微生物学的に誘導された方解石沈殿がによって媒介されます<em&gt;スポロサルシナパステウリイ</em

サマリー

細菌Sporosarcina pasteuriiを使用した微生物学的に誘発された方解石沈殿(MICP)のプロトコルがここで紹介されています。沈殿した炭酸カルシウムは、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM)によって特徴付けられました。また、MICPへの曝露により、スポンジの圧縮強度が増加することも示されています。

要約

ここでは、調査中の特定の細菌（S.のパステウリイは ）当然、酵素ウレアーゼの分泌を通して環境を発生中の尿素（尿素分解）の加水分解を誘導するために、適切な条件の下で、その能力において独特です。尿素分解のこのプロセスは、化学反応の連鎖を介して、炭酸カルシウムの沈殿物の形成をもたらします。これは、微生物学誘起方解石沈殿（MICP）として知られています。 MICPのための適切な培養プロトコルはここに詳述されています。最後に、顕微鏡の異なるモードの下で可視化実験は、沈殿プロセスの様々な側面を理解するために行きました。光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（SEM）及びX線光電子分光法（XPS）のような技術は、化学的に最終生成物を特徴付けるために使用しました。また、自然の多孔質媒体の内部で毛穴を詰まらせるために、これらの析出物の能力はどこスポンジ定性実験により実証されましたバーは、長さスケールの範囲の細孔のネットワークを模倣するために使用しました。細菌細胞を含む培地に浸したスポンジバーが原因で化学沈殿を連続的プロセスから生じる、その細孔の目詰まりに硬化します。硬化バーは少し変形と同じ重量を支持することが可能であるが、適用される外部荷重の作用下で圧縮され、搾りなり制御スポンジバーと比較した場合、この硬化スポンジバーは、優れた強度を示します。

概要

スポロサルシナパステウリイは高アルカリ性環境（pH約^10）1で生き残ることができるグラム陽性細菌であると^{（MICP）2-4}微生物学誘起方解石の沈殿と呼ばれる現象の原因物質になることができる細菌種の一つです。 MICPは、炭酸カルシウムの沈殿は、適切な環境条件下で特定の微生物により誘発される方法である。S.パステウリイが原因特定の条件下でMICPの重要なボリュームを誘導するための可能な剤 ​​としての同定に近年の重要性を想定しています。この可能性は事実Sから茎パステウリイは、酵素ウレアーゼの大量を分泌するためのユニークな能力を持っています。この酵素は、水分子の存在下での尿素の加速溶解（広範かつ豊富な供給と天然に存在する生化学的化合物）を促進する、触媒として作用します。反応のカスケード、このプロセス究極を通じて、LY負に帯電した炭酸イオンの生成につながります。これらのイオンは、次いで、最終的に炭酸カルシウム（カルサイト）の沈殿物を形成するために、カルシウムのような正の金属イオンと反応します。したがって、ラベルMICP ^5-9。

MICPのプロセスは、数十年^10,11のために知られ、研究されています。過去数年間、MICPは、エンジニアリングとボトムアップのグリーン建設^12、大規模な構造物^13,14と炭素隔離およびストレージ^15,16の強化を含む環境用途の広い範囲のために検討されています。

例えば、Cunnigham ¹⁷ら。アルはベリア砂岩コアを含む高圧中温流反応器を設計しました。リアクターは、細菌S.を接種しましたfridgidimarina高圧の超臨界二酸化炭素の注入、細孔体積内部のバイオマスの大規模な蓄積の条件下リュームは、透過性の95％以上の減少につながった、観察されました。 JonkersとSchlangen ^18は、コンクリート中の自己治癒過程上の細菌の特定の特殊株の効果を検討しました。表面の孔を通って入る細孔ネットワーク内に輸送外部水が順番にMICPを経由して構造強度を助ける休眠バクテリアを活性化することが期待されています。トープラー¹⁹ら。 S.の尿素分解活性を比較しました大規模MCIPに有利な条件の下で先住民族の地下水の尿素分解縮図でパステウリイとことがわかったS.パステウリイは、先住民コミュニティの前ウレアーゼ活性を欠いていた場合でも、方解石沈殿を改善するための一貫性のある機能があります。モーテンセン²⁰ et.al土壌タイプ、塩化アンモニウム、塩分濃度、酸素濃度とMICPの細胞の溶解の濃度などの外部因子の影響を研究しました。生物処理工程がRESPと非常に堅牢であり、彼らのデモ電気ショック療法パラメータ空間における幅広いバリエーションには行われている細菌を強化するための適切な濃縮プロセスを提供し、様々な大規模な修復アプリケーションのためのこのプロセスの適合性を実証します。フィリップス²¹ら。アルは、Sを注射された後、砂の列と砂岩コアの透磁率と強度の変化を研究するための実験を設計しましたパステウリイ文化。破壊強度が3倍に増加した4回 - 彼らは、透磁率が2に減少したことがわかりました。

S.のパステウリイとMICPにおけるその役割は、活発な研究のトピックであり、化学的析出のメカニズムに関するいくつかの問題はまだ完全には理解されていません。この観点では、Sの正確文化適当に濃縮された株式に一貫性のある標準化されたプロトコルのセットを持っていることは非常に重要ですMICPを達成するためにパステウリイ 。ここでは、再現性と再現性を確保する厳密なプロトコルの概要を説明します。このミリアンペアnuscriptはSを培養するための詳細なプロトコルを記述するパステウリイと適当に沈殿を誘導するために培養液を濃縮します。プロセスは、光学および走査電子顕微鏡（SEM）及びX線光電子分光法（XPS）などの様々な顕微鏡技術によって調べました。原稿の焦点は、MICPのプロセスです。 SEMおよびSIMSのような手順は、十分に確立された標準プロトコルであり、個別に記載されていません。

プロトコル

注：以下で説明するために、実験プロトコルを実行します。細菌培養プロトコルは第1節で議論されている（また、 図1を参照）。第2節では、外部添加剤を用いて培地を濃縮するためのプロトコルについて説明します。第3節では、マルチモード顕微鏡のためのプロトコルについて説明します。すべての個々の成分の重量は、化学天秤を用いて測定することができます。各溶液の体積は、体積シリンダーを用いて測定することができます。

注： - 詳細については、制度的安全事務所に相談してください。2.適切なバイオセーフティプロトコルは、セクション1のために従わなければなりません。

1.細菌培養

1. 培養細菌-寒天はミディアム準備をプレート
   1. このようなペトリ皿、フラスコなどの機器や食材を組み立て、Tris塩基、塩酸、寒天、ミリポア水、pHメーターetc.Sterilize使用前に121℃でオートクレーブ処理することによってすべてのコンテナ。
   2. 0.1の1 Lを用意ミリポア水1Lで15.75グラムトリスベースを混合することによって、トリスバッファーの3 M水溶液。原液（pH 10.4）のpHレベルを低下させることのHCl 2,800μL（50％濃度）を加えます。でpH = 9を設定するには、pHメーターを使用して継続的に確認してください。
   3. 次のように二つの部分に1Lの緩衝液を分けます。
      1. この溶液800mlを取ります。 400ミリリットルずつの2つの部分に均等にそれを分割します。他の解決策8 G（NH _4）2 SO ₄いずれかの解決策および16グラムの酵母抽出物を溶解します。
      2. ソリューション残り（の200ミリリットル）に乗り、100ミリリットルずつの2つの部分に再びそれを分けます。 2グラム（NH _4）2 SO ₄ 1にミックス。他に4グラムの酵母エキス4gの寒天を追加します。
   4. Al箔にそれぞれのフラスコを包み、オートクレーブテープを貼付した後に、別途4ソリューションをオートクレーブ。
      注：卓上オートクレーブ装置が使用される場合、体積を500ml（温度と圧力のオートに設定されるべきです的には）ボリュームの関数として指定されています。
   5. オートクレーブからそれらを取り出した後、ステップ1.3.1（以下）のために取って2 400ミリリットルのソリューションを設定します。 200ミリリットルのソリューションを持っているために、2つの100ミリリットルの溶液を混合。 12ペトリ皿 - 10に混合物を注ぎます。
2. 培養細菌-寒天平板試料の調製
   1. 冷凍庫（-80℃）から細菌株を取り外し、それを解凍することができます。適切に解凍した後、細菌株およびバイオセーフティーフードの内側に寒天プレートを配置します。
   2. スポロサルシナパステウリイ株式で先端に寄生する- （10μlの良い選択である0.5）が利用可能な最小寸法のマイクロピペットを選択します。ストリークマイクロピペットチップと寒天プレート。 48時間31℃で非振盪インキュベーター内部に画線寒天プレートを置きます。
   3. 48時間後、インキュベーターからプレートを取り外し、視覚的に単一コロニーの有無を調べます。単一のコロニーが存在しない場合には、Tに配置彼は別の24時間インキュベーター。
   4. 単一コロニーが検出されるまで、このプロセスを繰り返します。試験の7日を超えないようにしてください。
      注：単一のコロニーがあっても一週間後に表示されない場合、手順が適切に守られておらず、全体のプロセスは、ステップ1から繰り返されなければならないと結論されます。
3. 培養細菌-最終的なサンプル調製
   1. 2 400ミリリットルのソリューション（トリス緩衝液+（NH _4）2 SO ₄およびトリス緩衝液+酵母エキス（1.5.1）を一緒に800ミリリットルの溶液を得るために混ぜる。フラスコに、このソリューションの125ミリリットルを転送します。
   2. 単一コロニーの高濃度の領域を同定するために、寒天プレートの表面の目視検査を行います。静かにナッジおよびマイクロピペットチップを用いてコロニーの一つを破ります。
   3. 125ミリリットルのフラスコに、同じマイクロピペットチップを浸しや転属堅牢な乗算のための細胞の十分な数を確保するために徹底的にそれをかき混ぜます。 3日 - 2、150 rpmで、30℃の振盪インキュベーター中でフラスコを置きます。 2後 - 3日間、インキュベーターからフラスコを取り外します。
4. 培養細菌-最終セル数
   1. 可算単一コロニーが現れる保証するために、少なくとも10百万円（10 ^-7）の希釈を達成するために、PBSを用いて、非希釈した培養液の連続希釈を行います。寒天プレートの1に7並列等距離線を描画します。
      1. 上から見えるようにするのに十分な著名なシャーレの底面に太い線を描画することでこれを行います。 1セグメントに非希釈液の3小さな滴をドロップします。 1:10希釈液を得るために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の9ミリリットルに非希釈液の1ミリリットルを追加します。
   2. ピペットでこの新しく希釈液の少量（〜0.1ミリリットル）を取り、次のセグメントに3以上の小滴をドロップします。して、新しいフラスコに新たに希釈した溶液を移し、さらに希釈した10倍（10倍）PBSを加えます。これは10 ^-2または1に希釈をダウンさせます：100。
      1. 次のセグメントに100解決策：この1を使用します。千のすべての方法：連続して新しいフラスコに転送し、連続して10 ^-3または1からますます希薄サンプルを得るためにPBSと並行して10倍（10倍）を希釈することによって、彼は新しく希釈したソリューションの小容量で処理これを繰り返します最後のセグメントへのダウンに10 ^-7または1：10百万円となりました。
   3. 31℃で2日間 - 1、プレートをインキュベートした後、寒天プレートに存在する細胞の数をカウントする単位（CFU）のプレートカウントコロニー - 形成行います。これにより、希釈せず、試料中の細菌数の定量的な尺度を与えます。
      注：CFU値は、すべてのコロニーを分離した単一の生存可能な微生物細胞によって設立されていると仮定した栄養培地、温度、および時間の特定の条件下でコロニーを生じさせるためのシステムの能力に基づいて測定されます。
   4. シール将来の使用のために冷蔵庫内のアイテムを残りの自己封止膜と店舗とのペトリ皿。

沈殿を加速するための栄養の充実2.プロトコル

1. 転送いくつかの滅菌遠心チューブに調製した培養液（細胞+培地）の9ミリリットル、10ミリリットルボリュームの各。
2. 尿素：2グラム/ L、塩化アンモニウム：1グラム/ L、重炭酸ナトリウム：212 mg / Lで、塩化カルシウム：280 mgの新鮮な培地中で以下の濃度で4成分からなる外部濃縮100mlの原液を準備/ L。慎重に分析天秤を使用してすべての成分を測定し、オートクレーブ（121℃、15 PSI、15分）でビーカーや場所に新鮮な培地とすべてが、尿素を混ぜます。
   1. オートクレーブ後、新鮮な培地1mlと尿素の必要量（2 mg）を混合し、濃縮のプロセスを完了するために0.22μmのシリンジフィルターを装着したシリンジを通過します。
   2. 1を追加します。準備された培養液（細胞+培地）の9ミリリットルを含む滅菌遠心分離管に添加剤と、この濃縮培地1ml（ステップ2.1参照）。
      注：すべてのこれらの成分のうち、高温で分解性である尿素は、オートクレーブ滅菌することはできません。他の成分がオートクレーブ処理された後したがって、（121℃、15 PSI、15分）、尿素を0.22μmシリンジフィルターを介して最後に追加されます。
3. 機械ボルテクサーを用いて徹底的に各チューブをボルテックス。 30℃で非振盪インキュベーターに富む液体（細胞+培地+添加物）を配置します。降水の開始のために、定期的にすべてのユニットを監視します。降水の開始は肉眼で検出された後、光学顕微鏡を用いて、顕微鏡観察を始めます。実験の開始後36時間 - これは通常、30の間です。

マルチモード顕微鏡3.プロトコル

1. 高マニフィカへの流体の少量（約1 ml）を転送します明視野モードで初期観測を行うためのイオン顕微鏡のチャンバーカバーガラスシステム。まず、最も低い倍率（4倍）を持つすべての観測を開始します。その析出物の分布についてのカバレッジの広い面積、ひいてはグローバルな情報を提供しています。
2. 析出物のかなりのボリュームで特定の領域を選択し、漸進的に倍率を増加させることにより（20X、40X、60X）にズームします。
   注：それは正しく明視野下で細胞外高分子物質（EPS）から細胞を解決することは不可能ですので（これは非常に近い屈折率）に、必要に応じて位相コントラストモードに切り替えます。このモードでは、細胞膜のちょうど輪郭（バルクセルとは異なる位相であるが）、したがって、視覚的区別を可能にする、表示されています。
3. 最後に、赤で死んコンポーネントを着色しながら、選択的に緑などのライブのコンポーネントを染めるライブ/デッド染色でいくつかの部屋を染色します。標準プロトコル²⁸を参照してください^</ SUP>。
4. 適切に赤と緑の領域を区別するために、蛍光モードに切り替えます。レッド（540の励起波長とレッドフィルターキューブ - の660nm - 580nmで、600の595 nmおよびバリアフィルタのダイクロイックミラー） - 480nmでのダイクロイックミラー440の励起波長を持つとグリーン（GFPロングパスグリーンフィルターキューブ505 nmおよび510 nmでのバリアフィルタ）フィルタキューブは、蛍光顕微鏡写真を容易にするために使用されます。
5. 一旦全てのマルチモード・データは、可能な限り最高のコントラストと明瞭さを得るために、最高の画像や手動でオーバーレイ（個々の明視野、位相コントラストおよび蛍光画像）を選択し、収集されました。
6. 結晶構造を理解するために乾燥した固体試料のSEMを実行します。これは、十分に確立された標準手順である^。22は、官能基（炭酸塩）の化学署名を識別するためのXPSを実行します。これは、同様に、十分に確立され、標準的な手順である^。23

結果

S.は、好アルカリ菌^24は、比較的過酷な条件に耐えることができているパステウリイ 。上記培養プロトコルが続く場合、およびS.パステウリイは、細菌が時間（ 図2A）上の炭酸カルシウムの沈殿につながる、チャンバ内に成長させる。 図2（b）は、培地中で細菌細胞集団の位相差光学顕微鏡像を示します。個々の細胞は、非常に明白な細菌の菌クラスの特性棒状の形で、明確に区別することができます。小さな茶色の矢印は、特に二つの個別のセルを強調表示するために使用されています。炭酸カルシウムの沈殿は、数日間にわたって行われます。 図2Aは、析出物が遠心管の底に落ち着く方法を示しています。これは鮮やかで、液体媒体の下に座って白っぽい粉末として肉眼で見ることができます黄色がかった液体とは対照的に、色のシャープなコントラスト。黄色がかった液体がそれらの培養培地中に懸濁した細菌が含まれています。白い沈殿物を収集し、乾燥させ、後に...

ディスカッション

重要なステップ：この原稿を詳細にSの実行可能なサンプルを培養するためのプロトコルについて説明しますパステウリイ 。文化が用意されていたら、それは適切に濃縮されなければなりません。適切な化学的環境を提供するために、失敗は降水量の非常に長い時間スケールまたはその完全な欠如のいずれかにつながるので、これは実験の成功に不可欠の重要なステップである。S.パステウリイは、複数の外部機関に非常に敏感であり、生化学的な堅牢性と再現性を保証するために、ケアと高精度で培養する必要があります。濃縮の程度および投与量は現在、降水の化学的性質を決定することが知られているので、同様に正確に制御しなければなりません。

修正/トラブルシューティング：いくつかの態様は、エンド結果にはほとんど差異で修正することができます。プレートカウントは番目あたり（連続希釈上述の手法ごとに実行される必要はありません電子マイルMisraの方法）。ここで、連続希釈は、その底面に描かれたコードによって、7つの領域...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペトリディッシュ	フィッシャーサイエンティフィ	FB0875712	ペトリディッシュは寒天プレートとして使用されています
パイレックスフラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	S63268	コーニング 三角マ
トリスベース	プロメガ	H5133	スバッファー
塩酸	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N、バイオ試薬、細胞培養に適した
寒天粉末	Sigma-Aldrich	A1296	微生物学試験済み、植物細胞培養試験済み、細胞培養試験済み、粉末
硫酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	A4418	分子生物学用
酵母抽出物粉末	Sigma-Aldrich	51475
測定シリンダー	コールパーマー	CP08559GC	コールパーマー クラス A メスシリンダー Cal 証明書付き、TC; 1,000 ml、1/パック
分析天びん	試薬		の重量測定に使用されている
オートクレーブ	ブリンクマン	58619000
オートクレーブテープ	VWR	52428864
アルミホイル	シグマ・アルドリッチ		Z185140 フラスコをオートクレーブに入れる前に密封するために使用されている
	シダーレーン	11859	-80度;S. pasteuriiのCストック、ATCC番号はCatに対して言及されています。いいえ。
Mlineシングルチャンネルメカニカルピペッター、可変容量Biohit		725010	番号14005976マイクロ
ピペットチップ	ッシャーサイエンティフィック	212772B	のスクラッチに使用寒天プレート
インキュベータ	バインダー	80079098	微生物インキュベーター、BFシリーズ
振とうインキュベーターVWR		14004300	VWRシグネチャーベンチトップ振とうインキュベーター
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid ピペッティング装置	BD Biosciences	357590	カタログ番号53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	寒天プレートのシールに使用されています
尿素	Sigma-Aldrich	U1250	栄養培地の濃縮
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S8875	栄養培地の濃縮
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C1016	栄養培地の濃縮

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