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方法論記事

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

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DOI:

10.3791/53328

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2016年5月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

この記事について

サマリー

私たちは、がんの光音響イメージングのための金ナノロッドを含む細胞ビヒクルの準備と実現可能性を示しています。

要約

金ナノロッドは、腫瘍への家庭への近赤外窓、低細胞毒性および電位の彼らの強烈な光吸収率のおかげで、このような光熱アブレーションおよび癌の光音響イメージングなどの生物医学的用途の範囲のために魅力的です。しかし、腫瘍への配信はまだ問題が残っています。革新的なアプローチは、in vitroでの金ナノロッドを装填できる腫瘍関連マクロファージの親和性の搾取から構成されています。ここでは、準備金ナノロッドを含む細胞の車両の光音響検査について説明します。 PEG化された金ナノロッドは、カチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物で修飾されています。通常のペトリ皿におけるマウスのマクロファージと接触すると、これらの粒子は、エンドサイトーシス小胞に大量の取り込みを受けることが分かっています。次に、これらの細胞は、その音響変換の安定性を確認するために使用される生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています粒子の携帯車へのそれらの包含に保持されています。私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための新たなインスピレーションを提供することができることを確信しています。

概要

過去10年間、金ナノロッド、ナノシェル及びナノケージ等の種々のプラズモニック粒子は、生物医学的光学系1、2、3、4における用途のために、かなりの注目を集めています。標準の金ナノスフィアと分散では、これらの新しい粒子が身体を通して最も深い光浸透し、内因性の構成要素1を超える最高の光学コントラストを提供し、近赤外（NIR）ウィンドウで共振します。この機能は、光音響（PA）イメージングおよび癌の光熱アブレーションなど革新的なアプリケーションのための関心を呼んでいます。しかし、いくつかの問題は、これらの粒子の臨床的浸透を抑制する。例えば、それらの光活性化は、その過熱を誘導するために、より球状photoinstability 5を駆動プロファイル、6、7、8に向かってそれらの機能的形状を変更する傾向がありますSUP>、9。科学的な議論を支配するもう一つの問題は、腫瘍へのそれらの全身送達です。具体的には、金ナノロッドは、強化された透過性と保持および悪性マーカーの特異的プローブとの結合の容易さを表示する腫瘍に浸透するのが理想的であるサイズを兼ね備えています。従って、血流への直接注射のためのそれらの調製が可能スキーム10、11、12、13として知覚されます。しかしながら、この経路は、粒子の大部分は、単核食細胞系10、11、12により捕捉さになって、問題が残ります。また、別の懸念は、本体14を通って循環した後の粒子の光学的および生化学的安定性です。粒子は、それらのコロイド安定性と凝集体を失うとき、彼らのプラズモニック機能や伝熱力学は、プラズモニックカップリング15に苦しむことがあり、 16、17、最大18クロス過熱。

より最近では、腫瘍関連マクロファージの親和性を利用する概念は、スマート代替19、20、21として浮上しています。これらの細胞は、高い特異性で腫瘍を検出し、みなぎるする生得的な能力を保持します。したがって、1観点は、患者からこれらの細胞を単離し、in vitroでの金ナノロッドでそれらをロードし、配達を担当する携帯車としてそれらを使用することを意図して、患者に戻ってそれらを注入することであってもよいです。もう一つの利点は、それらの生物学的インタフェースをin vitroで構築されるため、粒子の光学的および生化学的安定性をより細かく制御を獲得することです。それでも、光造影剤としてのこれらの細胞の車両の性能は、批判的な分析を必要としています。

本研究では、準備とcellulの重要な問題について説明します癌のPAイメージングのための金ナノロッドを含むAr車。 PEG化された金ナノロッドは、血漿膜23,24との相互作用を促進することが期待されているカチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物22で修飾されています。これらの粒子は、うまくいけば、それらの生物学的機能をあまり干渉することなく、ほとんどの携帯の種類の中から効率的かつ非特異的取り込みを受けます。マウスマクロファージはタイトエンドサイトーシス小胞内に閉じ込めなっセルあたり最大000、200のようなカチオン性金ナノロッド、までにロードされます。この構成は、これらの小胞の内部のプラズモンカップリングとクロス過熱の恐れの、懸念を生じなければなりません。したがって、マクロファージは、粒子のPA転化の安定性の大部分はエンドサイトーシス小胞の成長培地からの転送中に保持されていることを確認するために、生体組織を模倣する生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています。 EffectivEの測定基準は、PAイメージングのための即時の関心の条件下でPA変換の安定性を測定するために働いています。再形成閾値は10ヘルツの典型的な繰り返し率を有する50のレーザパルス列の後に、光不安定性の非常に開始時に設定されています。

私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための勢いを提供することができることを確信しています。

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プロトコル

注：金ナノロッドの全ての濃度は、公称のAuモル濃度で表されています。他の作品との比較のために、1 M Auをおおよそ我々の場合には、20μMの金ナノロッドに対応していることに注意してください。

カチオン性金ナノロッドの作製

注：この方法は、Ratto ら 26に従ってNikoobakht ら 25によって導入され、適応プロトコルに従って、アスコルビン酸とのHAuCl 4の自己触媒還元によるセトリモニウムブロマイド（CTAB）-capped金ナノロッドの合成を開始します。これらの金ナノロッドは、ポリエチレングリコールの組み合わせ10、11、27、28及び第四級アンモニウム化合物22を鎖によって、血漿膜のためのより多くの生体適合性および親和性を得るために変更されます。

  1. concentratioで24ミリリットルCTABをかぶった金ナノロッドを精製遠心分離の2つのサイクル（12,000×gで、30分）し、デカンテーションによって、450μMのAuのn個。初期体積へのデッドボリュームの比率は、このプロトコルですべての遠心操作のために周りの1/200以下であることを確認します。洗浄液として、500μMの水性CTABを使用し、最終的に500μMCTAB及び0.005％（v / v）のポリソルベート20を含むpHが5で6ミリリットルの100mM酢酸緩衝液中に粒子を移します。
  2. 30μlの10mMの水性アルファ - メトキシ - オメガ - メルカプト - ポリ（エチレングリコール）（MW〜5,000）を加え、37℃で30分間反応さ残します。
  3. ジメチルスルホキシド、N、N、N -トリメチルアンモニウムブロマイド、37℃で24時間安静に残す- 30μlの100 mMの（11-メルカプトウン）を追加します。
  4. 次に、水18 mlの0.005％（v / v）のポリソルベート20を追加して、遠心分離の4サイクル（12,000×gで、30分）、デカンテーションすることによって、これらの粒子を精製します。洗浄液として、水に0.​​005％（v / v）のポリソルベート20を使用して、最終的にpHで2.4 mlの滅菌PBS中に粒子を移します7.4。金の最終名目濃度は4.5 mmです。

ゴールドナノロッドとマウスマクロファージの2のロード

  1. J774A.1し、DMEM、10％ウシ胎児血清、1 mMグルタミン、100単位/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンのような培養培地を補充した単球/マクロファージ細胞株を使用してください。プレート直径60mmの4ペトリ皿中で5×10 5細胞及び剥離時のサブコンフルエントするように彼らは、24時間成長させる（ステップ2.2参照）。
    1. プロトコルを通して、標準培養条件（37℃、5％CO 2、95％空気および100％相対湿度）で細胞を維持します。細胞を操作するためにクリーンベンチ、適切な個人用保護具を使用します。
  2. 24時間後、キトサンフィルムに埋め込まれるように、カチオン性金ナノロッドで細胞をロードし、それらを準備します。
    1. 粒子が細胞によって取り込まれることを可能にするために、4.5のアリコートを加えます各ペトリ皿にmMのPBS中のAuのカチオン性金ナノロッドは、100μMのAuの最終濃度を達成するようになっています。 24時間のインキュベーションにペトリ皿のままにしておきます。
    2. 次に、それらの良好な条件とアップロードを確認するために、光学顕微鏡で細胞を観察します。細胞は、その正常な形態と暗細胞内小胞の数を示すべきです。以下の工程（少なくとも2×10 6細胞）を、細胞の適切な量を達成するために、2つのペトリ皿からそれらをマージし、スクレーパによって細胞を剥離し、いずれかを排除するためにそれら（120×gで6分間）遠心カチオン性金ナノロッドの過剰。携帯ペレットはほとんど黒になります。
    3. 2mlのPBSでペレットを中断し、Bürker室を利用して細胞を数えます。遠心分離機2×10 6個の細胞（120×gで、6分）し、室温で10分間、PBS中のホルムアルデヒド（w / v）の2ミリリットル3.6％で、そのペレットを修正を含む懸濁液。最後に、centrifugatすることにより、このペレットを3回洗浄固定液を除去するためにイオン（120×gで、6分）。洗浄液としてPBSを使用してください。

キトサンフィルムへのマクロファージの3埋め込み

注：キトサン26、27、28の固有の特性、29はカチオン性金ナノロッドを用いて染色したマクロファージを含有する生体模倣ファントムを生成するために利用されます。アガロースなどの他のヒドロゲルに関しては、キトサンは、PA顕微鏡6のために重要である、はるかに強いと薄いフィルムを可能にします。これらのファントムの製造は、以下の30の規定にいくつかの変更を加えて31、以前のプロトコル29、30に従って行われます。

  1. 酸性化した（酢酸の添加により得られるpHは4.5）及び粘性を3％（w / v）の低分子量のキトサン（平均分子量120 kDaの）溶液を調製し、十分に混合しそれは40℃で24時間均質化させ。
  2. 次に、キトサン溶液500μlを有するカチオン性金ナノロッド（2×10 6細胞）を含む、マウスのマクロファージを混ぜます。
  3. 、〜50μm厚のファントムを得る1.91センチメートル2ポリスチレン型に混合物の250ミリグラムを注ぎ、24時間窒素気流下でそれらを残すために。その後、架橋を誘導するために、500μlの1 M NaOHを用いてこれらのサンプルを処理し、超純水10mlでそれらをすすぎます。

光音響変換の安定性4.テスト

注：PA変換の安定性は、参考文献6に記載されている自家製のセットアップとPA実験によって調べました。

  1. プレートの底から〜5mmの間隔を保つように、ペトリ皿に浸漬プラスチックホルダーを使用することによって、例えば脱イオン水でマクロファージを含むキトサンフィルムを、サスペンド。このプレートは、マイクロメートルのXYステージ上に置きます試料の位置を制御するためです。
  2. 2500 - 400の波長範囲でYAGレーザー：QスイッチNdの第三高調波で励起光パラメトリック発振器から、 例えば、金ナノロッド（の縦プラズモンバンドと共鳴〜5ナノ秒のパルス持続時間を有するレーザービームをフォーカス〜300μmのスポット径を有する膜面に垂直nmおよび5ナノ秒のパルス持続時間）。
    1. レーザフルエンス調整するために、レーザー出口の前に減衰器を配置し、エネルギーメーター（ 例えば 、焦電検出器）にレーザービームの一部を集中し、フルエンスの変動を監視するために、ビームスプリッタを使用しています。アライメント時パルスあたり〜1ミリジュール/ cm 2の下の光フルエンスを維持します。レーザーがオンになっていれば、適切なレーザー安全メガネを使用してください。
  3. フィルム表面から約2 mmのペトリ皿に及びマイクロメートルの翻訳を使用してその位置を調整する - 超音波振動子（20から1MHzの周波数範囲）に浸し回転ステージは、膜から放出されたPA信号を最大化します。
  4. 試料6に損傷を与えないプローブフルエンスF LOを決定します。
    1. 1 MJ /少なくとも500パルスのパルス当たりcm 2の周りのフルエンスでサンプルのランダム点を照射します。各パルスは、オシロスコープと電力量計からの超音波トランスデューサとレーザフルエンスから対応するPA信号を取得します。 F LO トライアルとして平均フルエンスに名前を付けます。
    2. パルス数の関数としてのピーク・ツー・ピーク振幅としてPA信号の強度を算出します。レーザ強度の変動をカウンタウエイトにするために、F LO 試験への独自のフルエンスの割合各PA信号の振幅を正規化します。パルス数の関数としての正規化されたPAの強度の傾向を分析し、時間をかけてその安定性を検証します。
    3. 不安定性の場合には、繰り返しはF LOの低い値と4.4.3に4.4.1ステップ裁判アップ。安定性の損失が発生するまで、安定性の場合には、〜10％高いF LO 試験の値でそれらを繰り返します。安定性を保証F LO 試験の二番目に高い値としてプローブフルエンスF LOを設定します 。
  5. 整形閾値フルエンスを測定します。
    1. サンプルの別のランダム点を選択し、平均PA強度F LOで（I LO a）は、500を超えるパルスを探ります。
    2. F LOよりも大きい公称フルエンスを設定し、50パルスを提供します。 F EXCとしての平均フルエンスに名前を付けます。
    3. プローブ再びF LOで500パルスにわたって平均PA強度（I LO b）は 。比R = I LOの B / I LO計算します。団結以下のRの値は、サンプルの光学特性の不可逆的な変化の証拠を提供します。
    4. フィルムを移動させるために、マイクロメートルXYステージを使用して、POINを変更ランダムにサンプルのトン。周りと団結の上、下記のRのいくつかの値をとるように繰り返して、F EXCの異なる値と4.5.4に4.5.1を繰り返します。 15点が妥当です。
    5. FのEXCの関数としてプロットRおよびRは、統計的不確実性を超えたものと異なるし始めると、その値として番目の整形の閾値フルエンスFを識別します。6

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結果

ここでは、癌のPAイメージングのために金ナノロッドを含む細胞の車の可能性は、プロトコルの代表的な成果と一緒に示されています。

図1のTEM画像は、ステップ2の粒子のとTEMイメージングのための細胞の調製は、別の場所で17説明された後、ステップ1後の粒子およびそれらの細胞の車の通常の外観を示します。カチオン性金ナノロッドは、それらの正常な形態を維持マクロファージにおける大規模な蓄積を受けます。粒子は、タイトなエンドサイトーシス小胞の中に閉じ込めることが見出されています。

図2aは、カチオン性金ナノロッドを含むマクロファージの光伝送画像を表示し、この顕微鏡写真によって証明されるように、ステップ3の後にキトサンファントム中に分散させ、キトサンハイ...

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ディスカッション

腫瘍関連マクロファージを標的とする概念は、癌34、35、36に対抗するために強力な概念として浮上しています。ここでは、代わりにその破壊のために、これらの細胞は、その親和性の活用により、腫瘍に金ナノロッドをもたらすために携帯車として採用されています。この視点は、粒子の思慮深い設計、細胞とその特性評価への統合を必要とします。私たちは、カチオン性金ナノロッドを搭載したマウスマクロファージの光安定性は、それらのプラズモンカップリングとクロス過熱が重要ではないことを意味する、エンドサイトーシス小胞内の粒子の閉じ込めが生じないことを見出しました。私たちは、PEG鎖と、金ナノスフィアなどのオフ共鳴している形状の発生率は、周りに（それらの直径17（ナノメートル10前後）と1熱拡散長についてですあまりにも密着、に入るために、粒子を防ぐという仮説を立て30 nmのそれぞれのプラズモンカップリングとクロス過熱のための5ナノ秒）、インチ

プロトコルは、粒子の設計において、それら...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は、部分的にERANET +プロジェクトLUSバブルとBI-TREの枠内Regioneトスカーナと欧州共同体によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムSigma-AldrichH6269金ナノロッドを合成する
金(III)塩化三水和物Sigma-Aldrich520918金ナノロッドを合成する
硝酸銀Sigma-AldrichS6506金ナノロッドを合成する
L-アスコルビン酸Sigma-AldrichA5960金ナノロッドを合成する
水素化ホウ素ナトリウムSigma-Aldrich金ナノシードを合成するには
MeO-PEG-SHIris BiotechPEG1171金ナノロッドをPEGylate化します。分子量:約5,000 Da。
酢酸Sigma-Aldrich320099PEGylate金ナノロッドとキトサンを可溶化する
酸ナトリウムSigma-AldrichS8750To PEGylate金ナノロッド
(11-メルカプトゥンデシル)-N,N-トリメチルアンモニウムブロマイドSigma-Aldrich733305四級アンモニウム化合物ジ
メチルスルホキシSigma-Aldrich276855可溶化 (11-メルカプトウンデシル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム臭化ポリ
ソルベート 20Sigma-AldrichP2287遠心分離機 PEG化金ナノロッド
PBSロンザBE17-516F細胞とのインキュベーション前に金ナノロッドを懸濁し、細胞のペレットを処理する
J774a.1ATCCTIB-67単球/マクロファージマウス細胞株
DMEMロンザBE12-707F細胞培養液
FBSロンザDE14-801F細胞培養液に添加する
L-グルタミンロンザBE17-605E
ペニシリン/ストレプトマイシンロンザDE17-602E細胞培養液に添加する
ペトリ皿NEST705001細胞培養ディッシュ
セルスクレーパーユーロクローンES7018細胞を切り離す
ホルムアルデヒドフルカ47630細胞を固定する
キトサン、低分子量シグマ・アルドリッチ44886975-85% 脱アセチル化。分子量約120,000 Da。
ヒドロキシドナトリウムSigma-Aldrich306576キトサンを不溶化し、ハイドロゲルを生成する
ポリスチレン細胞培養プレートNEST702011キトサンハイドロゲルを製造するための金型として使用
QスイッチNd:YAGレーザーの第3高調波によって励起される光パラメトリック発振器Continuum、サンタクララ、米国Surelite OPOプラス光音響試験のための光学励起源
焦電検出器 Gentec、ケベック州、カナダQE8SP光音響テストのための光学フルエンスを監視するには
事前に増幅された針ハイドロフォンPrecision Acoustic、ドーセット、英国1 mmのセンサー直径と1-20 MHzの周波数範囲を持つモデル光音響信号を測定するには
酢ムで金ナノロッドを修飾する

参考文献

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