リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

サマリー

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。

要約

効率的な免疫応答は、感染または傷害の部位への血液の白血球の急速な動員に依存しています。 in vivoでの白血球遊走を調査することは、血管内皮と白血球の経内皮遊走との相互作用の分子基盤を理解するために重要です。一つの強力なアプローチは、目的の細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの生体顕微鏡を必要とします。

ここでは、倒立型共焦点顕微鏡でオレンジ色の色素で標識された好中球を注射されたCX ₃ CR1 ^{GFP /重量マウス}静脈撮像単球および好中球のためのプロトコルを提示します。タイムラプスムービーが両方の定常状態および炎症状態下腸間膜静脈の白血球の挙動の分析を可能にする画像の数時間に30分から集められました。ローカルTLR2 / TLR1アゴニストPam3SK4と血管の炎症を誘導し、subsequeを監視するために、我々はまた、手順を説明します好中球および単球のNT募集。

提示された技術はまた、白血球の他の集団を監視し、他の刺激またはトランスジェニックマウスを用いて白血球動員または輸送に関与する分子を調査するために使用することができます。

概要

好中球および単球は、継続的に血液中を循環自然免疫系の細胞です。傷害または感染すると、炎症性シグナルは、ここで、細胞性免疫応答^{1-3を開始し} 、破損して感染した組織への白血球の漏出を誘導します。白血球動員の迅速性は、免疫応答の肯定的な結果を決定します。これらの複雑なプロセスは、白血球に関与する分子の洞察を得る.TO循環白血球と内皮^1-3との間の接着の連絡先を確立するために役立つ炎症を起こした内皮に存在する特定の分子（例えば、セレクチン、内皮に結合したケモカイン）に依存しています採用カスケードは、細胞動員の動態を可視化するために、各セル/集団の挙動を追跡することが重要です。効果的な方法は、目的の細胞内で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスに生体顕微鏡を含みます。

現在までの内容は">、生体顕微鏡を用いて、いくつかの方法が画像に開発された血管系^4,5。例えば、耳の真皮の血管系や生体共焦点顕微鏡による腸間膜静脈の撮像は、マウスLy6C ^低い単球および人間のパトロール動作を識別するために使用されましたCD14は、定常状態条件^6~8の下の血管の管腔表面上のCD16 ⁺単球^を暗く。マウス精巣挙血管系モデルは、多くの場合、トランスジェニックマウスにおける炎症性または虚血状態下での好中球または炎症Ly6C ^高い単球の挙動を監視するために使用される。それは場合、精巣挙がIL1β、CCL2、TNFβまたはfMLPのの陰嚢内注射を介して刺激される。2-4時間後、組織はその後、外科的に露出されており、生体共焦点顕微鏡^9-11で分析しました。

以下のプロトコルは、任意のと同時に、単球および好中球を監視するための方法を記載倒立蛍光共焦点顕微鏡。また、私たちの方法は、白血球動員の動態を追跡するためにどのように前の画像と同じ容器を（定常状態）にし、炎症後及び方法について説明します。この目的のために、我々は、その単球のeGFPを発現し、IVオレンジ色素で標識されたマウスの好中球を注射されたCX ₃ CR1 ^{GFP /重量}マウスを使用しています。倒立共焦点顕微鏡を使用して、（1）追跡し、定常状態と、（2）局所炎症後の同じ容器の両方の単球および好中球の動員を追跡する下パトロールLy6C ^低い単球を分析することが可能です。ここでは、Pam3CSK4 ¹² TLR2 / TLR1アゴニストを使用して炎症状態を作成します。また、このような撮像は、特定のノックアウトマウスまたは遮断抗体^6,9,13の存在下で実行した場合の白血球動員カスケードの様々な段階での関心の特定の分子の役割を決定するのに役立つことがあります。

プロトコル

注：動物の手順は、スイスのジュネーブで動物ケアの機関倫理委員会、州立獣医事務所に基づいて行われました。認証番号GE / 14分の63。

骨髄からの単一細胞懸濁液の調製

1. 頸椎脱臼により犠牲マウス（8〜12週齢）。 70％エタノールで後ろ足を滅菌します。後ろ足から肌を削除します。
2. マウスの大腿骨と脛骨を解剖し、メスで脚から組織を除去します。 PBSで満たされた培養皿に90％のエタノールと場所で足を洗うこと。
3. 膝関節でメスと独立と大腿骨と脛骨から培養フード、クリーンな組織の下で。骨の両端をカット。
4. 23G針および調製培地を充填した1mlシリンジ（フェノールレッドを含まないDMEM / F12、1％ラット血清）を用いて、各骨からフラッシュ骨髄、50 mlのチューブにねじ。微妙23G NEを通じて継代することにより、細胞凝集体を混乱させるedleと1mlシリンジ。準備中で25ミリリットルに全量を。
5. 遠心分離機250×gで、5分間、4°C。上清を捨てます。 1ml中に再懸濁ペレットを赤血球溶解RBLCバッファー15ml中のチューブをネジ（8.3グラムのNH _{4 Clを} 、蒸留水で1リットルに完全に1グラムのNaHCO _3、1ミリリットルのEDTA（100 mM）の、0.22μmのフィルタ処理）。氷上で30秒インキュベートします。
6. 準備中と遠心分離250×gでの10ミリリットルを追加し、5分、4℃。 2ミリリットルの調製培地中の上清と再懸濁を捨てます。

ネガティブ選択により2好中球濃縮

1. マウスの好中球濃縮カクテル（細胞単離プラットフォームキットなどEasySepなど）を150μlを追加します。混合し、氷上で10分間インキュベートします。
2. フェノールレッドを含まないDMEM 10mlのを追加します。一度裏返し、遠心分離機250×gで、3分、4°C。
3. 上清を捨てます。下部チューブラウンド5ミリリットルポリスチレン中1.75ミリリットル準備中で再懸濁ペレット。 250μlのビオを追加選択カクテルインチ混合し、氷上で10分間インキュベートします。
4. 粒子を再懸濁するために30秒間（細胞単離プラットフォームキットから）磁性粒子を渦。細胞懸濁液に500μlの磁性粒子を追加します。混合し、氷上で10分間インキュベートします。
5. 磁石にチューブを置きます。 3分を待ちます。
6. 目的の非標識細胞を収集するために、下部のチューブ新ラウンド5ミリリットルポリスチレン上に磁石を反転。チューブにぶら下がって最後の一滴を取ってはいけません。不要な細胞は、磁石内部チューブ内に残ります。バイオハザード廃棄物の中に、このチューブを捨てます。
7. 磁石に新しいチューブを置きます。 3分を待ちます。
8. 新しい15mlを希望する非標識細胞を収集するためにスクリュー管に磁石を反転。チューブにぶら下がって最後の一滴を取ってはいけません。
9. フェノールレッドを含まないDMEMで5ミリリットルへの完全なボリューム。

好中球の3ラベリング

1. このような細胞トラッカーオレンジ（使用濃度としてオレンジ色の色素の0.5μLを追加1μM、CMRA - クロロ - rodol酢酸、DMSO中の10mMストック）。 37℃で2分間インキュベートします。
2. 準備中の2.5ミリリットルを追加します。遠心分離機250×gで、5分間、4°C。
3. 上清を捨てます。 1.5mlチューブで1ミリリットル準備中で再懸濁ペレット。
4. 血球計数器でカウントするアリコートを取ります。
5. 37℃で5分間インキュベートします。遠心分離機250×gで、5分間、4°C。
6. 上清を捨てます。 1mlのPBS中に再懸濁ペレット。遠心250×gで5分間、洗浄するために4℃。
7. 上清を捨てます。 100μlのPBSあたり10×10 ^{6個の細胞}として再懸濁ペレット。静脈内注射するまで氷上で保管してください。注：細胞は、可能な限り迅速に静脈注射する必要があります。 6-12x10 ⁶好中球/マウスは、通常、得られます。

生体顕微鏡4.マウスの準備

注：ステップ4.1）および4.2）は、IC上の標識された好中球の延長待ち時間を回避するために、実験の開始時に実行されるべきですE。

1. （8-12週齢）CX ₃ CR1 ^GFPマウスを計量。
2. （PBS中1.75ミリグラム/キログラムacepromazoneケタミン60 mgの/ kgで、キシラジン4.5mgの/キログラム）麻酔薬の800μLを準備します。
3. マウスを麻酔。マウスを200μl/ 20gで射出IP。ピンチと呼吸数をチェックすることにより、TOEによって制御麻酔。
4. 静脈内に実験者の都合で、外側尾静脈または眼窩洞を使用して、好中球（100μlのPBS中の10×10 ^6細胞 ）を注入します。
5. 加熱パッドの上にマウスを置くと、眼のゲルで目を保護します。
6. ガラスカバースリップ（直径35mm）の直径30mmの穴を有する10cmの組織培養皿に入れます。使用する油は、カバーガラスと接触している組織培養皿を維持することです。
7. 腹膜を露出するようにはさみで腹部の皮膚を切開。腸を露出するようにハサミで腹膜を切開。
8. Pに200μlのPBSを（37℃に予熱）を追加しますeritoneal空洞。あなたの手でマウスを取り、腸は穏やかな圧力で腹腔から外れているので、それは、下向きに回します。組織培養皿にマウスを置きます。
9. 静かに腸間膜の血管を露出させるためにカバースリップ上に滅菌綿棒で腸をderoll。
10. バンドにティッシュペーパーをカットし、37℃で加熱し、PBSでそれらを濡らし。蠕動運動から生じる運動を減少させるためにティッシュペーパーの作品で腸を固定。
11. 倒立顕微鏡のカスタムメイドのトレイステージに、37℃に温度調節チャンバー内に組織培養皿やマウスを置きます。後肢に麻酔薬SCを含む注射器を導入。注：また、マウスマスクで酸素（0.5 L /分）を受信することができます。
12. つま先をつまんや呼吸数を30分毎にチェックすることによって、麻酔のための制御マウス。必要に応じて、適切に麻酔を維持するために、麻酔薬のブースト（20μl）を提供します。 NOTE：血管系の乾燥は避けるべきです。したがって、その湿度を定期的に37°Cに加温したPBS腸を固定するために使用される紙組織を湿潤することによって維持されます。

5.生体顕微鏡を用いてin vivoで炎症を起こした船舶に好中球および単球挙動を測定

1. レーザー誘起光毒性を避けるために必要な最低限の電力で488と561-にレーザーを設定します。我々の実験では、0.5％未満です。好中球、単球におけるGFPとオレンジ染料の強度は、通常、0.3％が十分であるように明るいです。注：これは、我々のシステムで0.15 mWの0.25へのレーザーパワーを表します。
2. 倒立顕微鏡の20X乾燥対物レンズを使用して開いたピンホールで2.2秒で512×512ピクセル（ すなわち、635ミクロン）の画像を取得します。低レーザ出力で十分な信号を確実に、10〜20μmの間にZ深度を使用してください。
   注：我々は、通常12〜16の間のZ深度で実験を行います56;メートル。発表の数字や映画の場合には、Z深度は20μmです。位相差は、内皮壁の同定を可能にし、イメージングは​​腸間膜静脈に行われます。パトロール細胞が関心のある分野を記録し、5〜10ミクロン/分⁶の速度で、非常にゆっくりと移動するので、すべての20秒で十分です。記載されている設定では、電動ステージが同時に関心を最大7つのフィールドを記録することができます。
3. 彼らは最初の映画の獲得30分前の準備から回復することを可能にしているマウスと顕微鏡の恒温槽内の腸間膜血管を置きます。この間、関心のいくつかのフィールドを選択します。客観的に最も近い血管の管腔表面に焦点を当てています。必要に応じて、フォーカスを設定する内皮のわずかな自家蛍光を利用します。
   注：マウスの​​準備中に手術は少し内皮を強調しています。その結果、好中球のローリングと/または単球をマウスの準備の後の最初の15分間で観察することができます。
4. 定常状態の条件の下で30分、1画像ごとに20秒間の最初の映画を記録します。
   注：ソフトウェアが2.2秒の関心の各フィールドを取得し、電動ステージが自動的に他の1つのフィールドから移動します。なお、記録映画の30分の間に戻って20秒以内に最初の位置に戻ります。
5. 血管の炎症を開始するには、画像化された血管に直接TLR2 / TLR1アゴニストPam3CSK4 ¹²を100μgを含む20μlのPBSのドロップを追加します。
6. 興味のある各フィールドのフォーカスを制御します。
   注：取得の過程で、z軸上の焦点のわずかな変化が常に存在します。 10-20ミクロンのZ深さにもかかわらず、これは、蛍光強度の減少をもたらすことができます。必要に応じてそのため、手動で、各ムービーの最後に関心の各フィールドを再び焦点を合わせます。 30分-期間についてとに3時間まで記録映画TAL炎症の開始後。
7. 実験の最後に、頚椎脱臼により麻酔したマウスを生け贄に捧げます。

白血球の動画ファイルと追跡の6世代

注：ニコン収集ソフトウェアが.nd2ファイルを生成しますが、次の手順では、他のソフトウェアとブランドと同様です。

1. TIFFシリーズとしてエクスポートファイル。
2. ImageJソフトウェア（に行くhttp://rsb.info.nih.gov/ij/）。 TIFFシリーズをインポートします。別のファイルとして各チャネル。
3. バックグラウンドノイズを低減するために、緑と赤のチャンネル（処理>フィルタ>中央...）2.0ピクセルの半径のメディアンフィルタを適用します。
4. （バイナリを作る>プロセス>バイナリ）のバイナリにファイルを変換します。各画像のしきい値を計算するためのソフトウェアを有効にします。
5. 一つの画像シリーズ（画像>カラー> ...チャンネルをマージ）にチャンネルをマージします。 GREEで単球を選択nチャネル、赤チャネルと灰色のチャネルでの透過光中の好中球。
6. RGBの各色に積み重ねられた画像を変換する（画像>カラー> RGBにスタック）。
7. .AVIなどのファイルを保存します
8. データがインポートされ、IMARISソフトウェア（ビットプレーン）にまとめられています。単球および好中球の運動はその後、スポットトラッキングウィザードを使用して追跡されます。

結果

原稿を簡単にリアルタイムで麻酔したマウスの腸間膜静脈内単球および好中球の挙動を監視するために最適化されたプロトコルを記述します。 37°C-サーモスタット室の使用は、マウスの温度を維持し、また、白血球の温度依存移動によることが必須です。マウスの作製は、 図1、図2に示す顕微鏡で見たすべての領域に表示されます。透過光は、腸間膜静脈（赤矢印）と動脈（青矢印）の同定を可能にします。

そのようなムービー1ムービー2としてImageJソフトウェア生成されたムービーファイルと取得した画像の処理。 図3は、ムービー1の最初の時点のための画像処理の異なるステップが表示されます。 動画1が定常状態条件下でLy6C ^低い単球のパトロールを示しています、以前にデなどすべての好中球が血流に循環しているのに対し^、6,8,14をスクライブ。いいえ好中球は、内皮の壁をパトロールされていません。 ムービー2が局所的

ディスカッション

この原稿に記載された方法論は、効率的に定常状態および炎症状態下腸間膜静脈に単球および好中球の挙動を研究するための一貫したアプローチを提供します。

準備の重要なステップは、PBSで湿っ組織と腸の固定化です。正しく実行した場合、腸間膜血管がうまく画像取得のためのカバースリップ上に露出されています。これは、腸間膜静脈の白血球の挙動を監視するための関心のいくつかのフィールドを選択することができます。

我々のプロトコルは、（1）直接監視血管に炎症を誘導すること、及び（2）刺激後の初期の時点を記録し、（3）の反応速度に追従することを可能にする、実験開始前に、腸間膜血管の具象を伴います白血球の動員および炎症の誘導の前後で同じ容器内での挙動。

私たちは、TRANSFより多くの細胞は動物ごとに得ることができるER好中球（0.5-2x10 ⁶ /マウス対6-12x10 ^6）同じ遺伝的背景のマウス骨髄からではなく、血液から精製しました。血中の好中球の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5mlポリスチレン丸底チューブ	ベクトン・ディッキンソン	352058
10x CFI プランアポクロマート 0.45  DT:4mm	ニコン
20x CFI プランアポクロマート VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
浸漬油タイプA	ニコン		任意の粘性油
ライフボックス 温度制御システム	ライフイメージング
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R 共焦点顕微鏡	Nikon	A1R	倒立顕微鏡、電動x/y/zステージ、NISエレメントソフトウェア
PBS	Life Technologies	D8537
フェノールレッド フリーDMEM/F12	Life Technologies	21041-025	任意のフェノールレッドフリー培地は
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	PBSで再構成
ラット血清	幹細胞技術		EasySep マウス好中球濃縮キット
に含まれる 組織培養皿 100	TPP	93100