情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

サマリー

トコジラミは、触角の嗅覚感覚に収容された嗅覚受容体ニューロンに依存して、環境中の記号化学物質を検出します。シングルセンシラム記録を利用して、セミオケミカルに対するトコジラミの反応を評価する方法を示し、関連するコーディングプロセスを探求します。

要約

昆虫嗅覚系は、環境内の情報化学物質を検出するのに重要な役割を果たしています。具体的には、内部の単一または複数の神経細胞を収容触角感覚器は、化学的刺激に応答するの主要な貢献をすると考えられています。直接刺激への暴露後に嗅覚感覚子に活動電位を記録することにより、単一感覚子記録（SSR）技術は、化学的刺激への虫の神経応答を調査するための強力なアプローチを提供します。悪名高い人間の寄生虫であるベッドのバグについては、嗅覚感覚子の複数のタイプが特徴づけられています。本研究では、2つの化学的刺激とSSRの方法を使用してそれらのいずれかの用量依存性応答にベッドのバグ嗅覚感覚子の神経応答を示しました。このアプローチは、develのための貴重な情報を提供するベッドのバグ嗅覚感覚子、上の個々の化学的刺激のための早期のスクリーニングを行うための研究者を可能にします新しいベッドのバグ誘引または忌避剤とメリットベッドバグ制御努力の発。

概要

一時的な外部寄生虫のように、彼らの生存、開発、および再生がヒトおよび動物^1,2の両方を含むホストからの血液供給源を必要とする意味義務吸血昆虫は、ある共通のベッドのバグトコジラミはL（トコジラミ科半翅目）をlectularius。ウイルス伝播はほとんどによるCに報告されていないが、 lectularius、侵入によって生成された痛烈な迷惑は真剣に物理的にも心理的に^3ホストに影響を与えます。導入と化学殺虫剤の普及は、特にDDT、蔓延のリスクを低下させ、1950年代の蔓延の終わりまでに、彼らはもはや深刻な社会問題だったような低レベルでした。しかし、可能な多くの要因は、そのような殺虫剤の使用削減として、世界的にベッドのバグ集団に国民の意識の低下を復活するために導いた、旅行の活動を増加し、殺虫剤^4-9に対する抵抗性の発達。

環境中の化学手がかりを検出し、このようなアンテナや上顎palpsとして嗅覚器官を通して昆虫によって認識されています。昆虫のアンテナの嗅覚感覚子は、これらの化学手がかりを検出するのに重要な役割を果たしています。化学分子は、キューティクルの表面上の孔を通して触角キューティクルを入力してください。臭気物質は、これらの化学分子に触角リンパバインド中のタンパク質と結合し、嗅覚受容体¹⁰の上にそれらを運びます。これらの化学分子が嗅覚受容体¹¹によって認識された後脱分極される神経膜上の非選択的陽イオンチャネルからの嗅覚受容体とそのコレセプター。

単一感覚子記録（SSR）は、化学的又は非化学的刺激のいずれかを適用することによって引き起こされる活動電位の細胞外の変化を検出するために開発されました。感覚子リンパ及び基準電極に記録電極を挿入し虫体（通常複眼または腹部のいずれか）のいくつかの他の部分に、刺激に応答するニューロンの発火率は^12を記録することができます。スパイクの数の変化は、特定の刺激に対する昆虫の感度を表します。異なるアイデンティティおよび濃度の化学的刺激は、異なる発射速度および時間的な構造と、異なる神経応答を誘発し、従って特定の化学物質に対する昆虫の符号化処理を調べるために使用することができます。

9溝付きペグCの感覚器、29毛髪様E（E1およびE2）感覚器、および1組Dα、Dβ、Dγ円滑なペグをそれぞれ共通ベッドのバグのために、両方の性的フォームがアンテナに嗅覚感覚子の同じパターンを共有します感覚器^13,14。複数のニューロンが感覚子の各タイプにおいて同定されているように、同じ感覚子に収容された別のニューロンからの活動電位を区別することは容易ではないので、この実験の踏太活動電位のL番号は、刺激前後の500ミリ秒の期間にわたってオフラインで計数しました。刺激後の活動電位の数は、刺激の前に活動電位の数から差し引かれ^、15秒あたりのスパイクの個々の感覚子で発火率の変化を定量化するために、2つを乗じました。

プロトコル

楽器、刺激ソリューション、およびトコジラミの調製

1. 20ミリリットルボトルに（w / v）の50％KNO ₂溶液を調製します。
2. 繰り返しにし、溶液からタングステン電極を浸漬することにより、5 VでKNO _2溶液中の2つのタングステン微小電極をシャープ。
   1. 大雑把で大幅タングステン線の先端を消費することができる2ディップ/約5分間秒の速度でKNO _2溶液のうちタングステン線の約10mmを浸漬することにより、タングステン線をシャープに。
   2. 電極の罰金とシャープなポイントになるように繊細に、少なくとも1分間、2ディップ/秒の速度で内溶液のうちワイヤ先端の約1mmを浸漬することによって電極を研ぎます。それはベッドのバグ嗅覚感覚子のクチクラを穿刺するのに十分問題ないはずですが0.2から0.5ミクロンに達するまで頻繁に顕微鏡下で電極先端径を確認してください。
      注意：手動で鋭いものの電極稲光、KNO ₂溶液にタングステン線の浸漬速度は常に一定ではありません。もっと練習すれば、電極をシャープに比較的一定の速度を維持する方がはるかに簡単です。シャープ時間も電極がどうあるべきか罰金に応じて、不確実です。ここでは、〜0.2ミクロンの直径を有する電極先端部は嗅覚感覚子を通して穿刺のに十分です。
3. ストック溶液として1時10 V / Vの初期濃度にニート化合物のジメチルスルホキシド（DMSO）に化学的刺激のそれぞれを希釈。各化学物質のためのストック溶液のそれぞれから、DMSOで再び、実験に必要などのように多くの投与量に応じて、常用希釈系列を作成します。 βピネン及びユーカリプトール - ここでは、10％（+）を使用します。
4. 食物を与えられていないか、7日間置き、後送りフォートから（男性または女性のいずれか）大人のベッドのバグ。ディックスコロニー（ケンタッキー大学で博士ヘインズからの贈り物）は、Tで使用します彼はペトリ皿で​​実験します。
   注意：ペトリ皿に入れ、ベッドのバグのための正確な数はありません。これは、いくつかまたは多くをすることができます。

2.トコジラミ触角準備

1. 氷上でトコジラミ（2-3分）麻酔し。
2. 両面テープで顕微鏡カバースリップ上のアンテナおよび昆虫の体の両方を修正して、細かいハサミで脚を取り外します。
3. 着実にテープ上に固執するように静かにアンテナを触れないように、小さなピンを使用してください。
4. 操作を容易にし、記録電極（ 図1）のために適切な角度（〜90°）にそれを調整するために歯科用ワックスの小さなボール（〜直径1cm）に対してカバーガラスを置き。
5. 一度、ステレオ顕微鏡下ベッドのバグを配置冷光源をオンにし、アンテナが明確に提示されるまで、照明の明るさを調整し、高倍率でトコジラミアンテナの第二の鞭毛に顕微鏡を集中、確保（720X） 。
   注意：実験に用いた照明の強度は、実際に実験者の目は照明の強さを感じる方法に依存する、定量化されていません。

3.シングル感覚子記録

1. 信号記録と可視化のためのコンピュータに接続された信号取得制御部、プリアンプ（10倍）を接続します。コンピュータの電源をオンにし、ソフトウェア、 例えば 、AutoSpike32を起動し、メニューバーから「記録」モードをクリックします。そして、波信号の記録を開始するように、「波」を選択します。
   注：繰り返しモニターの左から右に実行されている平らな線が表示されるようになるはずです。ここで、記録ウィンドウは40秒続きます。最大波記録は10秒です。選択されたサンプリングレートは96000であり、デジタルサンプリングレートは、オフセット0％無フィルタリング、記録信号の無整流あり240です。必要に応じてソフトウェアでこれらのすべてのパラメータ設定を変更することができます。
<李は>触角感覚子から神経細胞の応答を調色モードを提示するために使用されるプリアンプに接続されたスピーカーをオンにします。
2. 安定化されたベッドのバグの腹部に基準電極を挿入します。
   注：基準電極を磁気エアテーブルに取り付けられた金属製のスタンドにより開催されました。
3. 基準電極は、ベッドのバグの腹部に接続された後、プリアンプに接続し、ベッドのバグのアンテナの後方端に向かって、マイクロマニピュレーターによって操作された記録電極を移動。
4. 記録電極は、アンテナの右側先端部と接触しているとき、顕微鏡に切り替えて低倍率で電極を見つけます。
5. 電極と触角感覚子の両方が同一平面上にあり、顕微鏡下ではっきりと見えるまで徐々に倍率を増加させながら記録電極を調整します。
   注：この時点で、顕微鏡が普通です最高倍率でLY。
6. マイクロマニピュレーターを用いて、感覚子の軸に記録電極を挿入し、バックグラウンドノイズは、活動電位に比べて高い場合、少し深く行きます。
7. βピネン - 一度明確な活動電位を記録感覚子から観察され、10％（+）でマイクロピペットを埋めます。ガラスパスツールピペットの内部に配置された濾紙片（〜3×15 mm）の上にβピネン - 10％（+）の10μlアリコートを堆積させるためにマイクロピペットを使用してください。
   1. 刺激コントローラのパルス流管の出口にロードされたピペットを接続し、アンテナを指向管の小さな穴にピペットの先端を配置します。
8. すべてのこれらの接続が安定しているときに、連続的な加湿空気流中に刺激の0.5秒のパフ（0.5L /分）を送達するための刺激コントローラのフットスイッチを押し下げます。時footswitc活動電位の記録が同時に開始されますhが押されています。記録処理は、刺激の前に1秒を開始する10秒間の最後になります。
9. 2 500ミリ秒の期間、1の前と刺激後の1のためにオフラインで活動電位をカウントします。前の500ミリ秒の間に記録された自発的な活動から500ミリ秒後に刺激中のスパイク率の変化を引き、2を乗じてスパイク/ sの従来のスケールに数を変換します。

SSRの4刺激交換

1. ベッドのバグのアンテナ上にピペットでβピネンやピペットが除去された後10秒のためのこの特定の匂い物質に対する応答を記録 - フットスイッチがトリガされた後、10％（+）を提供します。
2. テストされる0.001％のユーカリプトールで別の新しいピペットにラベルを付けます。刺激の10μlを新しいピペットに、適用された上に、濾紙の小片を置きます。
3. 刺激が完全にvaporiするまで2-5分間待ちますガラスピペットでZED。パルス流管の出口上にピペットを取り付けます。
4. アンテナを志向管の小さな穴にピペットの先端を挿入します。フットスイッチを押し、10秒の記録を開始します。
5. ピペットを外し、0.01％のユーカリプトールで別のピペットを準備します。
6. 用量依存性の反応を観察するために触角感覚器のユーカリプトールの投与量（0.001％〜10％）のすべての残りの部分をテストします。ほとんどのテストは、希釈最低用量に希釈します。

結果

単一感覚子記録は、昆虫の化学生態学と神経生理学の研究に使用される強力な捜査手法です。別の揮発性化合物に昆虫の神経応答、昆虫の生存と発展に生態学的に関連すると考え特にの調査、昆虫嗅覚プロセスに私たちに貴重な洞察力を与えるだけでなく、潜在的につながる可能性があり、有望な新しい道を開くだけでなく、害虫駆除のために有用な新規試薬の開発に。

一般的なベッドのバグは、悪名高い都市害虫として、確かに多くの研究者の注目を集めています。ベッドのバグに関連する様々な研究分野の中で、彼らの嗅覚メカニズムは、ベッドのバグの化学生態学のために最も重要です。以前の研究では、ベッドの上嗅覚感覚子の異なる種類の数と分布を明示的に記載されていますバグアンテナ。 図2Aに示すように、ベッドバグアンテナは4つのセグメント（SC、PE、F1およびF2）を有します。嗅覚感覚子の大部分は第二鞭毛（F2）の後端に提示するが、その分布は、タイプごとに明らかに異なるさ...

ディスカッション

単一感覚子記録技術は、広くそのような環境で異なる化学的刺激に対するショウジョウバエ、蚊、ベッドのバグのような昆虫の神経応答を試験する際に使用されています。これらの化学的刺激は、多くの場合、治療の異なる用量を調製するために溶解させ、共通の溶媒で希釈します。しかし、異なる溶媒は、刺激のために非常に異なる放出速度を生成することができます。このようなキイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、 ネッタイイエカとネッタイシマカているなど、いくつかの広範囲に研究昆虫の以前の研究 これらの昆虫は、油^{17-20パラフィン}に比較的鈍感であるため、通常、刺激を溶解するための溶媒としてパラフィン油を使用していました。パラフィン油はまた、同様の理由^14として 、トコジラミの以前単一感覚子記録研究で使用されてきました。しかし、最も一般的に使用される溶剤は、それぞれの昆虫種のための最善ではないかもしれません。カリフォルニア州ベッドのバグはまた、非感受性を発揮するトコジラミ、パラフィン油およびDMSOの両方のSE、異なる研究^1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タングステンワイヤー	A-M SYSTEMS#	716500	電極の準備に使用
KNO2	Sigma	#310484	タングステンワイヤーの研ぎに使用
AC電源	BK精密	1653A	タングステンワイヤーの研ぎに電圧を提供
ライカZ6 APO顕微鏡	ライカ	10447424	アンテナのセンシラの観察に使用
Simulusコントローラ	Syntech	CS-55	刺激アプリケーションの制御に使用
4チャンネルUSBアクイジションコントローラ	Syntech	IDAC-4	記録前および記録中のすべての信号の画面表示
光源	SCHOTT	A20500	観察用光源を提供
マイクロマニュピュレータ	ライカ	115378	の小さな動きに使用されます電極
ジャ	スター95a	アクイジションコントローラー IDAC-4と接続し、信号に音を供給
マグネットスタンド	成重	GJ-1	基準電極、固定トコジラミ、刺激供給管の保持に使用
TMC 防振テーブル TMC		63-500	機器からの振動を遮断するために使用
カバースリップ	テドペラ	2225-1	トコジラミの保持に使用
両面テープ	3M	XT6110	カバークリップにトコジラミを固定するために使用
デン	タキット	DK-R012	トコジラミが固定されているカバークリップの支持に使用