定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

サマリー

このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。

要約

転移性疾患は、遠隔臓器への癌原発部位から悪性腫瘍細胞の広がりであり、癌関連死¹の主な原因です。転移拡散の一般的な部位は、肺、リンパ節、脳、および骨^{2が含まれます} 。転移を駆動機構は癌研究の激しい領域です。その結果、転移の離れた部位に転移性の負担を測定するための効果的なアッセイは、癌研究のために尽力しています。乳房腫瘍モデルにおける肺転移の評価は、一般的に解剖後の肺組織の肉眼定性的観察することによって行われます。転移を評価する定量的方法は、現在、 エキソビボおよびユーザ定義のパラメータを必要とするインビボイメージングに基づく技術に限定されています。これらの技術の多くは、生物全体のレベルではなく、細胞レベル^3-6です。多光子顕微鏡法を利用し、新しい画像形成方法は、メタ情報を評価することが可能であるが細胞レベル⁷でtasis、これらの非常にエレガントな手順は、普及のメカニズムではなく、転移性負荷の定量的評価を評価するのにより適しています。ここでは、定量的に転移を評価するための簡単なインビトロ方法が提供されます。腫瘍細胞特異的mRNAは、マウスの肺組織内で検出することができ、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用。

概要

QRT-PCR分析は、腫瘍の転移を評価する方法として提案されています。この方法は、転移の評価に興味を持っているが、このようなin vivoイメージング機器や蛍光できるステレオスコープのような特定の機器へのアクセス権を持っていない可能性があり、ユーザーのための代替として提案されています。一般的に使用される方法の議論は、QRT-PCR分析は、分離してまたは転移を評価するためのコンパニオン方法としても使用することができる方法を実証するために続いて提示されます。この手順は、転移性負荷の定量的な分析を提供する可能性を有します。

実体顕微鏡下での肺の可視化だけでなく、肺組織のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行った連続切片を含む総分析の標準的な方法は、定量化可能であるが^{、2-5をカウントするための}ユーザー定義のパラメータに大きく依存しています。実体顕微鏡を用いて全肺を評価する際に、唯一の大きな表面転移がVISIですBLEと分析は、転移性病変を構成するものを決定するために、肺の解剖学的構造の合理的な知識を持っている研究者を必要とします。例えば、GFP（例えば、GFPのための510分の470 nm付近）適切な励起/発光極大を持つ光キューブが含まれている実体顕微鏡の使用などのマーカーによる腫瘍細胞の蛍光標識、このプロセスを支援するが、表面だけの腫瘍結節が検出可能です。さらに、GFPと同じパラメータの下に表示されている血液汚染からの蛍光は、可能な転移病変の偽の身分証明書につながる可能性があります。

肺転移を可視化するために、H＆E染色に続いて肺の切片は、微小転移および免疫細胞の浸潤を含む他の微細なプロセスを評価するための有用な方法であるが、多くの場合、肺全体のパラフィン包埋のための組織、切片、および染色手順を使用する必要があります。そのため、下流の手順は、このメト次理想的ではありませんD。定量化が、この手順では、分析は、肺の全体の三次元構造を考慮していることを確認するために、動物あたり染色した肺切片の多数を評価するために研究者が必要となります。その結果、検査のこのタイプは時間がかかり、エラーをカウントにつながることができ、解析は研究者の裁量に大きく依存しています。

イメージング技術（例えば、MRI、PET、SPECT）は、現在、実験的なげっ歯類モデル^8の生物学的プロセスを実行またはテストするために使用され、インビボでのいくつかの。 インビボでの生物発光イメージングは、転移⁹の全体のビューを取得するために使用される一般的な方法です。この技術は、一般に、腫瘍細胞移植後の乳腺および自然転移の際に肺のような特定の器官に存在するルシフェラーゼ応答エレメントを含むように操作された腫瘍細胞の蓄積を、ルシフェラーゼレポーター活性の存在を評価するために適用されます¹0。ルシフェラーゼレポーター活性の可視化は、ルシフェリン基質（D-ルシフェリン）の存在によって誘導されます。ルシフェラーゼは、生物発光を生成するオキシルシフェリンするD-ルシフェリンの酸化的脱炭酸を触媒します。有益ながら、この方法は、基板の安定性（ すなわち、短い半減期）、それが実験動物に送達されるかに依存して、基板の適切な分布、および検出⁹の低い感度を含むいくつかの要因によって制限されます。この手法の主な利点は、それが非侵襲性であるということである生きた動物に対して行うことができ、通常は解剖^9,10で収穫されていない可能性があり、複数の臓器における腫瘍細胞の転移の検出をもたらすことができます。

インビボイメージング技術の一つの正の側面は、肺組織をQRT-PCR分析を、パラフィン包埋のような二次的処置のために、またはここに提示させること乱されることです。しかし、QRT-PCRはtheoreticaあるためLLY検出のより感度の高い測定、総評価は、肺に存在する腫瘍細胞の低い数字を明らかにしないことがあります。有用であるが、上述の画像化技術は、現在記載QRT-PCR法を用いて、置換または補充することができます。 QRT-PCRは、肺内の腫瘍由来のmRNAの高感度測定を提供する可能性を有します。

プロトコル

プロトコルは、サウスカロライナ医科大学（MUSC）とその施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインや動物のケアの標準に準拠しています。

1.肺解剖

1. 乳腺腫瘍解剖（オプションの研究の目標にし、原発腫瘍の解析または尾静脈注射が行われたかどうかによって異なります）。
   1. IACUCと大学の規則に従ってイソフルラン麻酔の致死量を使用して、マウスを安楽死させます。外科的脱臼により安楽死を確認してください。
   2. 発泡ボード、手足の広がりとその背中にマウスを置くことによって解剖ピンとピンの。
   3. 70％エタノールでマウスをスプレーします。
   4. ピンセットを使用して、中央の動物の下部をつかみ。
   5. はさみを使用して、マウスの腹腔に穴を開けないように注意しながら、皮膚を介して首に向かって上方にカット。
   6. 腫瘍組織を明らかにするために手足の皮膚をカットバック。
   7. 腫瘍組織とPRを解剖そのような（このプロトコルでさらに議論されていない）、さらなる分析のために凍結または固定、などの好適な方法によってESERVE。
2. 肺組織切開。
   1. 前述のように腫瘍組織を採取した場合は、余分な皮膚を突き止めます。
   2. 鉗子を使用して、動物の下端に腹膜をつかみ、首の付け根に向かって上向きに切断開始。
   3. 慎重に胸腔内に出血する可能性のある血管を切断ないように注意しながら胸郭の左右両側に沿って切断。左と右胸郭の振動板と上部を切断することにより、肋骨の骨を削除します。
   4. 鉗子を使用すると、マウスの気管をつかみ、前方に引き出します。
   5. 解剖ハサミで気管を切断し、マウスから肺を削除します。
      注意：心臓は肺に付着したままであってもよいです。この問題が発生した場合、慎重にすべての5つの葉を収集するように注意して肺から離れて心を解剖（ 図1を参照してください ）。
   6. 過剰血液を除去するためにPBSで穏やかに洗浄します。
3. 肺組織の肉眼評価。
   1. オプション1：in vivoイメージング 。
      1. ルシフェラーゼイメージング、撮像前に〜10分のために、動物に腹腔内（ip）注射によるルシフェリン150mgの/ kgの用量を与えます。麻酔した動物や解剖後の除去（ 図^2）5時の生体内での画像の肺。
   2. オプション2：総評価。
      1. 腫瘍結節を視覚化するために実体顕微鏡下肺を調べます。注意：細胞は、GFP標識されている場合は、GFPを検出する（510分の470 nm付近など ）、適切な励起/発光極大を有する光キューブを含むことが可能な蛍光実体は、処理の前に蛍光を立体的に肺を調べるために使用することができます。
   3. 肺は直ちに分析する場合は、「RNAの単離」セクションに進んでください。それ以外の場合は、liquを使用して凍結組織をスナップID窒素やドライアイス。 -80℃で保存してください。

2. RNAの単離

注意：代表的な分析のために、RNAは、RNA単離キット（材料リストを参照）を用いて単離しました。現在の分析は、ある特定のメーカーの製品を使用していますが、単離キットの様々ないくつかの評判のベンダーから入手できます。さらに、非キットベースの遠心分離法も選択肢です。 cDNAを、標準曲線分析のために、そのような細胞株またはプラスミドとして、陽性対照RNAサンプルから調製されるべきです。あるいは、プライマープローブセットに特異的な陽性対照は、（材料のリストを参照）を購入することができます。

1. 以前に凍結組織を使用する場合は、ドライアイス上で凍結組織を収集します。
2. など、次の方法のいずれかを使用して組織をホモジナイズ：液体窒素中で組織を凍結した後、ドライアイスの上に手で行わ研削乳鉢と乳棒を。組織ホモジナイザーまたは機械的解離デバイスメーカーの提案につき、超音波処理、または他の好適な方法。
   注意：代表的な分析のために、均質化の好ましい方法は、超音波処理です。
   1. 図3に示す分析のために、溶解緩衝液の各1 mlのために20μlの2-メルカプトエタノールの割合で溶解（RNA単離キットで提供される）バッファ及び2-メルカプトエタノールを調製します。 30％の振幅に設定ソニケーターで10秒のための組織と超音波処理の各30グラムのために2-メルカプトエタノールを補充した300μlの溶解緩衝液中で再懸濁組織。
   2. 乳鉢と乳棒を使用した場合、粉砕後、300μlの溶解緩衝液中で粉砕組織を再懸濁します。
3. 590μlのTEバッファー（; 1mMのEDTA、10mMのトリス-HCl、pH8.0）に10μlのProteinase Kを追加します。組織の（ すなわちすべての30mgのための）すべての300μlに600μlのProteinase K溶液を追加します。 RTで10分間インキュベートします。
   注意：消化時間が異なる場合があります。
4. ≥1で遠心サンプル破片を除去するために10分間3000グラム。
5. 新しいチューブに上清を移します。
6. RNAを沈殿させ、上清の各900μlの450μlのエタノール（96％-100％）を追加します。
7. カラムにライセート/エタノール混合物の700μlのを転送します。
8. 1分間≥13,000gで遠心分離サンプルがカラムにRNAに結合します。
9. 液体廃棄物を捨て、カラムに残りの上清を追加し、再びスピン。
10. すべての溶解液がカラムを回転させた後、30秒間≥13,000グラムでカラムと遠心サンプルの上部に洗浄緩衝液1の350μlを添加します。
11. カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。
12. 10倍DNアーゼの5μlのサンプルあたりのDNase / RNaseを含まない水（50μL/サンプルの総容積）の40μlのDNアーゼI酵素の5単位を混合することにより、DNアーゼを準備します。
13. 各列にDNアーゼミックス50μLを加え、室温で15分間インキュベートします。
14. カラムと遠心SAMに洗浄緩衝液1の350μLを追加30秒間≥13,000gでples。
15. カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。
16. カラムに洗浄バッファー2の600μlを添加し≥13,000gで30秒スピン。
17. カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。
18. ≥13,000gで2分間の洗浄バッファー2と遠心250μlのを追加します。
19. 新しいコレクションチューブにカラムの一部を入れて、古いコレクションチューブを捨てます。
20. カラムにRNアーゼ/​​ DNアーゼフリーの水の50〜100μl添加し、1分間インキュベートします。
21. ≥13,000gで1分間スピン。
22. 再実行したRNAの収量を増加させるためにカラムに通して回収した溶出液を。
23. すぐに使用するために、氷上でサンプルを維持し、定量化に進みます。後で使用するために、ドライアイスや液体窒素の凍結スナップ。 -80℃の冷凍庫で保存が必要になるまで。

3.ファーストストランドの合成

注意：代表的な分析のために、逆転写酵素（RT）反応を行ったFQRT-PCRのために設計されIRSTストランドcDNA合成キット（材料リストを参照してください）​​。

1. サンプルは、以前に収集された場合には、氷の上にチューブを解凍。
2. 分光光度計を用いてRNAの量を測定します。
3. トータルRNAの0.5~2μgのを使用して、cDNAのストックを生成するために逆転写酵素を用いて第一鎖合成を行います。
   1. 無菌の、RNアーゼ/ DNアーゼフリーPCRチューブ/プレートに、反応混合物（ 表1）を調製します 。穏やかに混合し、遠心します。標準的なPCR機（ 表2）をプログラム 。
4. 無菌のヌクレアーゼフリー水を使用して所望の体積（一般的に50〜100μL）に完成した反応を希釈します。

4.リアルタイムPCR

注意：代表的な分析のために、SYBRグリーンを使用しました。しかし、任意の好適な方法は、ユーザーの裁量で置換することができます。

1. 陽性コントロールのcDNAを用いて、各プライマーセットのための標準曲線を設定します。
   1. 私が示した分析についてN図3は 、陽性コントロールのcDNAを推奨メーカーを使用して、 ヒト HER2のための標準曲線を作成（材料リストを参照してください）。マウスGAPDHについて、標準曲線を生成するために、陰性対照肺のcDNAを使用しています。 5基準を生成するために、4：各プローブについては、連続的cDNAの1に希釈。
2. 標準曲線と実験試料を含めるべきで、総サンプル数を計算します。
   注：ここで説明する分析のために、サンプルあたり2~3実験の反復を分析しました。標準曲線解析は、最終的な正規化された量を計算するために、HER2とサンプルあたりGAPDHの相対量を決定するために適用することができる単純な線形回帰モデルを生成するために実施しました。この分析はまた、プライマー効率が手元に分析するために十分であることを保証します。
3. 滅菌、RNアーゼ/ DNアーゼフリーのチューブでは、マスターミックス（ 表3）を調製 。
   1. マスターミックスをamoun計算サンプルあたりトン。複数のサンプルのためにスケールアップ。関心の各実験の遺伝子だけでなく、GAPDHなど内部統制のためのマスターミックスを使用してください。 200nmの最終濃度でGAPDHのためのプライマーを使用してください。
      注意：ヒトおよびマウス細胞由来を区別しようとしたときに内部統制は特に便利です。
      注意：HER2のためのプライマー濃度が最適化され、製造業者によって決定されました。
4. 各標準または実験サンプルに対応した1μlのcDNAを含有する試験プレートを準備します。各プライマープローブについても、少なくとも1 cDNAサンプル/を割り当てます。各プライマープローブにウェルあたりマスターミックス19μLを追加します。
   注： 図3の代表的なデータのために、cDNAサンプルは、各プライマープローブの二重に分析し、2つのサンプルの平均値としてグラフ化。
5. 推奨または以前のPCRプロトコルを使用してテストQRT-PCR機で反応を実行します。 表4を参照してください 図3と図4の代表的なデータのために使用されるPCRプロトコルのtrong>。

結果

それは、インビボの腫瘍の分析で一、実験動物へと行った場合に、腫瘍細胞の最初の接種を行うために要する時間を超えて、組織採取、RNA単離、およびQRT-PCR分析（図1）1-2日間の手順であります。

総分析の例は、肺組織内の腫瘍細胞を評価するための生物発光イメージングです。ここでは、乳腺腫瘍形成実験をACT1と呼ばれるギャップ結合タンパク質コネキシン43を標的とする治験薬は、肺への4T1-LUC乳腺腫瘍細胞の自然転移を損なうかどうかを評価するために行きました。処置の数週間後、プラセボまたは試験薬剤を受けた動物は、ルシフェリンを注射し、屠殺しました。解剖時に、肺を、ルシフェラーゼ生物発光のために可視化しました。代表画像から、薬剤からその肺を表示されます処置した動物には腫瘍細胞がACT1処理（ 図2A）の後に転移の阻害を示唆し、肺に存在しないことを示してルシ...

ディスカッション

このプロトコルは、異種移植マウスモデルを使用して肺に乳腺腫瘍細胞の転移を評価するために、QRT-PCRの使用を記載しています。それは、生物発光イメージングを含む他の技術は、利用可能であり、また、自分の価値観と限界を持つにもかかわらず、転移を検出するために有効であることが認められています。提示されたデータは、QRT-PCRは、総転移の定量のための肺組織内の腫瘍由来のmRNAを検出するための有効な手段を提供することを示唆しています。これは、QRT-PCR分析を補完することができ、またはこれらの画像化技術の代わりに行うことも、二次の方法を提供することが提案されています。この技術は、機器の特定のタイプまたは転移性の負担の特定の利害関係はなく、詳細なメカニズムの研究と研究グループのためのアクセスが制限された研究環境に最適かもしれません。

有益ながら、ここで説明QRT-PCR分析には限界があります。これは、下流の追加を行うことができません免疫組織化学（IHC）又は免疫蛍光（IF）は、全肺組織をRNA単離のために使用されるため、染色などの分析。 インビボイメージング技術と対にな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール		Fisher BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	バイオ・ラッド	172-5121
PrimePCR SYBRグリーンアッセイ:ERBB2、ヒト	バイオ・ラッド	100-25636
SYBR Green Assay用PrimePCRテンプレート:ERBB2、ヒト	バイオ・ラッド	100-25716
gapdh プライマー配列			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG