で社会空間に影響を与える条件<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

サマリー

遺伝子と環境がショウジョウバエの社会空間に及ぼす影響は、強力でありながら直接的な分析パラダイムを通じて定量化することができます。 ここでは、この社会的空間に影響を与える可能性のあるさまざまな要因を示しているため、このパラダイムで実験を設計する際には考慮する必要があります。

要約

または他の小昆虫- -簡単な方法で、ここで説明する社会空間アッセイは、 ショウジョウバエmelanogaste rの社会的相互作用を定量化するために使用することができます。我々は以前に^1を示されているように、二次元のチャンバ内で、我々は最初に、タイトなグループを形成するためにハエを強制その後、それらを互いに、その好適な距離を取ることを可能にします。ハエが確定した後、我々は無料のオンラインソフト（ImageJの）と静止画を加工する、最も近い隣人（または社会空間）までの距離を測定します。潜在的な交絡因子を制御しながら、最も近い隣人への距離の分析は、研究者は社会的相互作用の遺伝的要因と環境要因の影響を決定することを可能にします。そのような能力が、一日の時間、性別、ハエの数を、登山などの多様な要因がハエの社会的な間隔を変更することができます。そこで我々は、これらの交絡影響を緩和するために実験的な一連の制御を提案します。このアッセイすることができます少なくとも2つの目的のために使用されます。まず、研究者は、（例えば、分離、温度、ストレスや毒素など）自分の好きな環境のシフトは、社会的間隔^{1,2にどのような影響を与えるか}を決定することができます。第二に、研究者は、社会的行動^1,3のこの基本的な形の遺伝的および神経基盤を分析することができます。具体的には、例えば、ヒト⁴における自閉症の候補遺伝子のような他の生物、社会的行動に関与すると考えオルソロガス遺伝子の役割を研究するための診断ツールとしてそれを使用していました。

概要

社会的相互作用は、全体として、グループ内の個人の適切な発達と健康に不可欠であり、そのようなミバエ（ キイロショウジョウバエ ^）5,6などの単純な生物に人間（ ホモ・サピエンス ）から、多数の種を越えて観察することができます。聴覚、視覚、嗅覚、触覚、または味覚：個々の果実はそれがいるかどうか、これらの相互作用の間に感覚情報を処理するための一般的な手段を飛ぶか、人間のシェア。我々と他の人がそこに社会的相互作用に行動反応の基礎となる可能性の共有neurocircuitryであり、関係する神経細胞や遺伝子が^7を進化的に保存される可能性があることと仮定しました。最初の相互作用が発生した後は、相互作用の個人間の社会的空間が増加（社会回避^8）または減少（グループ形成/アグリゲーション^5）のいずれかになります。より複雑な相互作用は、侵略や求愛のように、その後、場所を取ることができます。

洗練されたツールや方法、また時間やトレーニングに大きな投資をどちらも、それに強力な分析ツール作り、社会的行動のこの簡単なフォームを定量化するために必要とされます。ここでは、以下の研究^1-4,9で使用されるように、 キイロショウジョウバエの安定したグループで社会的相互作用を評価するために、間飛距離を定量化する簡単なプロトコル、または社会的な空間を説明します。社会空間は、フライとその最も近い隣人¹⁰との間の距離の尺度を指します。社会空間は、Dの所定の集団のために一致していますショウジョウバエの実験条件は、（1-2本体の長さの中におよそ平均）に保存し、個人が分離¹に保持されている場合に増加し、ハエの社会的経験に関して変化しているとき。適切なビジョンは、通常の社会的距離を維持するために必要であるが、臭気物質またはCVA知覚¹古典ません。社会空間の測定は、このようにすることができます社会的相互作用を分析し、Dに社会的行動を定量化するための診断ツールとして使用メラノ^1。我々は、この定量化を実行する方法を詳細にここで説明し、どの程度まで共通実験変数は、この動作に影響を与えます。

程度の - - 行う社会空間に影響を与え、我々は、アッセイが行われるチャンバー、ならびにハエの数の向きがあることを示します。これは、以前にチャンバー形状はハエ^11,12の自発的な探索の動きに影響を与え、彼らが定住することを決定したところ、この現象は、最終的に影響を与える可能性があることが示されました。しかし、限りフライ密度（フライ/ ^cm 2）を、チャンバの向きと同じに保たれ、ハエの社会的なスペースも一定です。このアッセイのロバスト性は、異なるチャンバのサイズ、形状、および配向を用いて独立した研究所がWHの変異体によって表示された結果を再現することができるという事実によって示されます増加社会空間であるITE遺伝子（目の色素沈着に影響する^）、（1垂直三角形や水平の円を^、3の気流水平正方形）。

我々の結果はまた、我々は男性ではなく女性は、夜にはさらに離れていることを示しているように、社会的宇宙実験が行われた時刻を維持することは、結果の一貫性に不可欠であることを示しています。しかし、昼と夜の時間の間に見られる違いはハエの活動の違いによるものではない、と私たちは活動レベルが社会空間と相関されていないことを示す引数を議論します。

白変異体によって示されるように最後に、社会空間の決意に対する遺伝的基盤が存在する既に^1,3を説明し、我々はここに提示するハエの様々な近交系と野生キャッチ株との違い。

したがって、このアッセイは、優れたツールFを作りますまたは遺伝や環境要因の影響を研究します。

プロトコル

社内作成1.機器および試薬（その他の資料の一覧を参照してください）

1. 以前^{8に記載されているように} 、ショウジョウバエ冷たい麻酔装置を準備します。
2. 以前に^13を説明したようにフライアスピレーターを準備します。
3. 社会空間室とホルダーを準備します。
   1. 注文や社会空間室を作成するために、ガラス板やアクリルスペーサーを作ります。各社会空間室は、0.3センチ厚さで16.5センチ、8.9センチメートルのベースの高さと、右側の2つの三角形のアクリルスペーサー（（0.2センチ厚さで、17.6センチメートル17.6 cm）の2つの方形の窓ガラスで構成されてい）、および2つの矩形のスペース（0.2センチ厚さの1.5cmで9センチ）（ 図1A）。
   2. それは、図1Bのチャンバーと同じになるように、ガラスやアクリル社会空間室を組み立てます。これを行うには、そのような直角そのガラスの1平方ペインの上に平らな1三角形のスペーサを配置することによって開始します三角形スペーサーの四角枠のコーナーの一つと整列しています。次に、最初の三角形のスペーサーをミラーリング、正方形の枠の上に第二の三角形のスペーサを平らに置きます。
      注：あなたの手からの油や香りで作品を汚染しないように手袋を着用していることを確認します。
   3. カバーされていないウィンドウの側面に沿って、正方形の枠の上に平らな二つの小さな長方形のスペーサーを配置します。正方形の平面の上にアクリルスペーサーは現在、三角形のアリーナを形成すべきです。
   4. それは以下のガラスの元ペインの上に整列されるように、アクリルスペーサーの上にガラスの第二の正方形のウィンドウを配置します。
   5. 社会空間室を形成するために一緒にペインとスペーサを確保するために4つのバインダークリップを使用してください。ガラス板の内側にそれらを確保し、三角形の各スペーサの長辺の上に、隅1つのクリップを配置します。これらの同じ側面には、それらを固定し、長方形の各スペーサを介して、隣接する角にクリップを配置しますガラス板をサイド。
   6. 支持スタンドと社会空間室は作業面の上に、そのエッジ上に載っているようクランプが、直立位置に社会空間室を維持するようにフラスコクランプを組み立てます。
   7. 実験における各繰り返しのために、社会空間室と支持スタンドを組み立てます。
4. テストしたハエの登坂能力を確認するためにクライミングアッセイ応答装置を準備します。
   1. 以前に^{14,15に記載されているように} 、向装置を使用してください。
5. 白いベンチカバーで、白い背景の前に覆われた作業台の上に実験を行うことにより、均質な照明条件を確認してください。

2.実験の前にハエの準備

1. 標準ショウジョウバエ食品フライを含むボトルでハエを維持します。 12時間の明/暗サイクルで25℃でのインキュベーション室に保管してください。
2. Eの前に1〜2日xperiment、以前^{8に記載されているように} 、冷たい麻酔下で収集し、セックスのハエ。
   1. で-4℃の冷たい麻酔装置を冷やします。場所を50mlプラスチックチューブに飛びます。完全に不動になるためのハエのために、少なくとも5分待って、絶縁アイスバケット内の氷にハエを含むプラスチックチューブを沈めます。
   2. 冷たい麻酔装置のポリエチレンシートの上にハエを置きます。 RTで、女性から男性を分離するために実体顕微鏡を使用しています。標準のショウジョウバエを含むバイアル中で、グループで、ハエを維持するには、1バイアル当たり40ハエを超えない、食べ物を飛びます。
3. 二時間実験の開始前に、実験が行われる部屋の温度が24〜25℃の間で、湿度は約50％であることを確認してください。
4. 食品を含む新しいバイアルにハエを移し、実験が実行される作業面に2時間のためにそれらを配置します。
   注：これらのexperimenについてTS、使用ハエ株はキイロショウジョウバエ株であった：カントン特別またはカントン^{-S（CS）、1118} wのCsの_10（またはW - ^{1118ワット}はカントン-Sに10回を外部交配）、オレゴン州とサマルカンドハエは、私たちの研究室からのすべてでした株式^16; Elwoodのハエはロングアイランド、ニューヨーク、米国⁸に、ハンチントンのエルウッド周辺に2011年秋に採取しました。特に指定時離れて、提示された結果は、カントン-Sは、（赤の色合いで）飛んで得られました。

3.実験の実行

1. （ - 光の発症後数時間の時間 - Zeitgeber時間ZT 4の7に）午後12時と午後3時間の実験を行います。
2. ハエを転送するための社会空間室を準備します。
   1. あなたの体に最も近い長方形のスペーサを含む側で、作業台の上に平らな社会空間室を置きます。
   2. O削除あなたの体の最も近いNEクリップと長方形のスペーサ間約1cmの隙間を作成し、外側に1つの矩形のスペーサーをスラ​​イドさせます。
   3. テープとマーカーを使用して、性別、ひずみ、および繰り返し数と上隅に社会空間室にラベルを付けます。インナー三角アリーナの一部をカバーしていないテープを確実にするために注意してください。
3. 社会空間室にハエを転送します。
   1. 転送は、新しい空のバイアルに、そのバイアル含む食品から飛びます。吸引し、空のバイアルからハエや社会空間室にそれらを転送します。
      1. 吸引器の先端にハエを描画するために吸い込みます。社会空間室の長方形のスペーサ間1cmの隙間に先端を配置し、内側の三角形の場にハエを強制的に一貫性のあるレートで息を吐きます。
      2. すぐ内側の三角形のアリーナのベースを閉じて、元の位置に戻し、長方形のスペーサーをスラ​​イドさせ、背面にバインダークリップを配置します。
4. 実験作業が行われる場所とは別のベンチの上に位置してドキドキパッド、に、長方形のスペーサが下側にあるように直立社会空間室を開催しています。すべてのハエを確保するためにポンドを3回アリーナの底に落ちています。
   注：ハエが下に落ちていることを確認するために装置上で、安全なホールドを維持しながら、最小のチャンバーサイズ（ 図1D）から突き出アクリルスペーサーに、作業台の上に肘を強打によるものです。
5. タイマーを開始します。
6. 作業台の上に社会空間室を置き、直立それを維持する支持台と、フラスコクランプを使用しています。定規や社会空間室に対して平らに既知の長さのステッカーを置きますが、内側の三角形のアリーナのどの部分をカバーしていません。
   1. 水平に配置実験のために、支持スタンドにおける社会空間室を置かないでください。代わりに社会空間室は、作業面に平らに横たわっていました。
7. ハエが落ち着いているときは、通常約30分後、社会空間室の写真を撮ります。フレーム全体の内側三角アリーナ、定規、ラベルが含まれていることを確認してください。
8. 各遺伝子型および条件（理想的には3つの内部反復と3​​つの独立した反復配列）のための実験を​​繰り返します。

4.社会空間データの分析

1. ImageJの¹⁷で、次のマクロをインポート
   1. ImageJがここにあります：http://rsbweb.nih.gov/ij/。
   2. あなたは>更新メニューコマンドをマクロサブフォルダに、ImageJの/ pluginsフォルダに「Measure_Distances.txt 'という名前のファイルに以下のマクロを保存することにより、プラグインメニューの「測定距離」コマンドを作成し、ヘルプを使用することができます。」
   3. .txtファイルでコピー補足データで提供され、当初は³に掲載されたマクロ。
2. 画像をコンピュータにアップロードし、1影を開きますImageJのを使用して再。
   1. のステッカーのために（同じアプローチを写真の定規に1cmのマーク0 CMから線を描くことで、スケールを作成し、[分析]タブの下で、その距離では1センチスケールを設定するには、Setスケール機能を選択既知の長さ）。画像にスケールを適用する前に、グローバルオプションを選択します。
   2. 可能な限り、画像の残りの多くを除去しながら、それはハエのすべてを含むように[画像]タブの下にトリミング機能を使用して画像をトリミング。
   3. [画像]タブの下のTypeオプションから8ビットを選択して、画像が白黒にします。
   4. [画像]タブの調整オプションでしきい値の機能に行くことによって、画像からすべてのバックグラウンドノイズを除去します。各ハエの体は明らかに、画像内の他のマーキングせずに見ることができるように、コントラストを向上させるか、削除するには、スライダをドラッグします。ハエではないマーキングがある場合は、長方形ツールでそれらをキャプチャし、それらを削除。
   5. 設定[分析]タブで設定測定ツールを使用して測定。エリア、質量、重心のセンター、表示ラベルを選択します。次に、分析粒子はハエを表現するすべての黒点の番号付きリストを作成するには[分析]タブの下に備えて選択します。
      1. 使用している場合、粒子を分析します。セットサイズ0.01〜0.1（ピクセル単位を選択しないでください）​​。真円度0.00から1.00;ショーアウトライン。結果を表示し、マネージャに追加します。
      2. 各黒点（各粒子が）元の画像に番号付きリストを比較することにより、元の画像であるハエの正確な表現であることを確認してください。
         注：非常に接近しているいくつかのハエが一緒に一つの粒子としてカウントされている場合は、手動で二値画像上の2つのハエを分離するために白の線を引きます。
   6. EAから、CMで、距離を含む新しいリストを作成するプラグイン]タブにある第二のマクロオプションの下の一覧の距離マクロ - リストが選択されているが、最近傍を使用CH彼らの最近傍に飛びます。
3. ImageJのから最近傍距離をコピーし、スプレッドシートプログラムの欄に貼り付けます。
   1. 同じスプレッドシート上に各繰り返しからのデータのすべてをコンパイルし、遺伝子型および条件によって整理。
4. 統計ソフトウェアを用いてデータ解析を行います。この実験では、グラフパッドプリズム（MacOSXのためのバージョン6、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴカリフォルニア州、www.graphpad.com）は、一方向ANOVAおよびクラスカル・ワリス検定、Tukeyのとダネットポストホックテストを実施するために使用されました。
5. 距離の分布は、非パラメトリックな分布^1に従う 、データをボックスとTukeyのウィスカー（外れ値を排除する）として表されます。

5.クライミングアッセイ（コントロール動作）

1. 能力^{14,15,18を登る}テストハエのコントロールとしてクライミングアッセイを使用してください。
   1. 向装置を使用するように、3つの試験のC並列に実行されます。
2. 三つの異なる試験バイアル中の転送50〜100ナイーブハエ（前にテストされていないハエ）と、反対の場所で新鮮な空のバイアルで、向装置の下部にある¹番目^、3番目と最後のスロットにそれらをスナップ。
3. 装置の下部にある空のスロットに新鮮な、空のバイアルを置きます。
4. 実験を開始するために、すべてのハエを各チューブの底にあるように、装置を3回ダウンタップ。
5. 15秒のタイマーを起動（トップバイアルに到達するために3-7日の古いカントン-Sの〜100％のための十分な時間を- 図3Fを参照してください ）。
6. 一つのスロットによってトップバイアルを変位させるために、向流装置の上部をスライドさせます。
7. 底バイアル内のすべてのハエをもたらすために、ダウン装置をタップしてハエを収集します。
   1. 1 ^番目と2 ^番目のチューブ（または³番目と4 ^番目 、5 ^番目 と6 ^番目 ）までトップに達しなかったハエやトップバイアルに達したハエにそれぞれ対応します。
8. パフォーマンス指数（PI）を計算します。
   1. 各バイアル中のハエの数をカウントします。
   2. PIはアッパーチューブに登ることができるハエの割合です。
   3. PIの手段は、正規分布^1に従うと、データは平均値（SEM）の平均値プラスまたはマイナス標準誤差の列グラフとして表現されています。
      注：また、PIは低いバイアルの上部に到達することができるハエの割合として計算することができます（古いハエのために、5秒は、感染と非能力を登るの違いを定量化するのに十分な時間が古い12日に感染しています静止画像から定量化カントン-S：結果を参照してください）​​。その他にも、能力^19-22を登る定量化することが適切である驚愕誘発性の負の走地性、中性能の異なる尺度を使用してきました。

結果

ソーシャルスペースチャンバは、 キイロショウジョウバエの社会的行動を定量化するためのツールとして使用することができます。アクリルスペーサーとガラス板は、多くの潜在的な交絡手がかりが存在せずに安定したグループを形成することができるハエた2次元エリアを提供する内側三角アリーナを形成するために一緒にクリップされます。ハエが垂直アリーナに転送されると、それらはタップダウンさせて驚いている、と彼らは逃避行動することによって応答：負の走地性を。彼らはタイトなグループに強制的に、直立三角形の頂点に登るし、各他を形成し、アリーナを探索するために、さらに移動する時間が設けられています。 20〜40分後に、それらは移動を停止し、安定したグループが形成されています。各フライとその最近傍との間の距離は、それらの好適な社会空間の定量化を提供するために、画像から測定することができます。ハエは近い彼らは彼らの隣人に、より社会的であると考えられています。

飛ぶこと密度は、下の容量の点までチャンバー内の社会空間での役割を果たしていません。大きな垂直方向室で20〜70ハエの大規模なグループでは、社会...

ディスカッション

このプロトコルでは、社会的な空間の定量化のための詳細な手順を説明しました。実験が成功であることを確認するために、いくつかの重要な手順は次のとおりです。装置のクリーニングおよび設定するとき1）常に2）少なくとも一日前にハエが収集されていることを確認し、装置の内部チャンバから独自のオイルと香りを保つために、手袋を使用しますこれらの2時間の間に実験はハエを確保するために生鮮食品を含む新しいバイアルを提供する前に、3）2時間を冷たい麻酔の任意の潜在的な影響を低減するための実験に飢えていない、と自分自身を掃除している、4）、ハエが彼らに順応させます実験を行うときに、新しい環境、5）は、温度と湿度の条件を注意してください。 6）実験の実行中に社会空間室を乱さないようにしてください、そして7）日の同じ時間に実験を行う、好ましくZeitgeber時間ZT4の間、24〜25°Cおよび50％の湿度の間で一貫性を保つためにしてみてくださいそして、ZGT7。

、我々はそれが非常に厳しいグループにハエを強制し、その理想的な社会空間を分離し、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステレオズーム顕微鏡	ニコン	SMZ-645	フライハンドリングのための他の標準的なスコープは動作します
小さなペイントブラシ			ハエを押すために
ジャズミックス	フィ	ッシャー33545	他の標準的なショウジョウバエの食品は動作します
ミニアラームタイマー/ストップウォッチ
シャーピーペン
粘着テープ
中型バインダークリップ	チャンバーを一緒に保持するためのステープル:1-1 / 4 "(32mm)ミディアムクリップ5/8 "容量の
			ビ
ュレットクランプ	カロライナ	707362
デジタルカメラ	ニコン	707161クールピクス S8000	静止画を撮る
三つ折りボードと白いベンチカバー			、白い背景と均質な光を提供できる
小さな定規
ドキドキパッド			マウスパッドなら何でも機能します。
Prism 6	GraphPad Software株式会社	Prism 6 for Mac OS X	検定、一元配置、2次元分散分析を備えた統計解析ソフトウェアであれば、どれでも動作します

小さなSupportStandsカロライナ 写真のをスケーリングして。 t