方法論記事

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

DOI：

10.3791/53280

⸱

2015年12月14日

 , 
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

この記事について

サマリー

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この論文の目標は、表皮のケラチノサイトと非活性化されたヒトの真皮から遺伝子組み換えヒトの器官型皮膚を生成する方法について、包括的かつ詳細なプロトコルを提供することです。

要約

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器官培養物は、それらのin vivoでの組織の対応の機能および生理学を模倣する細胞-細胞接触および細胞-マトリックス相互作用のための3D環境の再構成を可能にする重要な。これは、忠実に表皮分化と成層プログラムを再現する器官型皮膚培養が挙げられます。初代ヒト表皮角化細胞は、遺伝子が容易に過剰発現またはノックダウンすることができますレトロウイルスを介して遺伝的に操作可能です。これらの遺伝的に改変されたケラチノサイトは、次に遺伝的経路に衝突上皮細胞増殖、分化、および疾患の進行を研究するための強力なモデルを提供し、皮膚器官培養におけるヒト表皮を再生するために使用することができます。ここで紹介するプロトコルは、失活ヒト真皮を準備するだけでなく、と遺伝的に器官皮膚培養を生成するために、初代ヒトケラチノサイトを操作する方法を説明します。再生した人間の皮膚はdownstrに使用することができますこのような遺伝子発現プロファイリング、免疫染色、及びハイスループットシークエンシングに続いてクロマチン免疫沈降などのEAMアプリケーション。したがって、これらの遺伝的に改変された器官、皮膚培養物の生成は、皮膚恒常性を維持するために重要である遺伝子の決意を可能にします。

概要

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ヒト表皮基底膜zone.Theの表皮として知られている細胞外マトリックスは、水分の損失を防ぐために、不浸透性の障壁としてだけでなく、保護するための最初の防衛線として機能するだけでなく、を介して基礎となる真皮に接続重層上皮であります外国と有害物質1から体。表皮の最も深い層である基底層は、表皮2の残りの部分を形成する分化した子孫を生じさせる上皮幹細胞および前駆細胞が含まれています。上皮前駆細胞が分化するように、それらは有棘層3として知られている分化した細胞の第1の層を形成するために上方に移動します。棘層では、細胞は、その後、表皮の分化した層のための物理的ストレスに耐える強度を提供する、ケラチン1および10の発現をオンにします。有棘層細胞は、さらに分化するように、それらはのために、表皮中で上方に移動ケラトヒアリンおよびラメラ顆粒の形成と同様に、原形質膜の下に組み立てられている構造タンパク質によって特徴付けられる顆粒層をメートル。細胞は、分化過程に進むように、ラメラ顆粒が細胞から押し出されているが、原形質膜の下のタンパク質は、クロス脂質豊富な障壁を形成するように互いに連結された角質層4と呼ばれます 。

上皮細胞の増殖および分化への影響の変化を伴う疾患人口の5〜20％。したがって、このプロセスのメカニズムを理解することは非常に重要です。これらの疾患の多くの症状は、細胞-細胞または細胞-マトリックス接触時に偶発的であることから、ヒトの表皮は、3D環境で再構成された器官培養物は、6月10日に作成されています。これらの方法は、典型的には、失活ヒトなどの細胞外マトリックス上に播種し、一次または形質転換ケラチノサイトの使用を含みます真皮、マトリゲル、またはコラーゲン。

上皮細胞の増殖および分化において重要な遺伝子調節機構を理解するために、ケラチノサイトを遺伝的に、2D培養での遺伝子ノックダウンまたは過剰発現するようにレトロウイルスベクターを介して操作され、その後、3次元で再構成することができます。これらの方法は、新生物11-21に表皮幹細胞および前駆細胞の自己再生および分化ならびに進行に関与する遺伝子を特徴づけるために広く使用されています。ここでは、レトロウイルスの使用を介して表皮器官培養物中の遺伝子発現を変化させる方法についての詳細なプロトコルが提供されます。

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プロトコル

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ヒトの皮膚のプロトコールは、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校の研究倫理委員会のガイドラインに従って行いました。ヒトの皮膚は、廃棄された外科的サンプルから得られたか（スキンバンクは材料/機器表に記載されている）は、皮膚の銀行から購入することができます。皮膚が由来されている場所やドナーの年齢は限り真皮における基底膜領域タンパク質（コラーゲン/ラミニン）が分解されないように、実験には重要ではありません。

失活ヒト真皮の調製

  1. ヒトの皮膚を受信すると、（〜3-5分）を解凍し、組織培養フード内で組織を置きます。皮膚のサイズに応じて、滅菌使い捨て50mlコニカルチューブまたは125ミリリットル瓶で解凍組織を配置します。皮膚バンクからの皮膚の一般的なサイズは、0.75平方フィートです。
  2. 1×PBSで4倍のペニシリンおよびストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で、75％の完全な容器を満たします。激しく振ります5分とは、液体の処分。このステップを3回繰り返します。
  3. 最後の洗浄後、新しいチューブ/ボトルに組織を転送し、コンテナの75％を埋めるために、新鮮な4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSを追加します。表皮と真皮の分離を可能にするために2週間、37℃の組織培養インキュベーター中でこの混合物をインキュベートします。
  4. 無菌条件下で、真皮から表皮を剥がすために鉗子を使用しています。表皮は、ドナー（ 図1A）のレースに応じてカラーリングを持つことになりますしながら、真皮は完全に白です。ヒト組織に対処するための金融機関のプロトコルに従って表皮を廃棄します。
  5. チューブや瓶の中に真皮を置き、（4回5分間の洗浄）激しく振盪しながら1×PBSで希釈した4倍ペニシリン/ストレプトマイシンでそれを洗います。最後の洗浄後、使用する準備ができるまで4℃で4倍ペン/ 1×PBSで希釈した連鎖球菌およびストアに新しいチューブ/ボトルに真皮を転送します。真皮は今年まで4℃で保存することができます。

    6. 2.遺伝的に変更初代ヒトケラチノサイト

    注：初代ヒトケラチノサイトに感染するウイルスを生成するために、完全DMEM培地[DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン/ストレプトマイシン]中で増殖させた使用アンホトロピックフェニックス細胞。このようなGAG-pol及びエンベロープのようなタンパク質をコードするウイルスパッケージング遺伝子を安定的に、レトロウイルスベクターでトランスフェクトされた場合、ウイルス産生を可能にするフェニックス細胞ゲノムに組み込まれています。フェニックス細胞は、高いウイルス力価の産生を可能にする、高効率でトランスフェクトすることができます。この包装ラインから産生されたウイルスは、ヒトを含む哺乳類細胞の多種多様に感染することができます。

    1. 1日目：トランスフェクションの前日、完全DMEM培地でも80万個の細胞の密度で6ウェルプレートでシードフェニックス細胞。
    2. 2日目：トランスフェクションの日には、ウェル当たりレトロウイルスベクターの3μgのを使用しています。アリコート1.5mlチューブへのレトロウイルスベクターの3μgの。 100μのミックスを使用します;リットルのDMEMを加えたベクトルのすべての3μgのためのトランスフェクション試薬の6μlの。 1.5mlチューブ中の100μlのDMEMでトランスフェクション試薬の6μLを混ぜます。 （使用されているレトロウイルスベクターは、装置/材料の表に記載されています）。
      1. 5分間インキュベートし、レトロウイルスベクターの3μgのを含む事前に小分けチューブに106μlの混合物を追加します。混合し、室温で30分間インキュベートします。フェニックス細胞の各ウェルに、この混合物全体を滴下して加えます。
    3. 3日目：トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を除去し、新鮮な完全DMEM培地2mlのを追加。同じ日に、ウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに初代ヒトケラチノサイトをシード。抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）でケラチノサイト無血清培地（KCSFM）でケラチノサイトを維持します。
      注：一次ヒトケラチノサイトを購入しました。細胞は、（材料/機器表に記載されている）、さまざまなベンダーから購入することができます。
    4. 4日目：ハー今ウイルス粒子を含む、トランスフェクトされたフェニックス細胞から培地を権利が確定します。注射器を用いて0.45μmのフィルターを通してメディアを渡します（任意の汚染フェニックス細胞を除去するため）、ケラチノサイトに2ミリリットルを配置（前日/ウェル75,000細胞で播種：ステップ2.3を参照してください）​​。感染過程を媒介するために役立つ培地にヘキサジメトリンブロミド（5μg/ ml）を加えます。ウイルス力価は、約1×10 7 TU / mlです。
      1. RTで1時間、200×gで遠心分離で6ウェルプレートをスピン。スピンした後、ウイル​​スを含む培地を除去し、KCSFMを追加する前に、1×PBSで細胞を1回洗浄します。
    5. 5日目：ステップ2.4​​のように再びケラチノサイトの同じバッチに感染します。
      注：レトロウイルスベクターの選択マーカーがある場合、薬物を使用して、ケラチノサイトを選択して、下流の分析や、器官培養などのアプリケーションで使用するために展開します。

    3.器官皮膚の文化を設定します

    1. ビルド一般的な実験で見つかった物質またはカセットから器官カセットは、カスタム金属加工工場（ - F図2A）を介して行うことができます。 3.5センチメートル組織培養プレートからこれらのカセットを作るために3.5センチの皿（ 図2A-B）の蓋の中心から1.0センチメートルX 1.0センチメートルの正方形を削除するには、焼灼を使用しています。無菌条件下でこれを行います。
      1. 明確なマニキュア（ 図2C）を使用して、カセット（3.5センチの皿の蓋）の底部に正方形のペグを取り付けます。マニキュアのための5分を乾燥し、それが正方形のペグ（ 図2D）に載っているように、カセットを裏返しすることができます。 6cm皿にカセットを置きます。
        注：スクエアペグは、芸術品や工芸品店の様々なから購入することができます。
    2. 10％FBS、2.67 / mlのアデニン、40 N、ストレプトマイシン100μg/ mlの、66％DMEM、22％ハムF12、100単位/ mlのペニシリンからなるケラチノサイト増殖培地（KGM）を準備しますグラム/ mlのヒドロコルチゾン、10 ngの/ mlのコレラ毒素、4.94 / mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、1.36 ngの/ mlのトリヨード - L - チロニン、10 ngの/ mlのEGF、および10μg/ mlのシプロフロキサシン塩酸塩。使用する準備ができるまで4℃で0.22μmフィルターとストアを介してメディアをフィルタリングします。
    3. 4倍ペニシリン/ストレプトマイシン+ PBS溶液から真皮を取り、KGMで2回洗浄した後、使用前に2日間37℃でKGMでインキュベートします。
    4. 1.5センチメートルX 1.5センチメートルサイズの部分にメスを用いて真皮をカットして、器官カセットの上に置きます。上を向いて真皮の上部と真皮を置きます。真皮の上部には、ケラチノサイト（ 図1B）と接触する側になります。
    5. （ 図3A）を上に向け、真皮の上部側と器官カセットの角穴にプレカット真皮を置きます。
    6. 鉗子を使用しての上に真皮を含む全体の器官カセットをフリップ（図3B）。氷上で細胞外マトリックス溶液を解凍します。カセットあたりの細胞外マトリックス溶液100μlを引き出すために、針と注射器を使用してください。真皮（光沢のある側）の底部に5滴を追加し、真皮（ 図3B）全体に均一な分布を確実にするために、わずかに振ります。
    7. 商業細胞外マトリックス溶液で5分間は完全に（ 図3C）を固化することを許可します。固化した後、バックの上にカセットを反転するために鉗子を使用しています。 6cmディッシュにKGMの4ミリリットルを追加します。
    8. 真皮（ 図3D）を含む器官カセット上に0.5から1000000遺伝子改変されたケラチノサイトを置きます。
      1. トリプシン処理を、5分間、10cmのプレートに0.05％の4 mlのトリプシンを配置することにより、ケラチノサイトおよび完全DMEM培地4mlでクエンチしました。
      2. 血球計数器を使用して、ケラチノサイトをカウントし、その後5分間200×gでスピンダウン。 90μで（利用可能なセルの数に応じて）0.5から1000000細胞を再懸濁しKGMのLと真皮にすべてのセルを配置します。
        注：再生表皮の厚さに差が見られる任意の細胞数の開始の違いによるものではないことを保証するために、同じ実験内の真皮に同数の細胞を配置することが重要です。真皮に0.5未満万個の細胞を配置すると、貧しい階層と差別につながることができます。
    9. 一日おきに器官培養にKGMメディアを変更します。収穫組織真皮のケラチノサイトの配置後1-14日。表皮の完全な層化と分化は、通常は5日後に発生します。

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結果

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器官人間の皮膚を生成する最初のステップは、真皮から表皮を除去することです。 37°Cの4倍でペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSの皮膚の2週間のインキュベーションは、表皮（ 図1A）から真皮の分離を可能にする必要があります。表皮と真皮を分離することは困難である場合には、別の週に4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBS中で37℃で組織を配置し、ピンセットを用いて再剥離してみてください。

失活真皮上のヒト表皮を再生するための鍵の一つは、ケラチノサイトが真皮の正しい側に配置されていることを確認することです。真皮は、頂部および底部を有しています。真皮の上部には、インビボで 、ならびに器官培養物でケラチノサイトと接触する側です。真皮の上部起因下部（ 図1B）の光沢度に真皮の下から区別することができます。ケラチノサイトは、底部に直接配置されている場合真皮の側（光沢）、表皮は差別か、正しく階層化しません。したがって、器官カセットに上向き真皮（非光沢）の頂部を有することが重要です。真皮は、器官カセット（ ...

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ディスカッション

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ヒト皮膚器官培養における遺伝子操作は、一般的に、2D培養細胞だけでなく、マウスモデルを研究するために多くの利点を提供します。 2D培養物は、無傷の組織および器官に見出される三次元の細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス相互作用を欠いています。最近の研究では、一次ヒト皮膚腫瘍16にはるかに遺伝子発現の類似性を示す3次元培養細胞を用いた2次元および3次元培養皮膚癌細胞との間の多大な違いを発見しました。ヒトの皮膚器官培養物はまた、マウスモデルを超えるいくつかの利点を有します。マウスモデルは、同様に、ヒトおよびマウスの皮膚との間のいくつかの顕著な違いを生成するために時間がかかり、高価です。これらは、異なる組織代謝回転速度、ならびにマウスおよびヒトの表皮8の間に、表皮の厚さがあります。このようなCRISPR-CAS等の新興新技術で、特定の遺伝子は、器官、皮膚culturを用いてヒトの皮膚病をモデル化するために変異さ/変更することができますエス23。さらに、遺伝子は、納入またはここに記載のレトロウイルス遺伝子導入に加えて多種多様な方法を介して、これらの細胞中でノックダウンす...

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開示事項

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開示するものは何もありません。

謝辞

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この作品は、米国癌協会の研究学者グラント（RSG-12-148-01-DDC）とCIRM基本生物学賞（RB4-05779）supportedbyました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒトの皮膚ニューヨークの消防士 スキンバンクhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
両親媒性フェニックス細胞株ATCCCRL-3213
FUGENE 6 トランスフェクション試薬PromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
AdenineSigmaA-9795
Cholera Toxin Sigma C-8052
ヒドロコルチゾンCalbiochem3896
インスリンSigmaI-1882
EGFInvitrogen13247-051
トランスフェリン シグマT-0665
シプロフロキサシン塩酸塩血清学89-001-1
焼灼Bovie医療株式会社AA01
トリゲルコーニング354234
ケラチン1抗体BiolegendPRB-149P
四角い釘美術工芸品店
人間新生児ケラチノサイトATCCPCS-200-010
ヒト新生児ケラチノサイト細胞アプリケーション102K-05n
MSCV レトロウイルス ベクターClontech634401
LZRS レトロウイルス ベクターAddgene
pSuper.Retro.Puro レトロウイルス ベクターOligoengineVEC-PRT-0002 
臭化ヘキサジメトリン シグマH9268-5G
マ

参考文献

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