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方法論記事

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

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DOI:

10.3791/53302

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2016年1月5日

1Department of Biological Sciences, St John's University

この記事について

サマリー

本レポートは、リーシュマニア細胞抽出物を使用してホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのin vitro酵素アッセイについて説明しています。このアッセイは、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineから内因性ホスファチジルエタノールアミンへの放射性メチル基の移動に基づいています。

要約

ホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼは、S-アデノシル-L-メチオニンからホスファチジルエタノールアミン、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、またはジメチル-ホスファチジルエタノールアミンへの1つ以上のメチル基の移動を触媒する生合成酵素であり、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジルコリンのいずれかを生成します。これらの酵素は、動物細胞や真菌に遍在し、細菌の約10%にも見られます。それらは、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、細胞増殖、または病原性など、脂質代謝における直接的な役割を超えて、細胞生理学におけるさまざまな重要な機能を果たします。本稿では、全細胞抽出物を酵素源として使用して、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineからホスファチジルエタノールアミンへのトリチウム化メチル基の移動を測定する単純な無細胞酵素アッセイについて報告しています。得られたメチル化形態のホスファチジルエタノールアミンは疎水性であるため、有機抽出により水溶性S-[メチル-3]H]アデノシル-L-メチオニンから分離できます。このアッセイは、他の細胞タイプにも適用できる可能性があり、酵素を精製することなく、目的のホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼに特異的な阻害剤/薬物の試験に使用できます。

概要

ホスファチジルエタノールアミンメチル（PEMT）酵素は、モノメチルPEを与えるためにPE、モノ-PEまたはジメチル-PE上のメチル基供与体としてのS -adenosylmethionine（SAM）を使用して、1つ以上のメチル基の共有結合を触媒ジメチルPE、および/ ​​またはホスファチジルコリン（PC）。これらの酵素は、動物細胞及び真菌におけるほぼ遍在しています。彼らはまた、いくつかの植物1および細菌の約10％、真核生物2と相互作用する特にで見つけることができます。

PEMTsはだけでなく、他の重要な細胞機能を果たすことにより、動物細胞における主要な脂質クラスのPCの生産に貢献することによって、細胞の生物学に関連します。哺乳類では、PEMTsは、主に、それらは非常に低密度リポタンパク質の正常な分泌のために必要とされる肝臓で発現され、それらはまた、食餌誘発性肥満3、アテローム性動脈硬化4に寄与し、インスリンレジストンス5。さらに、哺乳類のPEMTも低いレベルにあるが、脂肪細胞に発現し、脂肪沈着6、7に参加しています。癌発生8、9アポトーシス、及び細胞増殖10 PEMT役割も実証されています。細菌では、PEMT酵素は、正常な細胞増殖2、毒性2、および宿主植物11との共生のために重要であることが示されています。

本プロトコルの目的及び論理的根拠は、酵素を精製することなく、全細胞抽出物からPEMT活性を測定することです。二つの異なるプロトコルがPEMT活性を測定するために開発されています。最初の、そして最も一般的なものは、この記事のトピックであるPE、上に放射性SAMからトリチウム化メチル基の転移を測定します。このプロトコルは、本来understを得るために12酵母および哺乳動物細胞（肝臓）13からPEMT活性を測定するために開発されましたこれらの酵素の特異性を決定するために、これらの細胞におけるPC生合成の論理積ならびに。以降、この技術は、（15けれどもアッセイの基本的なpH値を使用して）細菌2及び原虫寄生14などの他の細胞型に適用されています。この技術は、全細胞抽出物、ならびに精製された酵素を用いて使用することができ、潜在的に任意の細胞抽出システムにも適用することができます。非放射性のアッセイはまた、Sの -adenosylhomocysteine、SAM 16のトランスメチレーション産物の酵素の定量化に依存しているように設計されています。それは放射能を含まないように後者のアッセイは、より便利かもしれないが、それは精製された酵素にのみ適しています。

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プロトコル

1.細胞抽出物の準備

  1. 20mMのpH7.4のHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのヘムを補充した1×M199からなる培地中で26ºCで気密キャップで密封滅菌プラスチックボトルにリーシュマニア細胞を増殖させます振盪せずに、0.35グラム/ LのNaCO 2 H、0.1mMのアデニン、および2 / mlのビオプテリン。これらは1〜2×10 7 / mlの細胞密度に達したときに4ºCで5分間1,500 gでの遠心分離によって細胞を回収。
  2. ピペットで上清を捨て、冷リン酸緩衝生理食塩水（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKClを文化のボリュームの半分に血清学的ピペットで細胞ペレットを再懸濁することによって細胞を洗浄、10 mMのの Na 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4の）。 BL2の安全ガイドラインに従って、細胞上清を廃棄してください。
  3. 4ºCで5分間1500グラムで再び遠心細胞。ピペットで上清を捨てます。トンを続行次のステップOまたは（3ヶ月まで）-80ºCで長期保存のために液体窒素中で細胞ペレットを凍結スナップ。
  4. 2X溶解バッファー（0.5Mスクロース、0.1MのトリスHCl、pH7.5の、2mMのEDTA、および2倍プロテアーゼ阻害剤カクテル）を準備し、氷上で4ºCで保管してください。
  5. 2X溶解緩衝液の等量（新鮮または凍結した）細胞ペレットを再懸濁します。ガラスビーズの1倍のボリュームを追加します。 10分間4ºCで激しくボルテックス。
  6. 1×溶解バッファーの2容量を加え、混合します。破壊されていない細胞および核をペレット化するために10分間、4ºCで1,500×gで遠心分離細胞抽出物。
  7. 新鮮なクールな遠心管にピペットで上清を移し、実験終了まで氷上で細胞抽出物を保持します。

2.このようなビシンコニン酸アッセイなどのタンパク質推定キットを用いて細胞抽出物のタンパク質濃度を決定します

  1. S（II）、BCAと銅を混合することにより、ビシンコニン酸（BCA）溶液（1ミリリットル/チューブ）を準備49の比でulfate：1（v / v）です。
  2. BCA溶液1mlアリコートに10 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を希釈することによって、0のタンパク質標準を準備10、20、30、40、50、および60μgの/ mlでした。
  3. 重複でBCA溶液1ml中の細胞抽出物の2μLを加えます。予め温めておいた60℃の水浴中で10分間、標準およびタンパク質サンプルをインキュベートします。
  4. 転送サンプルを3分間氷に。 562ナノメートルの波長で分光光度計を用いて基準とタンパク質試料の吸光度を測定します。
  5. 製造業者のプロトコルに記載されているように参照としてBSA標準を使用して細胞抽出物のタンパク質濃度を計算します。 1×溶解緩衝液で10mlのMG /タンパク質濃度まで細胞抽出液を希釈します。

チューブあたり200μl中3酵素アッセイ

注：化学フードで次の手順を実行します。

  1. 15ミリリットルの重複の各サンプルをテストコニカルチューブ。チューブあたり20μlの1 MトリスHCl pHが7.5を用意し、氷上で保管してください。クロロホルム/メタノール2mlを調製（1：1（V / V）溶液停止）を各チューブのための室温​​です。
  2. ピペットで氷の上の各15ミリリットルコニカルチューブ中の1MトリスHCl pH7.5の20μlの。
  3. ここで上から放射線安全ガイドラインに従ってください。 SAMの50.06μMの合計チューブあたり[メチル- 3 H]アデノシル-L-メチオニンおよび50μM冷たいSAM - 0.06μM（0.2μCiの）Sと同等のものを追加します。冷水μlの追加xここで、x = 200-（20（+細胞抽出物のための20（）+寒さと放射性SAMのボリューム）バッファ用）チューブあたり。
  4. 予め温めておいた30ºCの水槽に各コニカルチューブに移します。反応を開始するために各チューブに細胞抽出物（タンパク質200μgの相当）の20μLを加えます。所望の時間（0〜45分）インキュベートします。
  5. クロロホルム/メタノール2mlを加えて反応を停止し（1：1、V / V、停止液）を各チューブにします。 RT（20〜25にコニカルチューブを転送6; C）。

4.脂質抽出

注：化学フードで次の手順を実行します。

  1. 酵素反応試料を含む各チューブに水700μlを添加します。 30秒間激しくボルテックス。 RTで5分間1,500×gで遠心分離し、水相から有機を分離します。
  2. ピペットで新しい15ミリリットルコニカルチューブに低い有機相を転送します。 30秒間激しくボルテックスチューブとを含む各「下相」への水の1ミリリットルを追加します。遠心分離は、再び5分間1500×gで水相から有機を分離しました。
  3. ピペットを用いてシンチレーションチューブに低い有機相を転送します。 N 2気流下で乾燥したサンプル。放射線のガイドラインに従って非取り込まれた放射性SAMを含む水相と放射性コニカルチューブを廃棄してください。
  4. 2ミリリットル/シンチレーション液のチューブを追加します。シンチレーションCOUに取り込まれた放射能を測定しますメーカーのプロトコルと、機器の用途に応じてNTER。
  5. 以下の一般式を使用して、ナノモル/ mgのタンパク質における酵素活性を計算します。
    CPM値は×10 3×[SAM（MM）の合計（放射性およびコールド）濃度]放射性SAM（CI /ミリモル）xの×5特異的活性[放射性SAMの濃度（mM）の]
    注：上記のプロトコルは、依存のSAM濃度またはタンパク質依存PEMTアッセイのために変更することができます。 SAM濃度依存的酵素アッセイについては、時間（線形範囲内である15分）、一定に維持され、タンパク質依存PEMTアッセイ、SAM濃度（ここでは0.05 mMのを選んだ）と時刻ながら冷SAMの種々の量をアッセイに添加します（15分間）一定に保たれます。また、緩衝液のpHは、いくつかのPEMT酵素は異なる最適なpH値を持っている場合、必要​​に応じて変更することができます。

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結果

図1は、基質としての内因性のPEを使用して、酵素源としてリーシュマニア全細胞抽出物を用いて行った時間依存PEMTアッセイを示します。有機相中の放射能の量をシンチレーション計数によって定量しました。得られた数値を、PEに転写トリチウム化メチル基の量を計算するために利用されました。 PEMT活性は、約20分間のリニアました。それは、それがさらに15分間一定にとどまった後、約30分でプラトーに達しました。予想されるようになし、細胞抽出物は、アッセイ（ 図 2）に添加しなかった時、PEMT活性が検出されませんでした。また、この活動は、Lの阻害剤である100μMのオクタデシルトリブロマイドの存在下で廃止されました大手 PEメチルトランスフェラーゼLMJ PEM1およびLMJ PEM2 14。 PEMT活性はまた、タンパク質濃度たdependenトン、そしてこの活動は、酵...

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ディスカッション

この単純な、迅速なPEMTアッセイは、タンパク質源として、全細胞抽出物を使用して、PE上にSAMからの放射性のメチル基の転移に起因するPEのメチル化形態の定量化を可能にします。これは、高速の敏感な、再現性、および精製された酵素を17にも適しています。興味のメチルトランスフェラーゼは、これらの基板にではなく、PE 12,13,18,19に固有である場合モノメチルまたはジメチル-PEは、アッセイに追加することができます。精製PEMT酵素が使用される場合、PEがアッセイに添加することができます。このプロトコルの制限は、アッセイは、反応生成物（モノ-PE、ジメチル-PE、またはPC）を識別していないということです。 20,21で説明したようにしかし、反応生成物の同一性（モノメチルPE、ジメチルPE、PC）は、さらに、1次元薄層クロマトグラフィーによって分析することができます。さらに、このようなSの -adenosylhomocysteine ​​及び5'-メチルチオなどのSAMの分解生成物のいくつかはPEMT活性Bを阻害することができますYフィードバック...

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開示事項

興味のある競合が宣言されていません

謝辞

この作業は、NIHの助成金ARRA RO3 AI078145とRZへの1SC3GM113743の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
S-[Methyl-3H]アデノシル-L-メチオニン(5-15 Ci/mMoleの比活性)Perkin ElmerNET155050UC試薬を分注し、-20°Cで凍結します。C;この試薬を使用している間は放射線安全ガイドラインに従ってください
プロテアーゼ阻害剤カクテルロシュライフサイエンス11836170001新鮮に希釈してください 
ガラスビーズ、酸洗浄、425-600 mmシグマアルドリッチG8772
ビシンコニン酸溶液シグマアルドリッチB9643
硫酸銅 (II) シグマアルドリッチC2284
シンチレーションカウンター MicroBeta2 1検出器付きパーキン・エルマー 2450-0010
分光光度計 Biomate 3Thermo Scientific840208300
BSA 原液 (10 mg/ml)New England BiolabsB9001S
シンチレーション液 Research Product International Corp111198
S-(5'-アデノシル)-L-メチオニンクロリド(塩酸塩) Cayman Chemicals13956、試薬を20 mM HClで希釈し、アリコートを-80°Cで凍結します。C 
は

参考文献

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