を示し、同じ分離からのサンプル。クエン酸シンターゼ活性（P <0.01）の統計的に有意な増加でミトコンドリアの結果を超音波処理。重要なことは、ミトコンドリアの92.5±2.0％は、単離後無傷でした。

図2は、単離されたミトコンドリアおよび全体骨格筋組織溶解物中のGAPDHおよびCOXIV発現を示します。 GAPDHは、細胞質ゾルに位置するタンパク質であるが、COXIVはミトコンドリア内膜に存在するタンパク質でありながらも、転座の後に核内に見つけることができます。 GAPDHおよびCOXIVの発現は、全体TISSで明らかですUE溶解液。 GAPDHの唯一のかすかなバンドが明らかであるが、単離されたミトコンドリアにおいて、COXIVの発現...

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ディスカッション

本明細書に提示する方法は、マウス骨格筋の最小量（〜75〜100ミリグラム）から、ミトコンドリアの単離手順の詳細な説明を提供します。この単離手順は、O 2消費率、RCR値、最大のクエン酸シンターゼ活性およびイムノブロットからのタンパク質の発現によって証明されるように、高機能、純粋なミトコンドリア（〜450μgの）を生成することができます。重要なことには、この手順から単離されたミトコンドリアは、高スループットを可能にするマイクロプレートベースのO 2消費の技術で複数respirometircアッセイのために使用することができます。

骨格筋ミトコンドリアの単離は、多くの場合、結合組織および構造タンパク質7,16を囲むからミトコンドリアを解放するために過酷な方法を必要とします。その結果、ミトコンドリア膜は、このように、後続のrespirome中のミトコンドリアO 2消費の活性（従って、精度）を損なう、崩壊してしまうことができますTRICアッセイ。以前に記載されたプロトコル7に組織切...

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開示事項

ジョージ・ロジャースは、このプロトコルが変更された機器を製造するシーホース・バイオサイエンスの従業員です。

謝辞

バージニア工科大学のフラリン生命科学研究所とメタボリック表現型コアがこの作業を支援しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
基本的に脂肪質のシグマ アルドリッチA6003N/A
アシッド フリー - BSA
トリス/HClプロメガH5123該当なし
KCL シグマ アルドリッチP9541該当なし トリ
ス ベースプロメガH5135該当なし
EDTAシグマ アルドリッチE6511該当なし
EGTASigma AldrichE4378N/A
ショ糖Sigma AldrichS7903N/A
D-MannitolSigmaAldrich 63559N/A
トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッドThermo Scientific25200-056N/A
塩化ナトリウム
白色結晶または結晶性粉末
≥99.0 %		フィッシャーサイエンティフィックBP3581N/A
ドデシル硫酸ナトリウムSigma AldrichL3771 該当なし
デオキシコール酸ナトリウムSigma AldrichD6750 該当なし
ポリオキシエチレン (12) ノニルフェニルエーテル、分岐シグマ アルドリッチ238651該当なし シングル
エッジ カミソリの刃フィッシャーサイエンティフィック12-640N/A
ファルコン - 100 uM ナイロン セル ストレーナーフィッシャー サイエンティフィ352360該当なし
停止プロテアーゼ &ホスファットーゼ阻害剤Thermo Scientific1861284N/A
1.5 ml 微量遠心チューブ(スクリューキャップ付き) Thermo Scientific3474N/A
酸化ジルコニウムビーズフィッシャーサイエンティフィC9012112N/A
GAPDH抗体 (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
抗COXIV抗体細胞シグナル伝達4844s任意のミトコンドリア内膜タンパク質は、
ペルオキシダーゼ結合アフィニピュアロバ、抗ウサギIgG(H + L)ジャクソン免疫研究711-035-152N / A
ペルオキシダーゼ結合アフィニピュアヤギ、抗マウスIgG(H + L)で十分ですJackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific23225N/A
ピルビン酸、98%Sigma Aldrich1073604 °C;C、pH 7.4 まで KOH で使用する前に Respirometric Assay
Sコハク酸Sigma AldrichS9512室温で保存し、pH を 7.4 まで KOH で使用してから Respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%Sigma AldrichM6413室温で保存し、7.4までKOHで保存してから呼吸測定アッセイで
L-グルタミン酸Sigma AldrichG1251室温で保存し、7.4まで 呼吸測定アッセイで使用する前にKOHで7.4まで 呼吸測定アッセイ
パルミトイルL-カルニチンクロリドSigma AldrichP1645-20°Cで保存
オリゴマイシン A、≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351-20 >C
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)Sigma AldrichC29202-8 °C;C
フェニルヒドラゾン
≥98%(TLC)、粉末[FCCP]
Streptomyces sp.由来のアンチマイシンA。シグマ アルドリッチA8674-20 °C
アデノシン 5′-二リン酸一カリウム塩脱水 [ADP]Sigma AldrichA5285-20 °C;C、7.4に KOHで使用する前に 呼吸測定アッセイ
RotenoneSigma AldrichR8875室温で保存
ック カクテル ック 使用 で使用する前にKOHで7.4まで保存

参考文献

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