私たちは、微生物のエクソ多糖類の同定と特性評価のための自動化されたモジュール式のハイスループット法を提示します。この方法は、分泌された多糖類の総量を分析するための迅速な事前選択と詳細な炭水化物フィンガープリントを組み合わせて、新たに分離された細菌株または全株コレクションの迅速なスクリーニングを可能にします。
方法論記事
自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって
この記事について
サマリー
要約
多くの微生物は、医療分野、食品用途または石油ベースの化学物質の代わりに重要な意味を持っている（EPS）、エキソポリサッカライドを生成し、分泌することができます。私たちは、種類や微生物によって産生されるEPSの量の高速で信頼性の高い分析を可能にする液体ハンドリングシステムで自動化する分析プラットフォームを記述する。それは、新規な天然の微生物エキソ多糖の生産を識別するために、高スループット（HT）で1日以内に、対応するポリマーの炭水化物フィンガープリントを分析することを可能にします。このプラットフォームを使用して、工学的手法で得られるかもしれない株コレクションならびに株変異体のライブラリーをスクリーニングすることができます。プラットフォームは、2つの主要な部分にプロトコルの分離を可能にするモジュール式のセットアップを有します。 viscositの半定量的分析：まず、異なる多糖類検出モジュールを組み合わせた自動スクリーニングシステムは、あります遠心分離工程、アルコール沈殿、フェノール - 硫酸酸変換を介して、総炭水化物含量の決意を介してポリマー形成の分析を介してY形成。ここでは、1回あたり384株をスクリーニングすることが可能です。紫外線及びエレクトロスプレーイオン化イオントラップ検出（と結合された超高性能液体クロマトグラフィーを介して完全な単量体組成物の分析：第二の部分は、2つの重要なモジュールを組み合わせることにより、第1の部分で識別された選択されたすべてのEPSの生産のための詳細な単糖分析を提供しますUHPLC-UV-ESI-MS）と発色に結合されている酵素的酸化を介して、ポリマーの置換（ピルビン酸ケタールの存在）などのピルビン酸の決意。このスクリーニングプラットフォームのすべての分析モジュールは、様々な方法で組み合わされ、個々の要件に合わせることができます。さらに、それらはすべて手動で処理または液体ハンドリングシステムを用いて行うことができます。これにより、スクリーニングナンプラーTFORMは、様々なEPSを識別するために巨大な柔軟性を可能にします。
概要
微生物エキソポリサッカライド（EPS）は、様々な生物学的機能を果たすポリマーの構造的に非常に多様なグループです。これらは、通常単量体（糖、糖誘導体、糖酸）異なる種類の、これらのモノマー及びそれらの置換基との間の結合によって区別される複雑な反復単位、から構築されます。微生物多糖類の構造的多様性は、食品1、化粧品2,3、建築化学4または水処理5のようなさまざまな分野での応用を可能にするこの分子クラスのメンバーにかなり異なる特性を付与します。さらに、これらのバイオベースと、このような持続可能なポリマーの適用分野を拡張するには、新規の天然の微生物多糖類の識別だけでなく、構造変異体の工学は有望なアプローチを表します。どちらにしても、高速スクリーニング方法は、迅速にtheiのための微生物株の膨大な数をスキャンするために必要とされますRポリサッカライドの形成、およびその製品を分析します。したがって、我々は最近、単量体組成物6の識別を含む天然の単離または操作された株の変異体からの微生物多糖類生産の分析のため、96ウェルHT-スクリーニングプラットフォームを開発しました。
500天然の単離は、私たちはEPSを（データは示していない）を生成することができるように単離された株の約10〜20％を同定することができ〜の最初のスクリーニングラウンドのためにこのプラットフォームを適用します。これは、分析した株の80〜90％が適用された条件下で、EPSを産生しなかったので、詳細な炭水化物フィンガープリントのさらなる解析が必要ではなかったことを意味します。単量体組成物のこの高度な識別は、特に、データ分析のために、EPSの製造における陽性株を同定するための迅速前スクリーニング方法時間のかかるプロセスであるため、大幅に効率を向上させるであろう。また、試薬、UHPLC-UV-ESI-MSでの消耗品、測定時間を短縮することになります。さらに、異なる分析モジュール、一方で、この方法は、信頼性の高いする平行でつ以上の96ウェルプレートの手動操作を複雑一方であり、そのようにする方法の完全な可能性を制限しています。これらの理由から、我々は、自動化スクリーニングプラットフォームを開発することを決定しました。したがって、我々は、吸光度測定に基づいて、総糖含量の完全に自動化された高速検出方法で既存の炭水化物フィンガープリント技術のモジュラー形式を組み合わせます。
フェノール-硫酸酸方法は依然として細菌および植物多糖類7,8の合計炭水化物含量の高速決意のための選択の方法を表します。この方法は、最初の96ウェルプレート10,11に。デュボアら 9、異なるアプリケーションおよびサンプルサイズのために適合され、小さなスケールのためにしました。 PheのNOL - 硫酸酸方法は、全てのモノマー、オリゴマーおよびサンプルのポリマー炭水化物をsummating、一つの値による総炭水化物含有量を測定します。
アカウントにこれらの側面を取って、適当な培養培地の選択は、この方法を適用することが不可欠です。オリゴマーまたは酵母エキスなどの高分子炭水化物化合物を含む複合メディアが変更されたポリマー含有量につながる可能性があるため、厳密に避けるべきです。また、糖の多量の株の培養のための炭素源として使用されます。培養プロセスからの残りの炭水化物、高レベルの負のEPS量の測定を妨害する可能性があります。
したがって、定義されており、純粋な糖の使用が推奨されます。我々の実験では、細胞の培養にグルコースを使用していました。培養後の残りのグルコースをゲル濾過によって還元し、グルコースアッセイによって測定しました。最後に、グルコース当量多糖類のSは、フェノール - 硫酸酸法を用いて検出された総炭水化物含量のゲル濾過後に残っているグルコースを差し引くことにより計算しました。フェノール - 硫酸酸法と組み合わせたゲル濾過およびグルコースアッセイは、信頼性の高い結果を保証し、私たちの最初の、完全に自動化された検出システムであることが可能です。
沈殿および粘度上昇の観察：二つの新しい分析モジュールは、EPS-検出系からの情報の量を増加させるための自動化スクリーニングプラットフォームに含まれていました。
多くの異なるEPS - 例えばサク、キサンタンおよび結腸酸12 -砂糖位置C4とC6上の非炭水化物ピルビン酸ケタールで修飾することが報告されています。 （ちょうどスクシニル半エステル、ウロン酸など）これらのピルビン酸ケタールは、物理プロペに、したがって、ポリアニオン性質に寄与し、二価陽イオンブリッジ13を介して相互作用することによってポリマーのrties。これらの特定のポリマーを同定するためにピルビン酸の決意は、もう1つの追加の分析モジュールとして設立されました。これは、多糖類の置換基およびそれらの潜在的な巨視的な性質についての情報を増大させます。
すべてのモジュールを組み合わせることにより、異なるEPSの識別だけでなく、EPSの生産者の迅速かつ効率的な決意を可能にします。このアプローチによりスクリーニングプラットフォームは、2つの主要部分（ 図1）に分けることができました。すぐに株を生産EPSを事前に選択するための自動化スクリーニング（パートI）ワークフローは完全に自動化が起こる（ 表1）内。炭水化物フィンガープリント分析（パートII）が定量的に事前に選択された株によって産生さEPSの単量体組成を決定します。これにより、データ分析は、大ひずみコレクションのスクリーニングを最適化するために最小化されました。この一つの自動スクリーニングの実行で一日あたり768株の一日あたりの可能な2ランで384株を分析する可能性を提供しています。さらに、炭水化物フィンガープリント分析は、すべての識別されたEPSの、さらに詳細な概要を説明します。これは、有向分析とEPSの既に記載された化学構造に比べてほんのわずかに異なるEPSの変異体または完全に新しいものの同定を可能にします。
プロトコル
1.自動スクリーニング
注：すべての液体処理手順は、ロボット液体ハンドリングシステムで行われています。ロボットワークテーブルの構成は、 図2に示されている。特に断りのない限り全ての消耗品は、貯蔵カルーセルに格納されています。すべての自動スクリーニングは、ロボットマニピュレータ（RM）は消耗品を移動させる手順については（ディープウェルプレート（DWP）;マイクロタイタープレート（MTP）;ポリメラーゼ連鎖反応プレート（PCR-プレート）など）カルーセル位置の間（CP ）とワークテーブル位置（WTP）。すべてのピペットのステップは、それが特に言及されている場合を除いて、96チャンネルピペットアームを用いて行われます。すべてのステップは、プログラムされ、96ウェルフォーマットで自動的に実行されます。
- ひずみ栽培（ 図1中のタスク1）
注：株を生成する推定上のEPSの接種および無菌状態（層流）の下での培養プレートのシールを処理します。自動化高速スクリーニングは、実行ごとに4つの96ウェルプレートを処理することができます。いくつかの属の異なる株は、すでに6を試験しました。- 手動で96ウェルグリセロールストックプレートから96ピンレプリケータで前培養（1ミリリットルEPSメディアDWP中）を接種します。蒸発を避けるために、通気を可能にする通気性封止フィルムでプレートを覆います。 MTP-シェーカー上で1000rpmで48時間、30℃でインキュベートします。
- 50μlの12チャンネルマルチピペットを用いて前培養と同様の条件下でインキュベートする前培養物10μlを移すことによって、主培養（DWPで990μlのEPSメディア）を接種します。成長しないすべての株をメモしておいてください。
- ロボットワークテーブルとストレージカルーセルの調製
- ストレージカルーセル内の正しい位置に材料や機器に記載されているすべての消耗品を提供します。目のための100の希釈：1のためにDWPの各ウェルに二重蒸留水（のddH 2 O）の990μLを追加電子グルコースアッセイ（カルーセル位置4-1〜4-4）。
- ワークテーブルの位置（WTP）11でのddH 2 Oの150ミリリットルを含む250ミリリットルトラフを配置します。
- 50mlのグルコースアッセイ試薬ミックス（4 500mLのmMリン酸カリウム（pHは5.7）を1.5mlの50mM 2.2-azinobis-（3ethylbenzthiazoline）-6-スルホン酸2mlの100 Uグルコースオキシダーゼを含む250 mlのトラフを堆積位置WTP 1-2で10μlの千U西洋ワサビペルオキシダーゼおよび42.49ミリリットルののddH 2 O）。
- 位置WTP 3-1,3-2で2つの空のダミーF-底のMTPを置きます。
- 、通気性封止フィルムを取り外し1-1〜1-4カルーセル位置（CP）でメインの文化を割り当て、自動ロボットプログラムを起動します。
- ゲルろ過プレートの平衡化
注：このスクリーニング中に使用されるゲルろ過プレートを再利用することができます。このために、20℃で2分間、2000×gでのddH 2 O150μlで3回ずつ洗浄し、遠心分離器。その後、4で保存20％エタノール75μlのとC°とシリコンキャップマットでカバー。- WTP 3-3に5 mMの酢酸アンモニウム緩衝液（pH 5.6）を用いて250mlのトラフ（CP 5-7）を移動させます。
- 4-4にWTPs 4-1にカルーセルからゲルろ過プレート（CP 1-6、1-7、2-6と2-7）を転送します。
- 吸引酢酸アンモニウム緩衝液150μlを200μlのチップを用いて平衡化のために、すべてのゲル濾過プレートの中心に分配します。
- （20℃、2000×gで2分間）遠心機にゲル濾過プレートを転送します。
- ステップ1.3.3、1.3.4と1.3.3を繰り返し、ワークテーブルに戻って、プレートを転送します。ゲル濾過プレートの脱水を避けるために、遠心分離工程を繰り返さないでください。バックカルーセル内で平衡化したゲルろ過プレートを保管してください。
- 遠心分離（ 図1中のタスク1）を介して細胞除去
注：スクリーニングアプローチ内の低バックグラウンドを確保するために、遊離の細胞を分析しますEPSは、上清のみを含有し、培養後、遠心分離を介して細胞を除去します。- 遠心分離（20℃で30分間、4300×gで）にカルーセル（1-1〜1-4）から主培養DWPを転送します。
- 主培養を処理するためにRMを経由してワークテーブルを準備します。
注意：手順1.4.2については、システムが常に並列に二つのプレートを処理した後、次の二つのプレートを持つすべてのステップを繰り返す1.4.3.5します。- 濾過前の沈殿のためにWTP 4-1及び5-1にCP 6-1,6-2からのMTPを移動します。 WTP 4-2及び5-2にCP 7-1及び7-2からのpH指示薬のMTPを移動します。
- WTP 4-3及び5-3にCP 2-1,2-2からの集電板と一緒に濾過プレートを転送します。 WTP 4-4及び5-4に遠心分離機から主培養DWP 1-1,1-2を再配置します。
- 分析モジュールを準備します。
注意：先端のストレージ（位置2-1〜2-4）から200μlのヒントをください。消耗を低減するために、ステップ1と同じチップセットを使用します.4.3.1。- 濾過プレートにメイン培養上清180μlのを転送します。メイン培養上清から吸引し、150μlのおよびpH指示薬プレートにろ過し、100μlの前に沈殿のためのMTPに50μLを分注します。
注：pHを決意は必須ではありません。しかしながら、マルチステップピペットで各ウェルに12.5 mlのメチルレッド指示薬（50mLのエタノール中の50 mg）を添加した後には、高酸産生株を示します。この情報は、より高い緩衝液濃度を有する第二のスクリーニングのために、例えばさらなる栽培用（低pHで）成長阻害を回避するのに有用であり得ます。さらに、低いpHが酸性環境に対して細胞を保護するためにEPS産生を誘導することができます。 - 第二主培養プレートのための手順を繰り返し1.4.3.1。新鮮なチップセットを使用してください。
- 遠心分離機に濾過プレートを移動し、carousにホームポジションに戻し、ワークテーブルから他のすべてのプレートを取り外しますエル。
- 第三及び第四の主培養プレートのために1.4.3.3へのステップ1.4.2.1を繰り返します。
- 彼らはカルーセル（粘度調整）に戻って転送されたとき、メイン培養プレートの遠心分離後の沈殿を減少させたショーそれらの発酵ブロスのノートを取ります。
- 濾過プレートにメイン培養上清180μlのを転送します。メイン培養上清から吸引し、150μlのおよびpH指示薬プレートにろ過し、100μlの前に沈殿のためのMTPに50μLを分注します。
- 完全な細胞除去のための96ウェル濾過（ 図1中のタスク2）
注：濾過工程がスクリーニングに含まれる粘性の発酵ブロスからの細胞の除去を確実にするために。- 20℃で10分間3,000×gで濾過プレートを遠心分離し、バックそれらのカルーセルホームポジションにそれらをもたらします。
- ゲルろ過プレートを準備します。
- 20℃で2分間千×gで遠心分離し、スピンにカルーセルから平衡化したゲルろ過板を移動します。
- 44にWTP 4-1に遠心分離機からゲルろ過プレートを転送します。
- 新鮮なゲルを移動しますWTPへのCPから（3-1〜3-4）-filtrationの集電板（5-1 5-4）。
- 新鮮な集電板（5-4 5-1）に（4-4 WTP 4-1）平衡化したゲル濾過プレートを転送します。
- 位置5-1と5-2を除くワークテーブルをクリーンアップし、4-1を配置する位置5-1を移動します。
- ろ液を処理するためにRMを経由してワークテーブルを準備します。
注：システムを1.6.3.5にする手順1.5.3並列に二つのプレートを処理し、次の二つのプレートを持つすべてのステップを繰り返します。- WTP 3-3及び3-4にカルーセル（4-6及び4-7）から50μlのヒントを移動します。
- ワークテーブル（4-4及び5-4）に3-2にCP 3-1から濾過プレートを転送します。
- CP 4-1,4-2からのWTP 4-2及び5-1にグルコース消費の検出のために：（100希釈1）DWPを再配置します。
- WTP 4-3及び5-3にCP 8-1,8-2からろ過した後、2回目の沈殿のためにMTPを移動します。
- 集電板から濾過プレートを持ち上げS（WTP 4-4及び5-4）とWTP 3-1及び3-2に移動します。
- 濾過後の分析モジュールを準備します。消耗を低減するために、ステップ1.5.4.1と1.5.4.3のための同じチップセットを使用します。
- 50μlのヒントを取り、DWPにろ液の10μlのアリコートをピペット：グルコースアッセイ（グルコース消費）のために（1 100希釈）。
- ピペットで平衡化したゲル濾過プレートの中心までのろ液の35μlを、沈殿のために使用されているMTPに50μlの。
- 繰り返しは、第二の濾過プレートのための1.5.4.2に1.5.4.1を繰り返します。
- 遠心分離機にゲルろ過プレートを移動し、カルーセル内のホームポジションに戻ってワークテーブルから他のすべてのプレートを移動します。
- 繰り返しは、第3および第4の濾過プレートのための1.5.4.4に1.5.3.1を繰り返します。
- すべてのプレートの貯蔵後の後ろにフィルタープレートに残差によって示されるように高粘性上清のカルーセルテイクノート、（高V IN濾過工程の後iscosity制御）。ろ液の欠如は、以下の分析モジュール内の偽陰性の結果につながることができます。
- 96ウェルのゲルろ過を介したグルコースの除去（ 図1中のタスク3）
- 20℃で2分間1000×gでのゲル濾過プレートを遠心。
- ゲルろ液を処理するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備します。
- WTP 3-3及び3-4にカルーセル（5-3及び5-4）から50μlのヒントを提供します。
- ゲルろ過した後、残りのグルコースの決意についてWTP 4-1及び5-1にCP 9-1及び9-2からの2のMTPを移動します。
- フェノール - 硫酸酸法ではWTP 4-2及び5-2にCP 8-5及び8-6からの2のMTPを移動します。
- WTP（4-3及び5-3）に遠心分離機から2ゲルろ過プレートを転送します。
- 集電板（4-3及び5-3）からゲル濾過プレートを持ち上げ、WTP 3-1及び3-2に移動します。
- ゲルろ液を処理するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備します。
注：消耗を低減するために、使用するのと同じチップセットの手順1.6.3.1と1.6.3.2のために。- ゲルろ過（1:10希釈）した後、残りのグルコースを検出するために、50μlのヒントを取り、新鮮なMTPにのddH 2 O（WTP 1-1）を25μlを移します。 ddH 2 O（WTP 1-1）の吸引物20μlを、空気の5μlを、ゲルろ液を5μlと同じプレートに分注します。
- フェノール - 硫酸酸法ピペットMTPにゲルろ液の20μlのために。
- 繰り返して第二のゲルろ過液プレート用の1.6.3.1と1.6.3.2を繰り返します。
- 彼らのカルーセルでホームポジションに戻ってワークテーブルからすべてのプレートを転送します。
- 第三及び第四のゲル濾過プレートのために1.6.3.4へのステップ1.6.2.1を繰り返します。
- グルコースアッセイモジュール
- グルコースなどを実行するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備しますいう。
- WTP 5-1及び5-4にCP 4-1と4-4から：（100希釈1）DWPを再配置します。
- WTP 4-1及び4-4にCP 9-5及び9-8からすべてのMTPを移動します。
- 200μlのヒントを取り、180μlと10倍の量を吸引し分配することによって希釈を混ぜます。その後、MTPに50μlのアリコートをピペット。
- （1：100希釈）を繰り返して、すべての4つのDWPsための1.7.1.2と1.7.1.3手順。
- ワークテーブルからすべてのDWPs（5-4 5-1）を削除します。
- グルコースアッセイを開始するためにワークテーブルを準備します。
- WTPにゲルろ過転送CPからすべてのMTP（9-4 9-1）（5-1 5-4）した後、残りのグルコースの決意のため。
- 3回以下のグルコース濃度の50μlの（90、45、18、9、4.5、1.8、0.9、0.45および0ミリグラム/ L）を含む - - グルコースアッセイキャリブレーションプレートを移動CP 9-9からWTP 3- 3。
- 200μlのヒントや吸引Wからのグルコース測定試薬ミックス50μlのを取りますTP 1-2は、第一のアッセイを開始します。インキュベーター（30分間150rpmで30°C）に、MTPは移動します。
- プレート間で5分遅れでプログラムを起動するためにタイムスケジュールを設定します。
- インキュベーションの30分後、418および480 nmでMTPリーダーとレコード吸光度をインキュベーターからプレートを移動させます。
- 測定後、カルーセルでのホームポジションにプレートを移動させます。
- グルコースなどを実行するためにロボットマニピュレータを経由してワークテーブルを準備しますいう。
- 降水の調製
注：EPSの生産は第1の濾過工程の前及び後、2-プロパノールと上清の沈殿を行う評価するために。また、最初にではなく、2回目の沈殿中の繊維およびフレークの観察によりフィルター膜上にポリマーの吸着を評価します。
注意：厳密にヒュームフードの下で引火性液体として2-プロパノールを処理します。- （CP 6-1 6-4と8-1〜8-4）カルーセルからすべての沈殿プレートを取り外します。そして、追加12.5 mlのマルチステップピペットで各ウェルへ2-プロパノールの手動150μlの。
- シリコーンキャップマットを持つすべてのMTPを覆い、室温（RT）（900 rpmで10分）に振ります。視覚EPS産生を示すこと振った後、繊維またはフレーク形成を観察します。
- フェノール - 硫酸酸法
注意：ヒュームフードの下で濃硫酸-酸とフェノールを処理します。フェノールは、腐食性および変異原性物質です。- フェノール - 硫酸酸法では、カルーセルから（CP 8-8へ8-5）プレートを取り外し、液体ハンドリングシステム（〜8ポジション4）に入れます。 （; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05; 0グラム/ L 10）三重で異なるグルコース濃度を20μlと校正用プレートが含まれます。
- ddH 2 Oで1位の廃棄物容器、2位の200μlの先端ボックスと110ミリリットルのフェノール-硫酸酸と250ミリリットルトラフを（新たミリリットルフェノールwith18.3氷5％（w / vの上に用意）を配置濃および91.7ミリリットル。sの3位のulfuric酸）。
- 300μlのヒントを8チャンネルピペットを使用し、全てのプレートの各行にフェノール - 硫酸酸180μlのを転送します。
- 蓋を持つすべてのMTPをカバーし、（900rpmで、室温で5分間）振盪することによって、それらをミックスし、呈色反応のためのオーブンで80℃で35分間、それらをインキュベートします。ヒュームフードの下で冷却した後、480 nmの吸光度を測定します。
- EPSポジティブ上清（ 図1のタスク4）の選択
- EPS生産の評価のために、陽性（粘度調整2.6.1および2.6.2、ポリマー2.6.3の検出、グルコース同等2.6.5）のような3つの条件のうち少なくとも二つを満たす自動スクリーニングからこれらの株を選択します。さらなる処理のための新しいMTPに陽性ヒットから残りのろ液を移します。
注意：プレートを、それらが少なくとも1週間-20℃で保存することができるアルミニウムシーリングフィルムで覆われている場合。その時間内にdetermina炭水化物指紋化を行う必要があります。
- EPS生産の評価のために、陽性（粘度調整2.6.1および2.6.2、ポリマー2.6.3の検出、グルコース同等2.6.5）のような3つの条件のうち少なくとも二つを満たす自動スクリーニングからこれらの株を選択します。さらなる処理のための新しいMTPに陽性ヒットから残りのろ液を移します。
2.炭水化物指紋
注：炭水化物フィンガープリントのためのすべての手順を手動で実行されています。
- ポジティブ上清のゲル濾過（ 図1における作業5）
注：自動スクリーニングから残されたろ液が存在しないようにゲルろ過が必要です。減少浄化効率以上35μlの結果の容量を持つゲルろ過。- 12.5ミリリットル多段階のピペットを用いて、すべてのウェルに酢酸アンモニウム緩衝液150μlのを分配することによって、ゲル濾過プレートの平衡を準備します。
- （20℃、2000×gで2分間）遠心機にゲル濾過プレートを転送します。
- 繰り返しは2.1.1、2.1.2と再び2.1.1を繰り返します。さらに、使用前に20℃で2分間1,000×gで遠心分離ゲルろ過プレート。
- ピペットろ液の35μlの中へ12チャネル50μlのピペットを用いてゲルろ過プレートの中心。
- 20℃で2分間千×gでゲルろ過プレートを遠心した後、集電板から持ち上げます。
- 加水分解の前にグルコースアッセイの準備：12チャンネル50μlのピペットを用いてゲル濾過液ののddH 2 Oおよび5μlの45μlのを追加することで1:10希釈を行い、シリコーンキャップマットとのMTPをカバーしています。
注：ポリマーのグルコース値の正しい決意するために、加水分解前のグルコース含量を測定し、加水分解工程の後に定量したグルコース量から差し引きます。 - 加水分解の前にピルビン酸アッセイを準備：各ウェルにのddH 2 O、ゲル濾過液の転送5μlと95μlを添加し、シリコンキャップマットでMTPを密封するために12チャンネル200μlのピペットを用いて1時20希釈を行います。
- 96ウェルマイクロ加水分解（ 図1中のタスク6）
注：ヒートアップ使用する前に、少なくとも1.5時間、121°Cまで（砂浴を含む）インキュベーションオーブン。特別なクランプ装置は小規模な加水分解工程中の蒸発を避けるために開発されました。- 新しいPCRプレートを取り、12チャンネル50μlのピペットを用いてゲル濾過液を20μlを移します。
注意：トリフルオロ酢酸は腐食性の酸と有毒です。アンモニウム溶液は腐食性があります。唯一のヒュームフードの下で両方の化学物質を扱います。 - 各ウェルに1.25ミリリットルマルチステップピペットで4 Mトリフルオロ酢酸の20μLを加えます。その後、熱可塑性エラストマー（TPE）キャップマットでPCRプレートをカバーし、特別なクランプ装置でPCRプレートを配置します。
- クランプ装置を10回反転介し溶液を混合。遠心分離機でPCRプレートを入れて、底にすべての液体を収集するために2分間2000×gでスピン。 PCRプレートは、バッククランプ装置に入れて、ネジでデバイスを固定します。
- 置き予熱した砂浴中でデバイスをクランプ固定し、121℃で90分間インキュベートします。
- 砂浴からクランプ装置を取り外し、それを室温まで冷却しましょう。
- ネジを外し、ウェルの底にすべて凝縮物を収集し、キャップマットの除去中に交差汚染を防止するために、2分間2000×gで遠心分離で再びスピン。
- 約にpHを調整するために3.2％のアンモニア溶液を追加します。 8 12チャンネル200μlのピペットを使用して。 TPEキャップマットでPCRプレートを覆い、クランプ装置を使用して手動でそれを振ります。
- 中和した後、2分間2000×gでPCRプレートを遠心します。
- 新しいPCRプレートを取り、12チャンネル50μlのピペットを用いてゲル濾過液を20μlを移します。
- ハイスループット-1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン（ 図1のタスク7）炭水化物の（HT-PMP）-derivatization
- 転送12チャンネル50μlのピペットを用いて、新鮮なPCRプレート中で中和加水分解物25μlの。
注：アリコートを取った後、neutrをチェック1.25ミリリットルマルチステップピペットで12.5μlのフェノールレッド指示薬（5 mlの20％エタノール中の0.05グラムのフェノールレッド）を添加することを介して、加水分解プレートの残りの液体のalization。ピンク色液（pH 8）に変わりはありませんすべてのウェルが正しく誘導体化されていません。 - 75μlの誘導体化試薬ミックス（125ミリグラムPMP、7ミリリットルのメタノール、3.06ミリリットルののddH 2 O、および438μlの3.2％のアンモニウム溶液）を追加し、TPEキャップマットでプレートをカバーしています。
- 底にすべての液体を蓄積するために2分間、2000×gでクランプ装置遠心分離機プレートでPCRプレートを振盪した後。
- 誘導体化場所については100分間、70℃でPCR-サイクラーでPCRプレートを20℃まで冷却しました。
- 12チャンネル50μlのピペットを使用して、新しいMTPに20μlのアリコートを転送します。そして、12チャンネル200μlのピペットを使用し、各ラインに130μlの19.23ミリモルを酢酸（0.962ミリリットル1 M酢酸+ 49.038ミリリットルののddH 2 O）を追加します。 aspirat経由で直接混ぜますると（最低6回）調剤およびMTPの集電板と0.2μmのフィルタープレートにすべての液体を移します。
- 遠心分離板（5分間千XG）は、フィルタープレートを取り外しシリコーンキャップマットでMTPを密封し、炭水化物フィンガープリント14の決意のためUHPLC-UV-ESI-MSにMTPを配置します。
- 転送12チャンネル50μlのピペットを用いて、新鮮なPCRプレート中で中和加水分解物25μlの。
- グルコースアッセイの調製
- ddH 2 O45μlの12チャンネル50μlのピペットを用いて中和された加水分解物の5μLを加えることを経由して1:10希釈を行い、シリコーンキャップマットとのMTPをカバーしています。キャリブレーションのために使用される新しいMTPに3回50種類のグルコース標準μlの（500、250、100、50、25、10、5、2.5および0μM）を追加します。
- 12チャンネル50μlのピペットを用いて、グルコース測定試薬ミックス（レシピstep1.2.3）の50μLを加えます。その後、シリコンキャップマットでプレートをカバーし、MTP-インキュベーター内で30分間、30℃、400rpmでインキュベートします。
- 直接インキュベーション後、MTPリーダーで418と480 nmでMTP-リーダーで読み取った吸光度を作ります。ステップ2.6.4で実行されるようなグルコース濃度の計算のために線形キャリブレーションを行います。
- ピルビン酸アッセイの調製
- 12チャンネル200μlのピペットを用いて、1：20希釈を行います。各ウェルにのddH 2 Oおよび転送に中和加水分解物の5μlに95μlを添加します。シリコンキャップマットでMTPをカバーしています。
- ピルビン酸アッセイ試薬ミックスの100μLを加える（3ミリリットル1 mMのN - （カルボキシメチルアミノカルボニル）-4.4'ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（DA-64）、300μlの10 mMのチアミンピロリン酸、60μlの100 mMの塩化マグネシウム六水和物2.4 500mLのmMのリン酸カリウムパファー液（pH 5.7）、30μlの100 Uのピルビン酸オキシダーゼ、12μlの千U西洋ワサビペルオキシダーゼと12チャンネル200μlのピペットを用いて24.19ミリリットルのddH 2 O）。
- シリコンキャップマットAでプレートをカバーND 37℃で30分間150rpmでインキュベートします。直接727および540 nmでMTPリーダーでインキュベーション対策吸光度の後。
- 自動化されたスクリーニングおよび炭水化物フィンガープリントのすべての結果の評価。
- 主培養プレートを遠心分離し、カルーセル（粘度制御ステップ1.4.1）に戻って格納された後に沈降を減少ショーこれらのサンプルをメモしておいてください。ペレットの形成を示さないサンプルは、（自動スクリーニングのための基準1）陽性です。
- 濾過工程（高粘度制御ステップ1.5.4.6）の後、フィルタープレートに残差により示されている高粘性上清、に注意してください。ろ液の欠如は、以下の分析モジュール内の偽陰性結果につながることができます。フィルタウェルに培養上清を維持するサンプルは（も自動スクリーニングのための1を基準）陽性です。
- 視覚インキュベーション後の繊維またはフレーク形成を観察します。目のようにメモを取ります多糖類を示しています。 （ - ）と降水量を評価しません。 （++）を有する繊維またはフレーク（+）とし、高い降水量の低い降水量。また、最初にではなく、2回目の沈殿（自動スクリーニングのための基準2）に、繊維およびフレークの観察を経てフィルター膜上にポリマーの吸着を検出します。
- グルコース濃度の計算のための線形キャリブレーションを実行します。
この式の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 - 5〜0.1グラム/ Lのグルコースとの間の直線キャリブレーション（濃度以上の吸収）を実行します。加水分解されたポリマーのグルコース同等の計算とパラメータ以下により評価：グルコース当量：> 700 mg / Lで=正を。正推定される300〜700 mg / Lで=。 EPS形式の点で<300 mg / Lで=負イオン（自動スクリーニングのための基準3）。
この式の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 - HT-PMP法で決定すべての炭水化物を定量化します。すべての数量をまとめると次のように評価する：> 300 mg / Lで（正）; 150から300 mg / Lで（推定正）と<150 mg / Lで（ネガティブ）。
- ピルビン酸濃度の計算のための検量線の直線性（100、50、25、10、5、2.5、1、0.5および0μM）を行います。上清中の残りのピルビン酸を除外するには、加水分解前のピルビン酸含有量を介して加水分解後のピルビン酸含有量を補正します。
このequatの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。イオン。
結果
フェノール-硫酸酸法の検証は0.9998の決意（R²）（ 表2）の係数との良好な結果を示しました。 5グラム/ Lの濃度の変動係数（CV）および正確性については5.3％（CV）および6.1％の誤差と0.25グラム/ Lの標準のための1.8％と2.2％の誤差が、より低い性能と良好な性能を示しました（バイアス）。
両方のピルビン酸アッセイ検量線の決意（とと行列なし）の係数は150μM（ 表3）のキャリブレーション範囲の> 0.9999でした。最高と最低のキャリブレーションレベルに対する変動（CV）の係数は<4.6％であり、精度がより少ない3.9％の誤差で完全な較正範囲にわたって非常に良好な性能を示しました。従って、加水分解工程からの行列は、MEASすることが可能な酵素アッセイに影響を示しませんでしたUREピルビン酸加水分解の前後。
表4は 、成功したスクリーニングプラットフォームを用いて同定3つの例示的な新規株の詳細な結果を示しています。表の左側の部分は、粘度形成、ポリマー製造および詳細炭水化物指紋分析のための評価パラメータとして使用された完全な加水分解からのグルコース等価に関する自動スクリーニングモジュールの結果を表示します。較正された糖だけでなく、未知の糖、二量体および置換基に基づいて、炭水化物フィンガープリントは、表の右側部分に示されています。この情報を用いて単量体組成を計算し、既知のポリマー構造と比較することができます。また、興味深いの単量体組成物及び希少糖質のための標的スクリーニングを行うことができます。
マイクロの高性能スケールの加水分解およびHT-PMP-誘導体化は、我々の以前の研究14で実証されました。さらに、様々な属のためのゲル濾過及び炭水化物フィンガープリントの検証は、他の刊行物6に記載されています。要するに、そのモジュラー構造のスクリーニングプラットフォームは、簡単に変更することができ、ユーザの個別の要件に適合しました。プラットフォームの自動スクリーニングは8倍より高いスループットを可能にし、信頼性の高い結果を提供します。ピルビン酸アッセイのような新規の分析モジュールを統合することができ、炭水化物フィンガープリント分析と組み合わせて、彼らは、識別されたEPSについての非常に詳細な情報を提供します。両方のわずかに変更され、完全に新規のEPSバリアントを検索するときに、これにより、スクリーニングプラットフォームが不可欠です。
図1：モジュラーhの全体的なスキームIGH-スループットエキソポリサッカライドのスクリーニングプラットフォーム。自動スクリーニングは、最初の3つのタスクが含まれています。細菌を96ウェルプレートで培養した後、細胞を遠心分離（タスク1）及び96ウェル濾過（タスク2）によって除去されます。次に、増殖培地からの残りの単糖を、96ウェルのゲル濾過（タスク3）を介して除去されます。サンプルを含むEPSは、スクリーニングプラットフォームの炭水化物フィンガープリントは、最後の3つのタスクを含むタスク4.で評価されます。タスク2からの正のヒットの残りのろ液は、炭水化物フィンガープリントは、HT-PMP法（高スループット1-フェニル-3-メチルを介して分析することができ、タスク6で加水分解した後、タスク5のゲルろ過液のための基礎を提供します-5-ピラゾロン、タスク7）。すべてのタスクが異なる分析モジュールおよび/ または粘度調整が続いている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
：FO小娘= "jove_content" 
図2：スクリーニングプラットフォーム用ロボットのワークテーブルのセットアップの両方の液体処理ロボットのワークテーブルのレイアウトが示されている：（A）ロボット液体ハンドリングシステムと（B）液体ハンドリングステーション。 （A）のセットアップは、二つの位置（ポジション1-2 1-1）、4箇所それぞれに4箇所（位置2-1〜2-4）と3つのマイクロプレートキャリアと使い捨てチップ用のキャリアとマイクロキャリアで構成されてい（5-4 4-4及び5-1に位置3-1〜3-4、4-1）。また、21マイクロタイタープレートのための7ディープウェルプレート（DWP）と4つのホテルのキャリアのための5つのホテルのキャリア（1〜5）各（6-9）それぞれとストレージカルーセルがあります。液体処理ロボットに搭載されているハードウェアは、使い捨てチップを使用するための96チャンネルピペットアームであり、betweeプレート/機器を移動ロボットマニピュレータ（RM）nはワークテーブル、ストレージカルーセル、MTPリーダー、遠心分離機および振盪インキュベーター。 （B）液体ハンドリングステーションは、液体ハンドリングアームが装備されており、8チャンネル300μlのピペット、1位の廃棄物容器、250ミリリットルと300μlのヒント（2位）、高さアダプタ30と先端アダプタトラフ（〜8位4）（3位）とのMTPのための5つの高さのアダプタ60。位置の番号付けは、このプロトコルの全体にわたって参照されます。利用可能な同等のセットアップがある場合は、代替ワークテーブルを使用することもできます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：ピルビン酸アッセイを介して決定16市販のポリマーのピルビン酸含有量 。 1グラム/ Lのポリマー溶液の後sは加水分解し、中和した、ピルビン酸アッセイは1:10希釈から行った（n = 3）である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：モジュラーハイスループットスクリーニングプラットフォームのフローチャート 。粘度の形成の分析、ポリマー製造および総炭水化物含量の決意：異なる多糖類検出モジュールを組み合わせた自動スクリーニングシステム。第二部は、最初の部分で識別され、選択したすべてのEPSの生産のための詳細な単糖分析を提供しています。すべての自動スクリーニングからのデータとUHPLC-ESI-MSを介した炭水化物指紋からのデータがデータベースに収集され、ALRの構造的に関連する変異体の単純な識別を可能にしていますしたがってeady知らEPS又は新規EPSと、対象とスクリーニング。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| メインステップ/解析モジュール | ワークフロー | 観察/説明 |
| 株の栽培 | 1ミリリットルEPS-培地A 前培養48時間、30℃、1,000回転のA メイン培養48時間、30℃、1,000回転のA | EPSの生産 |
| 細胞除去/粘度 | 遠心分離：4300×gで30分 | 無ペレット=粘度の増加=正 |
| ポリマーの検出： 降水 | 50μlのSUpernatant +150μlの2-プロパノールB RTで10分間900回転数Bを振っ | ビジュアル：繊維およびフレーク=ポリマーの正の降水量 |
| 細胞除去/高粘度 | 主培養の180μlの上清 遠心分離：3000×gで10分 1.0μmのガラス繊維膜 | フィルタなしの通過=高粘度=正ません |
| ポリマーの検出： 降水 | 50μlのろ液+150μlの2-プロパノールB RTで10分間900回転数Bを振っ | ビジュアル：繊維およびフレーク=ポリマーの正の降水量 |
| グルコース消費： グルコースアッセイ | 希釈1：100： 10μlのろ液+ 990μlののddH 2 O 50μlのアリコート+50μlのREAGENT-ミックス 30℃、150rpmでインキュベーション30分 測定418から480 nmの | 培養後、残りのグルコース |
| ゲル濾過 | 平衡化： 3×150μlのNH 4 -acetat緩衝液pH 5.6 2,000×gで2×2分 千×gで1×2分 ゲル濾過： 35μlのろ液、千×gで2分 洗浄： 3×150μlでのddH 2 O、2,000×gで2分 ストレージのための75μlの20％エタノール | ポリマーの精製： 栽培上清から塩、ピルビン酸、グルコースおよび他の糖モノマーの除去 |
| ゲルろ過した後、残りのグルコース グルコースアッセイ | 1:10希釈： 25μlののddH 2 O + 20μlののddH 2 Oおよび5μlのろ液 + 50μlの試薬ミックスインキュベーション30分 測定418から480 nmの | フェノール - 硫酸 - 酸法からゲルろ過後の残りのグルコースの減算 |
| グルコース同等： フェノール-硫酸-酸方法 C | 20μlのゲル濾過液+180μlのフェノール-硫酸酸（30μlの5％（のddH中w / v）のフェノール2 O +150μlの濃H 2 SO 4（ρ= 1.84グラム/ミリリットル）） 900rpmで5分間振とう 80℃でのインキュベーション35分 480 nmで測定 | グルコース同等： Δ（フェノール - 硫酸 - 酸価 - ゲルろ過した後、残りのグルコース） <300 mg / Lの負 > 300と<700 mg / Lで、推定正 > 700 mg / Lで正 |
| 無菌状態（層流）の下で手動で処理します。 | ||
| B引火性液体は、ヒュームフードの下で手作業で処理します。 | ||
| Cのフェノール-硫酸酸は、ヒュームフードの下でブランド液体ハンドリングステーション（LHS）で処理されます。 | ||
表1：ロボット液体ハンドリングシステムと液体ハンドリングステーションと自動化されたプレスクリーニングの完全なワークフロー自動分析モジュールのすべてのパラメータの概要。。
| 直線性 | LOD | LOQ | ||
| R²A | 傾きa | オフセット | mg / Lで | mg / Lで |
| 0.9998 | 0.0007 | -0.021 | 50 | 100 |
| 標準 | Bの平均 | 精度bを | 精度B | |
| mg / Lで | mg / Lで | 履歴書％ | バイアス（％の誤差） | |
| 5,000 | 5112 | 1.8 | 2.2 | |
| 250 | 265 | 5.3 | 6.1 | |
| 8回の測定の平均値、0.1〜5グラム/ Lから6つのレベルのグルコースを含むキャリブレーション | ||||
| Bスチューデントのt検定を用いて実施（α= 0.05; N = 8）。 | ||||
| LOD：決意の限界、LOQ：定量限界、CV：変動係数。 | ||||
表2：フェノール-硫酸酸法の検証は、液体ハンドリングステーションを用いて行った。直線性は6点較正に基づいて計算した（N = 8）。 2例示的に選択されたグルコース濃度の平均値、精度と正確さは、ここで与えられています。
| 直線性 | LOQ | |||
| R²A | 傾きa | オフセット | μM | |
| 行列なし | 0.99999 | 0.0223 | -0.0019 | 1 |
| 1:10に希釈行列 | 0.99999 | 0.0221 | -0.0011 | 1 |
| 標準 | Bの平均 | 精度bを | 精度B | |
| μM | μM | 履歴書％ | バイアス（％の誤差） | |
| 行列なし | 50 | 49.96 | 3.05 | -0.09 |
| 1 | 1.04 | 2.95 | 3.86 | |
| 1:10に希釈行列 | 50 | 49.98 | 0.44 | -0.04 |
| 1 | 1.00 | 4.58 | 0.33 | |
| 3つの測定値の平均、1〜50μMからピルビン酸の6濃度のキャリブレーション。 | ||||
| B（n = 3）を | ||||
| LOQ：定量限界、CV：変動係数。 | ||||
表3：とし、1:10に希釈中和トリフルオロ酸マトリックスなしのピルビン酸アッセイの検証二つの6点校正（n = 3）を持つとマトリックスの影響の評価を行ったなし。平均値、精度ととと1:10希釈の影響なし2例示的に選択されたピルビン酸濃度の精度を算出しました。
表4：プラットフォームでスクリーニング3つの例示的な株の結果データが自動スクリーニングおよび炭水化物フィンガープリントから収集した。。 してくださいCMicrosoft Excelファイルとしてこの表をダウンロードするにはこちらをなめます。
| 炭水化物 | 最大吸収[nm]で | 480 nmでの吸収は平均±SD | [％]をグルコースに吸光度の相対 | |
| Diutanガム | 470 | 0.342 | 0.010± | 187 |
| ジェランガム | 472 | 0.334 | 0.002± | 183 |
| グアーガム | 478 | 0.387 | 0.017± | 212 |
| グミアラビア | 476 | 0.393 | 0.034± | 215 |
| ヒアルロン酸 | 484 | 0.231 | 0.011± | 126 |
| カラヤゴム | 478 | 0.455 | 0.023± | 249 |
| コンニャクガム | 480 | 0.297 | 0.009± | 163 |
| カラマツガム | 480 | 0.337 | 0.032± | 185 |
| ローカストビーンガム | 478 | 0.354 | 0.033± | 194 |
| スクレ | 484 | 0.168 | 0010± | 92 |
| サクシノグリカン | 482 | 0.168 | 0.005± | 92 |
| タラガム | 480 | 0.318 | 0.016± | 174 |
| トラガカント | 478 | 0.513 | 0.003± | 281 |
| ウェランゴム | 472 | 0.226 | 0.016± | 124 |
| キシラン | 472 | 0.567 | 0.007± | 311 |
| キサンタンゴム | 482 | 0.245 | 0.021± | 134 |
| グルコース | 484 | 0.191 | 0.014± | 100 |
| SD：標準偏差 | ||||
表5：16市販のポリマーおよびグルコースに対するフェノール硫酸酸法によって得られた結果として 16の市販のポリマー（1 G / L）、ならびにグルコース（1g / Lの量の480 nmでの吸収極大および吸収。 ）フェノール硫酸酸法を適用して測定しました。すべてのポリマーのグルコースに対する吸光度の相対を算出しました。
| 標準 | 平均 A | 精密A | 精度A | |
| mg / Lで | mg / Lで | 履歴書％ | バイアス（％の誤差） | |
| 1:10希釈 | 450 | 460 | 1.01 | 2.14 |
| 45 | 44.7 | 1.41 | -0.70 | |
| 1：100希釈 | 4500 | 5026 | 1.19 | 11.6 |
| 450 | 471 | 1.16 | 4.55 | |
| Bスチューデントのt検定を用いて実施（α= 0.05; N = 8）。 | ||||
| CV：変動係数。 | ||||
表6：グルコースアッセイのための自動化された希釈の検証培養後、グルコースアッセイ用希釈（1：100）。およびゲル濾過（1:10）後には検証されました。二つのグルコース濃度（N = 8）液体ハンドリングシステムを介して希釈し、評価しました。平均値、精度および正確度を算出しました。
| 理論血糖値 | シリコーンキャップマットで覆われて | 蒸発のテスト（発見） | |||||
| 平均 | 精密A | 精度A | 平均 | 精密A | 精度</強いです> | 蒸発 | |
| mg / Lで | mg / Lで | 履歴書 ％ | バイアス（％の誤差） | mg / Lで | 履歴書 ％ | バイアス（％の誤差） | ％エラー |
| 45.0 | 45.2 | 0.69 | 0.44 | 46.0 | 0.66 | 2.05 | 1.60 |
| 18.0 | 17.7 | 0.80 | -1.68 | 18.0 | 0.72 | -0.01 | 1.69 |
| 9.0 | 8.74 | 1.20 | -2.98 | 8.92 | 0.81 | -0.95 | 2.09 |
| 4.5 | 4.50 | 1.26 | -0.04 | 4.58 | 1.57 | 1.76 | 1.80 |
| 1.8 | 1.85 | 0.74 | 2.90 | 2.01 | 2.82 | 11.6 | 8.48 |
| 0.9 | 1.03 | 1.43 | 14.1 | 1.16 | 3.52 | 28.3 | 12.4 |
| （N = 4） | |||||||
| CV：変動係数。 | |||||||
表7：覆われ、発見されMTP 6つの異なるグルコース標準の蒸発効果の評価は、（n = 4）は、室温で3.5時間、カルーセルに格納されていました。蒸発の効果は、明らかに、ならびに被覆された（シリコンマット）標準試料を用いて評価しました。 ％の誤差の平均、精度、正確さ、蒸発を算出しました。
ゲル濾過前| ゲル濾過の後 | ゲルろ過した後、残りのグルコース | ||||
| 平均 | SD A | 平均 | SD A | ||
| mg / Lで | mg / Lで | mg / Lで | mg / Lで | ％ | |
| 1 | 8647 | 110 | 259 | 121 | 3.00 |
| 2 | 5108 | 56 | 116 | 37 | 2.27 |
| 3 | 2014 | 12 | 50.8 | 14 | 2.52 |
| 4 | 1015 | 12 | 25.1 | 8.1 | 2.47 |
| 5 | 510 | 4.9 | 12.8 | 4.3 | 2.51 |
| 6 | 223 | 8.6 | 6.6 | 1.5 | 2.94 |
| 7 | 122 | 5.6 | 4.3 | 0.9 | 3.48 |
| 8 | 75 | 6.0 | 3.1 | 0.3 | 4.18 |
| （N = 8） | |||||
| SD：標準偏差 | |||||
表8：ゲル濾過効率の結果を 8つの異なるグルコース標準はゲル濾過の効率を評価するために、ゲル濾過の前及び後に測定しました。 ％でのゲル濾過を算出した後、標準偏差、残りのグルコース、意味。
ディスカッション
フェノール-硫酸酸法による多糖類の検出は：別の単糖類は、この方法9の使用により異なる吸収極大とモル吸光係数を示しています。これは、異なる量のいくつかの糖を含むポリマーの異なる吸収極大をもたらします。 16種類の市販のポリマーの吸収極大の異なる波長を、 表5に示されている。ポリマーは、（1 G / L）に溶解したのddH 2 Oに、（150 rpm）で一晩撹拌し、フェノール-硫酸酸法を用いて測定します。 Diutanガムは484 nmで最高470 nmで最低の吸収極大とスクレとヒアルロン酸を示しました。これらの結果に基づいて、480 nmでは、このスクリーニングプラットフォームのために選択しました。ポリマーの相対的な吸光度（100％に設定）を1g / Lのグルコースを用いて得られた吸光度に基づいて計算しました。最低の結果は、両方の92％で、スクレログルカンおよびサクシノで得られました。これはEXPましたスクレログルカンは、グルコースのみが含まれており、サクが7の割合でグルコースとガラクトースが含まれているためected：1。両方の商業ポリマーは、乾燥と異なる灰分の異なる損失を持っている、これは〜110％の理論値に達しなかった理由です。キシランは311パーセントと最も高い相対吸光度を示しました。このための理由は、より支配的なフラノース形にキシロースから達成高いモル吸光係数です。 0.1グラム/ Lのグルコースのレベルでは定量限界に達しただけでなく、濃度<0.05グラム/ Lの検出限界。しかし、スクリーニングで陽性株の検出限界は、0.7より高いG / Lであり、従って、アッセイは、良好な性能を示しました。信頼できる結果を得るために、ゲル濾過後の残りのグルコースは、グルコースアッセイを用いて測定し、この値は、フェノール - 硫酸酸法からの値から差し引きました。
自動化されたグルコースアッセイ希釈：パフォーマンス培養後のグルコース決意（希釈1：100）を調査しました。このために、10μlの上清を吸引し、この希釈液の180μLを分注10倍を経由してディープウェルプレートでのddH 2 Oの990μlに移して混合しました。第二の重要なステップは、ゲルろ過後のグルコースアッセイからの1:10希釈のための唯一の5μlアリコートの正しいピペッティングしました。 ddH 2 Oの希釈25μLを生成するために最初の50μlのチップで転送された、のddH 2 Oおよび5μlのゲル濾過液のその後20μlを一緒に吸引しました。これは、チップのうち5μlアリコートの優れた除去を保証します。両方の希釈ステップは、グルコースアッセイを介して各種グルコース規格に確認しました。 2つの典型的な濃度についての結果は表6に示されている1：100希釈のグルコース含量を決意するための培養は、CV＆＃との両方の規格のための高精度を示した後に60; 1.2％。同時に、より高規格の精度は11.6（％の誤差）まででした。グルコース決意を培養した後にのみ、残りのグルコース含量を示し、従って、ポリマーの検出のために重要ではないしかし、これは無視できます。ゲルろ過した後、残りのグルコースのための1:10希釈は、CV <1.4％と精度<2.1％の誤差で非常に信頼性の高い結果を示しました。
蒸発を考慮することは：スクリーニングは最初のグルコースアッセイするための最初のステップから3.5時間を必要とします。この時間枠は、キャップされていないMTPストレージに影響を与えるかどうかを調べるために、グルコースアッセイの較正標準の50μlを用いて、ロボットカルーセルで3.5時間、カバーなしで保存しました。校正範囲（45から4.5ミリグラム/ L）において、試料濃度はほとんど増加しません。増加 - 蒸発による - は2.1％を下回ると、2つだけの最低濃度（1.8および0.9 mg / Lで）それが12.4％にまで達した（のためでした表7）。
ゲル濾過：非代謝グルコースの量が多いと加水分解されたポリマーからのグルコースの定量的検出を妨害します。したがって、ゲル濾過工程は、培養後に残っているグルコースを除去するために必要でした。さらに、ゲル濾過は、モノマー分析における分析のバックグラウンドを最小にするために、グルコースより他、塩及び炭水化物のモノマー化合物からの上清を含有するポリマーを精製します。ゲル濾過工程でろ液の35μlをウェルの中心に置きました。自動化システムでのゲル濾過のロバスト性の検証のために、0.045からの8つの校正標準は9までのG / Lのグルコースを濾過した（n = 8）。すべての濃度のグルコースは、常に初期値（ 表8）の95％以上減少しました。そうすることで、ゲル濾過、グルコース、種々の濃度のために、非常に良好な結果を示しました。さらに、残りのグルコースゲル-Fの後iltrationは、グルコースアッセイを用いて測定し、加水分解されたポリマーのためのグルコース当量の正確な量を受信するために、フェノール - 硫酸酸決意から差し引きました。
ピルベートアッセイ：まず第一に、それは、加水分解工程から中和し、希釈した（1:10）TFAマトリックスは酵素反応を妨害するかどうかを調べました。したがって、完全なアッセイを用いて、二回一回実行し、マトリックスなし一度と信頼性の高い結果を示しました。最後に、16市販のポリマーのピルビン酸含有量が正常測定し、 図3に示されている。一般的には、これらの16のポリマーからのみサクシノグリカン及びキサンタン天然ピルビン酸を含有することが知られています。我々のピルビン酸アッセイを用いてこれらのポリマーの両方を正確に同定しました。スクレでは、ウエランガムおよびキシランピルビン酸はまた、有意な量で検出されました。全体的に、アプローチの能力が検証され、ピルビン酸アッセイsであっ高いパフォーマンスをhowed。これは、加水分解後に異なるポリマーでピルビン酸を検出することであることが判明しました。
炭水化物指紋：自動スクリーニングのすべての分析モジュールを実行した後、潜在的なEPSの生産は、炭水化物指紋分析のために選択しました。このため、いくつかの基準を適用した：粘度1）陽性所見を遠心分離した後、および/または濾過の後。濾過前と後の2）降水。観測された繊維およびフレークを陽性と評価しました。フェノール - 硫酸酸法から3）グルコース換算値。 > 700 mg / Lで値が正と評価されたと300および700 mg / Lでの間の値が推定されるEPSの生産者と評価されました。二、三の基準は陽性と評価されたときに、株はさらに、炭水化物、指紋分析のために選択しました。基準は、EPSのスクリーニング（ 例えば、低粘度EPS）の個々の目的に向けてカスタマイズすることができます。我々のアプローチはefficiを見つけることを目的としましたENTは、生産をEPS。唯一のグルコース同等の評価限界をEPSの少量を生産する菌株を検索するときに低減されるべきです。
技術的な利益と将来のアプリケーション：このプロトコルの一つの興味深い特徴は、手順と異なる分析モジュールのモジュラー文字です。これらは、個々の要件に適合、様々な方法で組み合わせることができ、新規のモジュールを容易に実現することができます。また、分析モジュールは、別々に使用することができ、 例えば、HT-PMP-誘導体化モジュールと組み合わせた加水分解モジュールは、96ウェルフォーマットで、異なるポリマー溶液（1 G / L）からの単量体組成分析を行うことができます。完全なスクリーニングはピペット操作スキームを変更することなく手作業で処理することができる液体ハンドリングシステムへのアクセス権を持つことなく、研究室のため。 screeneただし、液体ハンドリングシステムを使用して、最大768株（代わりに192株にスループットを増加させます手動で）一日あたりのdは。ここに記載されているプロトコルは、異なる属のスクリーニングが可能であるので、新規なEPS生産を識別し、一つのアプローチ（ 図4）に、それらの炭水化物フィンガープリントを分析するための大ひずみコレクションのスクリーニング。また、フコースなどの希少糖、ウロン酸、あるいは未知の糖を含む多糖のための標的スクリーニングは、詳細な単糖分析を介して行うことができます。また、定義された比率で異なる糖の組み合わせを検出することができます。これは、すでに知られているEPS又は新規EPSの構造的に関連する変異体の簡単な同定を可能にします。
開示事項
開示するものは何もありません。
謝辞
私たちは、リキッドハンドリングシステムのプログラミングと技術サポートを提供してくださったThomas Howe氏とJörg Carsten氏に心から感謝します。
材料
の
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェルディープウェルプレート2.0 ml(DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture(CP 1-1〜1-4)、ゲルろ過用平衡プレート(CP 1-6、1-7、2-6、2-7)、990を含むグルコースアッセイ(CP 4-1〜4-4)の1:100希釈。&マイクロ;l of ddH2O |
| 通気性シーリングフィルム | Axygen | BF-400-S | 前培養およびメイン培養用インキュベーションフィルム DWP |
| アルミニウムシーリングフィルム | Axygen | PCR-AS-200-80 | °グリセロールストックプレート用C保存フィルム |
| MCA96ネスト使い捨てチップ200µl | TECAN | 30038619 | 作業台位置 (WTP 2-1 から 2-4) |
| A/B ガラスフィルタープレート 1 &マイクロ;m | Pall Corporation | PN 8031 | コレクタープレート (CP 2-1 から 2-4) |
| 96 ウェルマイクロ力価プレート V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | ろ過プレート用コレクタープレート (CP 2-1 から 2-4) |
| 96 ウェル SpinColumn G-25 | ハーバード装置 | 74-5612 | DWP (CP 1-6、1-7、2-6、2-7) |
| 96ウェルマイクロ力価プレート V-Bottom | Nunc | 249944 | ゲルろ過プレート用コレクタープレート(CP 3-1〜3-4) |
| ネストされた使い捨てチップSBS 50 & マイクロ;l チップ | TECAN | 30038609 | カルーセル位置 (CP 4-6, 4-7 および 5-1 から 5-6) |
| トラフ 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | 水 WTP 1-1, グルコースアッセイ試薬ミックス WPT 1-2, 酢酸アンモニウム緩衝液 pH 5.6 (CP 5-7) |
| 96 ウェルマイクロ力価プレート F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | 沈殿1(CP 6-1〜6-4)、pH値(CP 7-1〜7-4)、沈殿2(CP 8-1〜8-4)、フェノール硫酸法(CP 8-5〜8-8)、グルコースアッセイ(CP 9-1〜9-9)、ダミープレート(WTP 3-1、3-2) |
| 96ウェルシリコンキャップマット | Whatmann | 7704-0105 | MTP |
| 200 & マイクロ用カバーマット。l ピペットチップ | Sarstedt | 70.760.002 | |
| 1,000 & マイクロを手動で処理するため;l ピペットチップ | Sarstedt | 70.762 | |
| 96ウェルPCRマイクロ力価プレートの手動取り扱い用 | ブランド | 781350 | 加水分解、PMP誘導体化 |
| TPE(熱可塑性エラストマー)キャップマット | ブランド | 781405 | 加水分解、PMP誘導体化 |
| フィルタープレート0.2 &マイクロ;m Supor | Pall Corporation | PN 8019 | MTPコレクタープレートによるUHPLC-ESI-MS分析用サンプルのろ過 |
| ピペットチップ LHS 5-300 &マイクロ;l | ブランド | 732150 | ブランドLHSシステム |
| グルコースオキシダーゼ | Sigma-Aldrich | G2133 | グルコースアッセイ |
| 西洋ワサビペルオキシダーゼ | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
| DA-64 (N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4.4'-ビス(ジメチルアミノ)-ジフェニルアミンナトリウム塩) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
| ピルビン酸オキシダーゼ | Sigma-Aldrich | P4591 | ピルバットアッセイ |
| リン酸カリウム二塩基性 | カールロス | P749.3 | ピルバットおよびグルコースアッセイ |
| リン酸カリウム一塩基性 | カールロス | 3904.3 | ピルバットおよびグルコースアッセイ |
| チアミンピロリン酸 | Sigma-Aldrich | C8754 | ピルバットアッセイ |
| 塩化マグネシウム六水和物 | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
| 2-Propanol | VWR | 20922.466 | 沈殿物 |
| Phenol | VWR | 20599.231 | フェノール-硫酸法 |
| Sulic acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-硫酸法 |
| Trifluoroacetic 酸 | Sigma-Aldrich | T6508 | 加水分解 |
| アンモニウム溶液 | Carl-Roth | P093.1 | 加水分解、PMP誘導体化 |
| エタノール絶対 | VWR | 20821.321 | 加水分解、PMP誘導体化 |
| フェノールレッド | Alfa Aesar | B21710 | 加水分解、PMP 誘導体化 |
| 1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP 誘導体化 |
| メタノール LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP 誘導体化 |
| アセトニトリル LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP 誘導体化 |
| 酢酸 | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP 誘導体化 |
| エタノール絶対 | VWR | 20821.321 | PMP誘導体化 |
| メチルレッド | アルファAesar | 36667 | pH値 |
| ロボット液体処理システム | Tecan | Freedom EVO | 作業台のセットアップ図2 |
| LiquidハンドリングステーションLHS | ブランド | 709400 | Figure 2 |
| Tip-Adapter | ブランドの | 作業台のセットアップ709434Figure 2 | |
| >Liquid Ends MC 20-300 &マイクロ;l | ブランド | 709416 | Figure 2 |
| >Adapter 60 mm | の < | strong>Figure 2 |
参考文献
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