ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、いくつかのextramesodermal系統⁵と同様に、骨、軟骨、および脂肪組織^1-4の近軸中胚葉系統に分化することができる体細胞前駆細胞です。まず成人の骨髄から分離され、これらの多前駆細胞は現在臨床応用^9-12に非常に適して表示され、強力な免疫調節特性を有することが示され、予想外に、多くの組織^6-8で発見されています。免疫調節作用に関与する詳細なメカニズムは、積極的に特定の疾患実体の効果的なアプリケーションのために検討されています。免疫調節を評価するための最も簡単な方法の一つは、エフェクター白血球増殖¹³の抑制のための評価によるものです。刺激または活性化されると、このようなTリンパ球や単球などのほとんどのエフェクター白血球がprodigiously増殖します。免疫調節機能を評価することができるときの抑制増殖が明らかです。

伝統的に、エフェクター白血球の増殖は、DNAへの^[3 H]チミジンの取り込みを検出することにより評価しました。しかしながら、この方法は、放射線及び使用後の廃棄の問題、ならびに必要に応じて複雑な装置に起因する重大な欠点を有します。細胞増殖を評価するための非放射性アッセイがあるが、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）アッセイは、複数の細胞型を含む共培養実験に特に有用である特定の細胞集団の同定を可能にするような他の利点を有します。 CFSEは、フローサイトメトリー分析によって評価することができる蛍光細胞の色素です。細胞が分裂するように、この細胞の標識の強度が比例し減少します。これは、全体的な細胞増殖の決意を可能にするだけでなく、蛍光がDETに困難になる前に8分割までの細胞分裂の数を評価するためにできるだけでなく電気ショック療法背景信号に対して。また、蛍光CFSEの安定性は、細胞が何ヶ月¹⁴までの視覚化することができるように標識された細胞のin vivoでの追跡が可能になります。

このアッセイはまた、磁性ビーズの表面マーカーの選択を行うことにより、CD14 ^{+単球 15を生成する} （IL-10）エフェクター白血球またはMSCによって誘導される免疫白血球、インターロイキン10などの特定の集団の免疫調節機能の特定のタイプを評価するために変えることができます前または適切な共培養後に目的の細胞集団。我々のプロトコルは、エフェクター白血球上のMSCの免疫調節効果を評価する基本的なアッセイ（フロー・チャートを図1に示す）と同種CD4 ^{+エフェクター} Tリンパ球上のMSCによって誘導される白血球の免疫調節の評価のためのこの基本的なアッセイの変形（図示フローチャートを説明します図4で）。

施設内倫理委員会によって承認された患者のインフォームドコンセントは、ヒト細胞の使用を取得する必要があります。

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の1の密度勾配分離

1. 25ミリリットルのピペットで50mlチューブに全血をヘパリン化25ミリリットルを追加します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）25mlで細胞を希釈します。
2. 新しい50mlのチューブにフィコール - パック密度勾配の15ミリリットルを追加し、チューブを傾けながら、全血のない混合を伴うがないように、非常にゆっくりと慎重に、密度勾配の上に希釈した細胞懸濁液の25ミリリットルを追加密度勾配、 すなわち 、血液の密度勾配界面の乱れ。
3. 遠心分離（20℃）ブレーキなし温度制御スイングバケットローターで30〜40分間グラム×400で、ステップ1.2からサスペンション。
   注：3つの異なる層を遠心分離した後に明らかであるべきである：目プラズマであること電子上層;下部透明層は、フィコール - パーク密度勾配です。薄い、中間の細胞層はPBMCをさ
4. 吸引し、単核細胞 （すなわち、リンパ球、単球、および血小板）の間期層を乱さないように注意して、パスツールピペットで吸引することにより、上層を捨てます。
5. 慎重に新しい50mlの遠心管に10 mlピペットでこの単核細胞層を収集します。
6. 20mlのPBSでチューブを埋める、よく混ぜ、20℃で10分間、300×gで遠心します。遠心分離後、上清を完全に削除します。
7. 20℃で10〜15分間200×gで細胞をPBS 20ml中のペレットと遠心機を再懸濁します。遠心分離後、上清を完全に削除します。
   注：このステップは、血小板-不要内のPBMCですが削除されます。このステップは、血小板の完全な除去を確実にするために繰り返すことができます。
8. 特定の集団のない選択がされていない場合1mlのを停止するセル数^{16を実行した後}の培養のための所望の白血球完全培地中、再懸濁細胞ペレット（10％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン、およびRPMI-1640培地中に1％のペニシリン/ストレプトマイシン）次のステップに進む前に、10 ⁷のPBMCあたりの媒体。

白血球集団の2磁気標識（特定の集団の選択が必須でない場合は、ステップ4に進んでください）

1. 完全に10分と上清を除去し、300×gで遠心分離PBMC懸濁液。
2. 10 ⁷全細胞あたりのPBS80μlの再懸濁細胞ペレット。
3. 10 ⁷全細胞あたりの指定された磁気ビーズを20μl（単球を単離するための、すなわち、CD14磁気ビーズ、Tリンパ球の単離のためのCD4磁気ビーズ）を追加します。
4. よく混合し、冷蔵庫で2〜8℃で15分間インキュベートします。
5. 洗浄するために10 ⁷個の細胞あたりのPBS 1〜2 mlを加え、遠心10分間、300×gで。
6. 吸引し上清を完全にし、PBS500μlの10 ^8細胞まで再懸濁します。

白血球亜集団の3磁気選択

注意：磁気ビーズセパレータと列の様々なメーカーの数から細胞表面マーカーによって白血球の特定の集団を単離するために利用可能です。分離は、1つまたは少数の正のマーカーにするか、不要な集団の枯渇後にネガティブ選択により基づく正の選択によって行うことができます。 （ すなわち、単球のためのCD4 + Tヘルパーリンパ球のために、またはCD14）は、1つのマーカーを使用して、正の選択を実行する一般的なアプローチは、以下に概説します。

1. 準備し、製造元の指示に従って分離カラムを含むプライム磁気分離器。
2. ラベルされたPBMCのサンプルを含むチューブを適用します。積極標識し、ラベル付け解除の収集のための2つの15ml遠心チューブを提供製造業者の指示に従って、細胞画分を編
3. 10 ^7細胞あたり1mlの培地を用いて、細胞数^を15カウントおよび白血球完全培地中で正に選択白血球（ すなわち、CD4 ⁺ Tリンパ球またはCD14 ⁺細胞）を再懸濁します。

増殖の評価のための白血球の4 CFSE染色

注：CFSEは広くインビボおよびインビトロ 試験の両方のために、免疫学的研究において使用されています。私たちのプロトコルは、MSC / PBMC（または他の白血球）の相互作用のin vitroでの研究のために最適化されています。 CFSE in vitroでラベリングを行うに関わる一般的な手順は似ていますが、プロトコル¹⁴の具体的な用量およびタイミングの違いがあるかもしれません。これは、おそらくCFSE蛍光シグナルの強度に影響を与える可能性が使用される、多くの要因、 すなわち、使用される特定の細胞タイプ、細胞数とすることができます。

図1は、実験の全体的なスキーマを示し、 図2は、位相差倒立顕微鏡によって可視化のような種々の細胞培養条件の外観を示しています。 PBMCおよび白血球が小さな丸い非付着細胞であるのに対し、MSCは、線維芽細胞、紡錘状形態を有する接着性の細胞です。これらの二つの形態学的に異なる細胞型が明らかに共培養に見ることができます。アッセイの終了時に、PBMCを（またはleuckotyes）は、フローサイトメトリーのために吸引される際に付着したMSCが誤って評価するには問題があってはならない、（不良による添付ファイルまたは積極的な吸引により脱落する、すなわち ）含まれていても、分析これらの細胞を以降のPBMC /白血球分画をCFSEで標識されるであろう。全く増殖が存在しない場合には、CFSE標識細胞のヒストグラムの結果は、1つの高度に陽性の鋭いピークとして見られます。活性化が発生した場合しかし、増殖は明らかBとは明らかであろう損失及び蛍光強度の左シフト（ 図3）とyの複数の小さなピーク。増殖の抑制が発生したときに右の鋭さに右と増加にピークのシフトによって証明されるように、 すなわち、MSCの共培養で、複数の小さなピークは、蛍光強度の同時増加に伴って減少します。活性化された同種異系エフェクターCD4 + T細胞上のMSCによって誘導される免疫調節白血球のエフェクター抑制を評価する：非分裂細胞を表す最もピーク図4は、実験の一変形例の全体的なスキーマを示します。実験上の変動などの結果（ 図5）見増殖の用量依存性抑制の追加情報で、元のアッセイに似ています。

同種異系エフェクター白血球の間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節効果の評価のための /> 図1.フローチャートである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2セルMSCの形態、白血球、および2つの細胞集団の共培養。のMSCまたは白血球の単一細胞培養の位相差顕微鏡写真、およびMSC-白血球共培養。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

フィギュア白血球増殖3. MSC抑制効果。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルのサイトメトリーヒストグラム（CFSE）標識白血球増殖（A）のMSCを用いて培養し、単独で刺激されていない、（B）共培養、抗CD3 / CD28マイクロビーズを用いて培養し、（C）のフロー刺激（α-CD3 / CD28）のみ、（D）およびMSCと。ヒストグラムに示すパーセンテージは、増殖、白血球の割合を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

同種異系のCD4 + エフェクター Tリンパ球 上のMSCによって誘導される白血球の免疫調節を評価するため、図4のフロー図 。/ 53265 / 53265fig4large.jpg「ターゲット= "_空白」をアップロード>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

CD4リンパ球の増殖にMSC-共培養CD14単球の図5.抑制能力。プロットを散乱させ、抗CD3 / CD28マイクロビーズ上のMSC-共培養CD14 +単球 （M-CD14 +）の抑制能力のサイトメトリーヒストグラムを流します刺激さ、CFSE標識CD4 +エフェクター Tリンパ球（S-CD4 +）。 M-CD14 +のS-CD4 +の共培養の比が示されています。 CD4 + Tリンパ球（R1）ゲーティング及びCFSE強度を評価しました。ヒストグラムに示すパーセンテージは、CD4 + T細胞の増殖の割合を示している。 目の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図です。

開示するものは何もありません。