光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル

サマリー

この原稿は、莢梗塞のモデリング技術が記載されています。ここでは、手術前のターゲット・マッピング後の光の低強度で変性された光血栓技術を利用しました。この技術を使用して、我々は永続的な運動障害を持つ外接莢梗塞モデルを作成しました。

要約

近年の白質脳卒中の有病率の増加は、この分野での特別な研究を必要としています。しかし、白質脳卒中の適切な動物モデルがないため、研究研究が妨げられています。ここでは、隣接する灰白質構造への損傷を最小限に抑える限局性被膜梗塞を作成するための新しい方法について説明します。手術前の神経トレース法を用いて、アデノ随伴ウイルス緑色蛍光タンパク質(AAV-GFP)を用いた神経トレースを行い、内包内の前肢領域の体性組織を同定した。灰白質と白質の異なる光学特性に基づく光強度の調整は、灰白質の相対的な保存とともに白質の選択的破壊に貢献します。光神経インターフェースの正確な位置決めにより、内部カプセル内の前肢領域全体の破壊が可能になり、それが顕著で持続的な運動障害につながります。したがって、この技術は、持続的な運動障害を伴う複製性の高い莢膜梗塞病変を引き起こします。このモデルは、行動レベル、回路レベル、および細胞レベルでの白質脳卒中(WMS)の研究だけでなく、新しい治療およびリハビリテーション介入の開発に対するその有用性を評価するのにも役立ちます。

概要

最近まで、「灰白質ストローク（GMS）のモデルは、「排他的脳卒中の病態生理を理解するために、新しい治療法の開発を導くために使用されています。すべてのストローク^1,2の25％ -しかし、15を構成している高齢者における皮質下白質に影響を与えるストロークの増加罹患率がありました。多くの研究は、白質ストローク（WMS）モデルを使用したいくつかの研究がある一方で、GMSモデルを使用に関するストロークを行われています。げっ歯類における白質は、ヒトまたは霊長類における白質よりも実質的に小さいです。これにより、選択白質³に標的領域にアクセスして破壊することはより困難です。さらに、全く効率的なツールを選択的に標的白質の計画範囲を破壊するためにこれまでに開発されていません。したがって、白質ストロークの研究のための適切なモデルの欠如がありました。

動物目rokeモデルは、多くの場合、新たなリハビリテーションや治療法の開発のための運動回復の進行を監視するために使用されます。人間のストローク^4,5で実証解剖学的な変化と調和の長期神経学的欠損を示す動物モデルを利用することが理想的です。この点において、梗塞lesioning以下の運動障害や脳の広い関与の急速な回復は、脳卒中の研究を追求して現実的ではないかもしれません。前嚢梗塞モデルは内部のカプセル^6-9にエンドセリン-1（ET-1）の内頸動脈または前部脈絡膜動脈と拡散の閉塞によってなされてきました。それにもかかわらず、動脈閉塞は、動脈の注意深い解剖が必要ですが、それは永続的な行動欠陥なしに、内部カプセルを含む梗塞病変の広い面積を、生成されます。また、ET-1は完全に内包後脚を破壊するために拡散していなかった、したがってより少ないとマークまたはBEHを持続しますavioral赤字。

光血栓梗塞モデルは広く皮質梗塞病変および皮質下構造¹⁰の様々なタイプを生成するために使用されています。技術は、小血管および梗塞病変の発生¹⁰で血小板凝集につながる焦点照明に続く静脈内投与が含まれます。ほとんどWMS病変^5,11を生成するために使用されていないのに対し、光血栓技術が広く、GMS病変を作成するために使用されてきました。この技術については、ローズベンガル染料および光照射の組み合わせは、対応する機能障害を引き起こし、ターゲット構造の破壊に有用であることが実証されています。それは梗塞病変の大きさを決定するので、光血栓技術の重要な要素は、光照射です。灰白質および白質に異なる影響で光照射の結果、光の散乱が白ミリアンペアで4倍以上高くなっているので、灰白質¹²と比較してtter。光強度が十分に低い放射照度（<1140ミリワット/ mm ^2）とがある場合したがって、1は光血栓病変が白質（ すなわち 、内部カプセル）に範囲に影響を与えるように拡張機能を制限することができます。例えば、より高いエネルギーの光は、グレーと白の両方の問題に梗塞を誘導することができる、まだ低いエネルギーの光のみが白質に光血栓を誘発する可能性があります。また、光エネルギーの普及率は非常に限られていました。光エネルギーの約99％は、光¹³のソースから1ミリメートルを超えて失われました。したがって、より低いエネルギーの光が隣接灰白質の最小限の侵略と白質にのみ光血栓を誘発し、正確に標的にすることを期待されています。

ここでは、げっ歯類における内部カプセルの前肢の領域に梗塞病変を作成するための新規な方法を説明します。私たちは、内部CAに前肢領域の識別方法を説明しますpsule、調整、光の配信、および梗塞病変の生成を含む光照射の技術、。我々はまた、莢膜モデルの完全性を評価するために使用される行動試験を記載します。

プロトコル

すべての手順は、光州科学技術院（GIST）の機関のガイドラインに従って行われた、すべての手順は、GISTで施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.事前lesioning手順

1. AAV-GFPを使用した内部カプセル内前肢地域の同定
   1. ハウスとSDラット（〜400グラム、11から13週間）を処理制度や国のガイドラインに準拠したこと。
   2. 適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。
   3. 筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩の混合物（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）で動物を麻酔。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。下の加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持動物の体。
   4. 耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。
   5. クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。
   6. 目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。手術部位への動物の上に滅菌ドレープを配置します。無菌状態ですべての手続きを維持しています。
   7. メスを用いて2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿棒及び30％過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。
   8. （2.5±正中線から：ML、ブレグマから2.5 AP）およびウイルス注入のためのマイクロcurretteで道をクリアする運動皮質の前肢領域の上にハンドピースのドリルを用いて穴を開けます。
   9. の氷と負荷1μlの上AAV-GFP（2×10 ¹²ウイルス分子/ ml）を解凍10μlのシリンジ内のウイルス。定位フレームに注射器を置きます。
   10. 既製の穴に針を移動し、硬膜深く針1ミリメートルを下げます。
   11. 高精度マイクロポンプを使用して（0.1マイクロリットル/分）、ゆっくりとウイルスを注入し、ウイルスが外に拡散することを可能にするために、追加の10分間の場所に針を残します。
   12. 生理食塩水による洗浄で手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。術後疼痛管理のための筋肉内注射を介してケトプロフェン（2ミリグラム/キログラム）を管理します。
   13. 加熱パッド付き体温（37℃）を維持し、必要に応じて皮下注射を介して筋肉内注射し、2％塩酸リドカインを経由して（0.1％、1ミリリットル）第二世代セフェムクラスの抗生物質を投与します。それは維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥位。完全復旧までのシングル家動物。
   14. 3週間の回復、深くフード内の筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩（300 mgの/ kg）を過剰投与によりラットを麻酔 - 2を以下に示します。つま先ピンチ応答、パルス、および呼吸の欠如によって動物の死を確認してください。フードにラット仰向けに置きます。
   15. 胸腔を開くには 'Y'字型の切開により腹腔を開きます。しっかりと止血剤と下行大動脈をクランプし、血液の排水のためのラットの心臓の右心房を破裂。 30分（10ml /分）のために4％パラホルムアルデヒドに続く5分（10ml /分）、冷1％パラホルムアルデヒドで心臓の左心室に灌流を開始します。
   16. ハサミを使用して、カーカスから、ラットの頭を削除します。鼻に首から正中切開を行い、頭蓋骨が露出するようにはさみや骨鉗子を使用して、首の筋肉を取り除きます。静かに脳から頭蓋骨とデュラスを解剖します。
   17. 脳を抽出し、一晩、4％パラホルムアルデヒドを充填した50ミリリットルコニカルチューブにラットの脳を置きます。次の日は、1×PBSで3回脳を洗浄し、30％ショ糖溶液に入れてください。
   18. 脳が完全に30％スクロース溶液の底に沈む後、cryotomeで-20℃で10月化合物とcryomoldで脳を置きます。 40ミクロ​​ンの厚さと200μmの間隔で前頭面で脳をスライス。
   19. スライド法^14を用いて、GFPの免疫組織化学染色を行います。 4℃で一晩脳切片に：一次抗体（抗緑色蛍光タンパク質、ウサギIgG画分の200 1）を適用します。 2 ^番目に日のTween-20（PBST）溶液を、1％リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、二次抗体を適用する：1時間（1ヤギ抗ウサギIgG（H + L）の500）。 1％のPBSTで3回スライドを洗浄します。脳切片上のカバーガラスを置きます。
   20. 蛍光顕微鏡（励起波長を使用して470nmで、発光波長525nmで、倍率5倍）、内部のカプセル内のAAV-GFP形質導入された軸索を観察します。形質導入された軸索の定位座標を決定するために、ラット脳アトラス¹⁵で形質導入された軸索の位置を比較
2. 莢膜梗塞モデル化するための適切な光強度の調整を事前にlesioning
   1. 光ニューラルインタフェースの構築
      1. 切削ドリルを使用して、内部スタイレットと27ゲージの脊椎針の適切な長さ（4センチ）カット。
         注：カッティング脊椎針の先端を圧縮して潰してもよいです。スタイレットを除去し、脊髄針の破砕部分を除去し、脊髄針の内側の口径を維持するために、脊髄針の先端を磨きます。
      2. 片側パッチコードの光ファイバ（62.5μmのコアと125ミクロン）のジャケットの適切な長さ（10センチメートル）を取り除きます。
      3. unjacked光学Fiのを挿入しますberの金属管（外径17ミリメートル：3.8ミリメートル、内径：3.3ミリメートル、長さ）に、次に繊維の周りにクランプされ、。金属管は、光ファイバや脊髄針のハブとの間の空間を充填すると便利です。二回押さえて金属管の1/2下を固定します。
      4. 光ファイバ上に熱硬化性エポキシ樹脂を適用し、脊髄針に光ファイバを挿入します。ハブ内の空きスペースに追加のエポキシ樹脂を適用します。安定した固定のために100℃で20分間、エポキシ樹脂を硬化させます。
      5. 脊髄針の外に突出する光ファイバを切断し、ダイヤモンドラッピング（研磨）のシートを使用して、脊髄針の先端に光ファイバを磨きます。
      6. 緑色レーザシステムのカプラにパッチコードのFC / PCコネクタ部品を接続して、デジタル光パワーとエネルギーメーターを用いた光ファイバの先端から光強度を測定します。

2. Photothrom内部のカプセル内botic梗塞Lesioning

1. 適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。
2. 動物を麻酔（〜400グラム、11から13週間）の筋肉内注射を介して塩酸ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）の混合物。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。動物の体の下に加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持。
3. 耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。
4. クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。
5. ANの上に滅菌ドレープを適用します。imalとは、手術部位を露出させます。無菌状態ですべての手続きを維持しています。
6. 2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿のスワップおよび過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。
7. ブレグマとラムダが同じレベルで整列されるまで、ノーズクランプの高さを調整します。重要なステップ：この位置合わせが正しく、主実験で内部カプセルに梗塞病変を行うのように、より深い構造にアプローチすることが重要です。
8. 光血栓を誘発するためにドリルを使って穴（3.0±正中線から：;：; MLブレグマから-2.04 AP直径2mm）を作成します。
9. ポーランドと光インターフェイスの光ファイバ先端を清掃してください。曲げず定位フレームにONIを修正しました。 ONIの先端をチェックして、光インタフェースの挿入前と後に明らかにそれを一掃。
10. opticaの挿入に先立って、光ファイバの先端からのレーザ強度​​を測定ラット脳の標的部位へのLインタフェース。光ファイバの先端に、手術前の手順によって確認されるように、3.5 mWのにレーザー強度を調整します。
11. 内部カプセルの標的領域にドリルスルーホール（手術前の段階から確認-7.8 mm）をONIを挿入します。
12. 光血栓中に37.5±0.5℃の体温を維持します。下半身の温度が梗塞の予想範囲を生成しないかもしれません。尾静脈からローズベンガル（2ミリリットル/キログラム）を注入します。
13. ローズベンガル注射後90秒1分間の532nmのグリーンレーザをオンにします。照射後、静かに脳からONIを削除します。手術部位を洗浄した後、傷は3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。
14. 偽手術群（SOG）の場合は、代わりにローズベンガルの生理食塩水の注入（0.2ミリリットル/ 100グラム）を除いて、同一の病変作りの手順を実行します。
15. 手術後の加熱パッドで、体温（37℃）を維持し、筋肉内注射を介して抗生物質（第2世代セファロスポリン、0.1％、1ミリリットル）を管理。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物によって占有ケージに手術後の動物を返さないでください。
    注：予備実験5ミリワット、1ミリワットから最適な光強度を見つけるために、同じ手順で行い、手順は異なる状態で病変の十分な範囲を取得するために必要とされ得ます。

莢膜梗塞Lesioning 3.評価

1. 行動試験と動物のグループ化
   1. ウィショーらによって記載されているように、単一のペレット到達タスクを実行します^。14ストロークモデル化した後、1週間毎日前肢の運動障害を評価します。単一のペレットに達するのタスクを実行します1cm幅のスリットと前壁の真ん中の前に食品の棚に明確なプレキシグラス（30×15×35センチメートルの高さ）を使用した食品制限動物では（SPRT）（対照体重の90％）。
   2. 好適な前肢の斜め反対側の食品棚にペレットを配置します。 3週間のセッションあたり20ペレットを管理します。
      注：SPRTsの成功数は、動物が食物ペレットを把握し、それを落とすことなく、口の中にそれを置くているリーチとして定義されています。
   3. 以下の式で定義される成功達するの百分率としてスコアを計算します。
      
      注：偽手術群（SOG）、緩やかに回復グループ（MRG）、および不十分な回収・グループ（PRG）：私たちは3つのグループに動物を分けます。もし脳卒中後SPRTスコア> 50％、我々は、実質的な病変の存在を示すMRG、としてラットを分類するが、TAのない完全な破壊目標確認。脳卒中後SPRTスコアが<50％プレストロークSPRTスコアと比較している場合、我々は目標に完全lesioningを示しPRG、としてグループを分類します。
2. 梗塞LesioningのNeurohistological確認
   1. 前述のように4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。脳が完全に30％ショ糖溶液に沈む後、10μmの厚さとミクロトームまたはcryotome ^4を用いて、200μmの間隔で冠状切片を行います。
   2. H＆E、ニッスル、ルクソールファーストブルーPAS、ニューロフィラメントタンパク質、Lまたはグリア線維酸性タンパク質染色および組織学的所見を観察で染色は、染色を観察する対象領域内部のカプセルの全体幅をカバーすることができ、最適な光強度を決定します^4,17。
   3. ImageJソフトウェアを使用して、脳のスライド上の内部カプセルの光血栓梗塞領域の体積を測定。
      1. 梗塞領域の体積を測定するには、「ImageJの「ソフトウェアを起動します。 （ 'イメージ」→「スタック」→「イメージスタックに'）を積層するファイルを開く」スタックへのイメージ」を選択します。編集ファイル名を選択し、スケールを編集する（→「スケールを設定します ''分析 '）'スケールを設定します」。
      2. 「プラグイン」で、選択した画像の容量や面積を計算するために「スタックを測定します」。 「スライス間隔」に2つの画像の距離間隔を挿入します。すべての画像のROI（関心領域）の描画を行い、「測定」をクリックします。
         注：ソフトウェア「ImageJの」は、自動的に各画像およびそれらの全体積の面積や体積を計算します。

結果

ここに提示された方法は、永続的な運動障害で外接莢梗塞を作成することを意図しています。従って、正確に手術前の段階において内蔵カプセル内の標的を決定することが重要です。内部のカプセル内の錐体繊維の体部位マッピングは、現在までに決済されていません。正しく内部のカプセル内の標的を同定するために、前肢領域が描写されなければなりません。運動皮質の前肢領域にAAV-GFP注射を内包（図1）においてピラミッド繊維の軸索を追跡することができる。例えば、ビオチン化デキストランアミン（BDA）のような他の神経トレーサーを、同様に使用することができます目的。内部のカプセル内の標的の定位座標を内包する運動皮質の前肢領域に由来の軸索突起を追跡することによって明らかにすることができます。

2週...

ディスカッション

ここで提示莢梗塞モデルは、前肢の機能の著しいと持続的な運動障害を持つ対象となる病変を示しています。皮質下の莢ストロークの前のモデルは、運動障害と迅速なリカバリ処理の^6,8,9の不十分な度合いを示しました。この意味で、このモデルは、長期的な機能障害を呈する臨床莢梗塞例に似ています。

外接莢梗塞モデルの開発において最も重要なステップは次のとおりです：1）が正しく内部カプセル内に機能を無効にすることを目的と身体部分の体部位表現を識別するために、 2）近隣の灰白質構造の最小限の侵略と内部カプセルの幅全体を破壊することができ、緑色レーザーの最適な強度を識別するために、 3）正確にターゲット構造の光ファイバを配置します。提示された技術は、外接を誘導することができるが、高複製率（> 70％）とD莢梗塞モデルは、内部カプセルの幅全体をカバーする破壊の完全性のターゲティングおよび程度の小さな差は、異なる運動障害を説明することができます。

皮質脊髄路は、体部位、組織¹⁵の論争にもかかわらず、ヒトに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DC温度コントローラー	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.
デジタル脳定位固定装置	株) ストールティング	51900
電気刺激装置	CyberMedic株式会社	EMGFES 2000
	精密繊維プロダクツ(株)	PFP-353ND1	配合比: 10(A):1(B硬化剤) 重量  硬化スケジュール: 1分 @150 >C 2 ~ 5 分 @120 >C 5 ~ 10 分 @100 >C 15 ~ 30 分 @80 >C
光ファイバースクライブ	THORLABS, INC	S90R
ファイバーパッチケーブル	KOREA OPTRON Corp.		外径:3 mm < br / > & Oslash;200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m
レーザー電源	長春新工業オプトエレクトロニクステック株式会社	MGL-FN-532nm-200mW-14010196
クリンプリング	ダウーテック(株)		長さ:19 mm 内径:3 mm 外径:3.8 mm 材質:SUS
Micro4-micro シリンジポンプコントローラー	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	95100
光パワーメーター	THOLABS, INC	PM100D
ダイヤモンドラッピング(研磨)シート	THORLABS, INC	LF3D	グリット: 3 & マイクロ;m
ダイヤモンドラッピング(研磨)シート	THORLABS, INC	LF6D	グリット : 6 & マイクロ;m
ローズベンガル	SIGMA-ALDRICH CO., LLC.	330000
ペンシルポイント先端付き脊椎麻酔用針(脊椎針)	B.ブラウン・メルズンゲンAG	4502027	サイズ:27 G 長さ:88 mm 針:0.40 mm
防水サンドペーパー	DEERFOS CO.,LTD	CC261	グリット : 1,000 & マイクロ;m
ナノフィル 10 &マイクロ;l シリンジ	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NANOFIL
Nanofil 33 G BVLD針	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NF33BV-2
AAV-GFP ウイルス	UNC ベクターコア	AAV2-CamKIIa-eYFP	2 x 1012 ウイルス分子/ml
抗緑色蛍光タンパク質、ウサギ IgG 画分	Life Technologies, INC	A11122	一次抗体 (1:200)
ヤギ 抗ウサギ IgG (H + L)	Life Technologies, INC	A11034	二次抗体抗体 (1:500)
セフテゾール	GUJU Pharma CO.,LTD.	A27802741	0.1%、1ml
リドカイン塩酸塩注射	ジェイル製薬(株)	A04900271	2%, 1 ml
ハンドピースドリル	セシン
デジタル光パワー・エネルギーメーター	THORLABS, INC	PM100D
ケトプロフェン	ユニビオテック