シングルプラズモニックナノ粒子からの散乱非線形性の測定

サマリー

可飽和散乱と逆可飽和散乱は、単離されたプラズモニック粒子で発見され、超解像顕微鏡における新しい非漂白コントラスト法として採用されました。ここでは、非線形散乱を検出して抽出する実験手順と、飽和励起顕微鏡を使用して分解能を向上させる方法について詳しく説明します。

要約

プラズモニクスは、光励起による電子の集団振動に基づいており、強く増強された局所電場を含んでおり、したがって、並外れた光学強度を必要とする非線形光学への応用が期待できます。プラズモニクスで最も研究されている非線形性の1つは、飽和および逆飽和動作を含む非線形吸収です。ナノ粒子の散乱と吸収はミー理論によって密接に相関していますが、プラズモン散乱の非線形性についてはごく最近まで報告されていませんでした。

昨年、孤立したプラズモン粒子の散乱の飽和だけでなく、逆の飽和も初めて実証されました。その結果、可飽和散乱は明確な波長依存性を示し、これは局在表面プラズモン共鳴(LSPR)に直接関連していると考えられることが示されました。強度依存の測定と組み合わせると、結果は、散乱と吸収の非線形挙動の根底にある共通のメカニズムの可能性を示唆しています。単一の金ナノスフィア(GNS)からの散乱のこれらの非線形性は、超解像顕微鏡や光スイッチなど、広く適用できます。

この論文では、単一のGNPにおける散乱の非線形性を測定する方法と、飽和散乱に基づく光学イメージング解像度を向上させるための超解像技術をどのように採用するかについて詳細に説明されています。この発見は、非線形散乱に基づく最初の超解像顕微鏡を特徴としており、これはl/8という低い分解能を達成できる新しい非漂白造影法であり、生物医学や材料研究に役立つ可能性があります。

概要

プラズモニクスの研究では、様々な分野への応用^1-4による大きな関心を集めています。プラズモニクスの中で最も研究さフィールドのうちの1つは、金属と誘電体との界面での外部の電磁波との伝導電子の集団振動カップル表面プラズモニクス、です。表面プラズモニクスは、サブ波長光学、バイオフォトニクス、および顕微鏡^5,6におけるその潜在的用途のために検討されています。局在表面プラズモン共鳴（LSPR）による金属ナノ粒子の超小体積の強い場の増強が原因粒子サイズ、粒子形状、及び⁷周囲媒体の誘電特性に対する卓越した感度だけでなく、広範な関心を集めています^-10だけでなく、本質的に弱いため、非線形光学効果^{11をブースト}する能力。 LSPRの例外的な感度バイオセンシングおよび近FIEのための価値がありますLDイメージング技術^12,13。一方、プラズモン構造の強化非線形性は、光スイッチング及び全光信号処理^14,15のような用途における光集積回路に利用することができます。これはよくプラズモン吸収が低い強度レベルでの励起強度に線形に比例することが知られています。励起が十分に強い場合、吸収が飽和状態に達します。興味深いことに、より高強度で、吸収が再び増加します。これらの非線形効果は、可飽和吸収^{（SA）15〜17}と呼ばれ、それぞれ、可飽和吸収^{（RSA）18を逆に}しています。

これは、LSPRによる、散乱がプラズモニック構造において特に強いことが知られています。基本的な電磁気学に基づいて、入射強度対散乱の応答は線形でなければなりません。しかし、ナノ粒子に、散乱及び吸収が密接Mie理論を介して連結されており、両方が電子であることができます誘電率の実部と虚部の面でxpressed。単一GNSは、光照射下での双極子として振る舞うという仮定の下では、ミー理論による単一プラズモニックナノ粒子からの散乱係数（Qの _SCA）と吸収係数（Qの _ABS）は ¹⁹のように表すことができます。

xは 2πa/λであり、aが球の半径であり、m ^2は _{、εM /εd}です。ここで_、εmと _εdは 、それぞれ、金属のと周囲の誘電体の誘電率に対応しています。散乱係数の形態は、目と同様であるのでEの吸収係数は、従って、単一のプラズモンナノ粒子²⁰で飽和散乱を観察することが期待されます。

最近では、孤立したプラズモニック粒子中の非線形飽和散乱は初めて²¹実証されました。これは、励起強度が増加したときに深い飽和状態で、実際には散乱強度がわずかに減少していることが顕著です。励起強度は散乱が飽和になった後に増加し続けた場合であってもより顕著に、散乱強度は^20散乱 、逆飽和の効果を示す、再び上昇しました。 、波長およびサイズ依存の研究では^、21散乱 LSPRと非線形の間に強力な関係を示しています。プラズモン散乱の強度および波長依存性は、これらの非線形行動の根底にある共通のメカニズムを示唆し、吸収のものと非常に似ています。

アプリケーションの観点においては、よく自演さその非線形性WN光学顕微鏡の分解能を改善するのに役立ちます。 2007年には、飽和励起（SAX）顕微鏡は、励起光²²の時間的な正弦波変調を経て飽和した信号を抽出することにより、解像度を向上させることができる、提案されました。 SAX顕微鏡は、レーザー焦点のため、強度が周辺部よりも中央で強い概念に基づいています。信号（蛍光または散乱のいずれか）が飽和挙動を示す場合、線形応答は周囲のまま、彩度は、中央から開始する必要があります。唯一の飽和部分を抽出する方法がある場合は、周辺部を排除しつつ、それが効果的に空間分解能を向上させる、中央部のみを残します。原則的に、SAX顕微鏡には低解像度の制限がない限り、深い飽和状態に達しており、強烈な照明のために何のサンプルの損傷はありません。

これはresolutioことが示されています蛍光イメージングのnが著しくSAX技術を利用することによって向上させることができます。しかし、蛍光は光漂白効果に苦しんでいます。非線形散乱の発見およびSAXの概念を組み合わせて、散乱に基づく超解像顕微鏡^21を実現することができます。従来の超解像顕微鏡法に比べて、散乱に基づく技術は、新規な非漂白コントラスト方法を提供します。本論文では、ステップバイステップの説明が取得し、プラズモン散乱の非線形性を抽出するために必要な手順の概要を説明するために与えられています。入射強度を変化させることによって導入された散乱非線形性を同定する方法が記載されています。詳細は、これらの非線形性は、単一のナノ粒子の画像をどのように影響するかを解明するために提供され、どのように空間分解能は、SAXの手法により適宜向上させることができます。

プロトコル

1. GNSサンプル調製

1. LSPRピークがシフトする可能性があり、粒子の凝集を防止するために約40キロヘルツ、少なくとも15分間、試料を調製する前に、超音波処理1mLのGNSコロイド溶液。
2. GNSSを修正するための商用マグネシウムアルミニウムシリケート（MAS）コーティングを施したスライドガラス上にGNSコロイドの100〜200μLをドロップします。
3. 少なくとも1分後、蒸留水で洗浄することにより、余分なコロイドを除去します。待ち時間は、GNSSの必要な分布密度に依存します。典型的に、それらのほとんどが互いに分離されているので、粒子が容易に識別されることを可能にする適切な密度で1-3分をもたらします。待ち時間が長すぎる場合に有意な凝集が生じる可能性があります。
4. 窒素ガスでパージすることによって、サンプルを乾燥させます。
5. （オプション）、高解像度でガラス上にGNSSをマッピングこの^ステージ 23で、走査型電子顕微鏡（SEM）を実行します。例えば画像はFIGURに設けられていますE 1、GNSSの特徴密度を示します。画像を取得する電界放出SEMを使用してください。油試料（次工程）に追加されると、それは、油を除去し、SEMを用いて試料を観察することは困難であろう。
6. GNSSを覆うように、ガラス基板からの強い反射を除去するために試料に同じ屈折率を有する油の滴を加えます。
7. サンプルの上にカバーガラスを置き、マニキュアでそれを封印。
8. マニキュアが乾くまで、少なくとも5分待ってください。サンプルの準備が整いました。

ホーム内蔵共焦点顕微鏡の2アライメント

1. セットアップのスキームについては、図2を参照してください。顕微鏡本体自体の白色光照明パスを合わせます。顕微鏡のハロゲン光源をオンにし、ケーラー照明条件を達成するために、顕微鏡メーカーのマニュアルに従ってください。ホワイトハロゲン光が背面のほぼ平行であることを確認します対物レンズの開口は、部分的に50/50ビームスプリッタによって反射され、次いで、レーザーに向かって伝播します。
2. 彼らは走査範囲の中心にあり、正しい初期位置に残ることを保証するためにガルバノミラーをオンにします。
3. ハロゲン光路に沿って、その上に同心円状のリングを有する紙の薄いシートで作られた少なくとも二つの標的を、置き、ハロゲンビームでそれらの位置を合わせます。
4. 撮影を行うために、532 nmのレーザーを選択します。分光測定を行うために、スーパーコンティニュームレーザを選択します。アライメント時には、レーザーのパワーは、非線形性を回避するために、目的の背面開口部に10未満μWである必要があります。その後、二つのターゲットを用いて、発信ハロゲンビームに入射レーザビームの反対を平行。このプロセスが完了すると、レーザビームの粗いアライメントが達成されました。
5. 対物レンズの背面開口部の中心を通ってレーザービームの位置を合わせます。一般的に、OIを使用L-浸対物レンズ。油浸対物レンズとGNS試料との間の油滴を追加します。 GNSSの散乱信号を収集するために、検出器として光電子増倍管（PMT）を使用します。
6. アウト・オブ・フォーカス散乱信号を遮断するために、PMTの前に20μmの直径のピンホールを配置します。ガルバノミラーやPMT（自作ソフトウェアを介した）をオンにし、GNSSの後方散乱信号を最大化し、コンピュータ画面上の個々のGNSを観察するための試料台のピンホールの位置と高さを調整します。正確な位置合わせとGNSSの標本XY画像は、図2Bに示されています。
7. 少し焦点の同心性を確認するために試料ステージの高さを変更します。それが同心でない場合は、試料ステージの高さを変化させながら、同じ位置のままで、GNSの中心までスキャナ前面に2つのミラーを有するビームを調整します。 PSFのXZ像が図2Cのようになっていることを確認してください正しいビームアラインメントを確保します。ローパスガウス滑らかなフィルタをこれらの2つの画像を処理します。

散乱非直線性の3特性評価

1. 低い励起強度（以下10 ⁴ W / ^cm 2）とで、2.6プロトコルに従って、金ナノ粒子の画像を取得します。
2. ImageJの中の画像（または任意の他の画像解析ソフトウェア）を開きます。画像内のGNSSの一つ越えて線を引きます（ 図2Bを参照）、および分析を使用- > ImageJのツールのプロットプロファイルを散乱強度プロファイルを取得します。ガウス関数によって選択されたPSFの形状を合わせます：
   
   yは PMT読取値であり、Y _0は、バックグラウンド値（もしあれば）であり、幅wは、Aは 、ピーク振幅であり、xは空間座標であり、x _cは中心coordinatありますガウス関数の電子。対応するPSFのFWHMが（½ln2） ワットです。対物レンズの開口数（NA）に基づいて、共焦点PSFの理論FWHM Lは、励起波長は約0.43リットル/ NAであると推定することができます。イメージング・システムの整合性を確認するため2つの数値を比較してください。
3. 手動で図2Aに中性濃度（ND）フィルタを変更することにより、励起強度を増加させ、各強度レベルでの後方散乱画像を記録します。異なる励起強度で各GNSの中心からの散乱信号の値を取り、励起強度に対する信号の散乱曲線をプロットします。励起強度が十分に低い場合に線形の関係を示すべきである最初のいくつかの点の直線性を確認してください。最初のいくつかの点の直線フィッティングに基づいて線を引きます。その後の点の散乱強度は、この線形トレンド、saturatio以下に低下した場合nが発生しました。
4. 飽和散乱を観察した後、徐々に飽和閾値下強度、及び画像は、非線形現象の可逆性を保証するために、再度同じGNSSを減少させます。

シングルゴールドナノスフェアの散乱スペクトルの測定4。

1. 単一GNSから後方散乱スペクトルを測定するために、レーザ光源として超連続レーザーを使用しています。レーザーの初期波長を450nmから1750ナノメートルの範囲です。サンプルおよび光学部品が損傷するおそれがあり、過剰な赤外線パワーを除去するには、可視光を反射するように右のスーパーコンティニュームレーザー後1または2のミラーを配置し、ビームが過剰赤外光を収集するためにダンプを使用します。
2. レーザー走査共焦点顕微鏡にスーパーコンティニュームレーザーを指示するために第2のアライメント手順に従ってください。全可視範囲にわたってスペクトル範囲を確保するために、ブロードバンドを50/50 BSを使用してください。
3. 取得しますガラス上のGNSSの画像。画像内の単一のGNSを見つけて、粒子の入射広帯域光の焦点を固定します。
4. 電荷結合素子が装備されている分光計に向けて後方散乱信号を指示するPMTの前で反転ミラーを使用して、[選択された単一のGNSのスペクトルを取ります。ここでスペクトルが原因で他の表面からの反射に散乱し、背景GNSの混合物であることに注意してください。
5. PMT検出器に切り替え、および粒子位置が変更されていないことを確認するために別の画像を取ります。そして、何の粒子が存在しない点までフォーカスを移動。分光器に切り替え、背景を表す1以上のスペクトルを取ります。
6. 単一GNSの明確な後方散乱スペクトルを得るために、ステップ4.4からスペクトルから、ステップ4.5からのバックグラウンドスペクトルを減算します。

SAX顕微鏡の5アライメント

1. 図3を参照してください理想的な正弦波時間変調が2音響光学変調器（のAOM）間のビート周波数から求められるSAX顕微鏡のスキームのために。まず、後続のAOMの要件を満たすために、レーザーのビーム径を調整します。 50/50ビームスプリッタを用いて2つのビームに532nmのレーザ光を分割します。
2. 一方のビームは、それぞれAOMを通過すると、2のAOMを介して2つのビームを導きます。 2のAOMの変調周波数が異なっている必要があります。例えば、10キロヘルツの差周波数を得、40.010 MHzで40.000 MHzおよびその他であってもよいです。この差周波数は、SAX信号の基本_変調周波数f mです。
3. 両方のAOMからの一次回折ビームを取り、別の50/50ビームスプリッターを使用して、2つのビームを結合します。二つのビームをコリメートするためのAOM後にミラーを調整します。
4. 時間的modulatioを監視するために、オシロスコープに接続された光検出器を追加します。N。スライドガラスとレーザーの小さい部分を分割し、 図3に示すように、光検出器に送る。正しい変調及びビームの重なりにより、メイン_周波数 f mで示される波形と同様の正弦波の強度変調を観測図4インチ
   注：変調の背景が最大変調度を達成するために可能な限り低くする必要があります。また、変調の高調波歪みが減少していることを確認するためにオシロスコープのフーリエ解析関数を使用します。成功したSAXの実装を実現するために、最小化初期非線形性との完璧な正弦波励起強度変調を確保。
5. オシロスコープからの光検出器の電気出力を外し、ロックインアンプの基準入力に接続します。
6. 図3に示すように 、以前のプロトコルに従って、共焦点システムにレーザービームを揃えます。 HERE、信号入力としてロックインアンプにPMTの電気出力を接続してください。
7. 試料としてブランクのカバーガラスを使用し、検出器は、1-Vの読取値より線形であり、図5に示すように,,徐々に励起パワーを増加させることによって、電気検出システムの線形性を確認します。すべての後続の測定では、この値以下に読み出しを抑えるように注意してください。
8. 電圧信号の絶対値をエクスポートするには、ロックインアンプの出力を設定します。参照チャネルで設定する高調波成分を変更することにより、SAX信号の振幅を取得し_、1、2、など。
9. また、ラスタスキャンのガルバノミラーの駆動電圧信号を受信するデータ収集カードにロックインアンプの線形および非線形の信号をエクスポートします。カスタマイズされたLabVIEWプログラムを用いて、ロックインアンプの信号と同期させますガルバノは、画像を形成するためにミラーリングします。
10. 画像における信号対雑音比を最適化するために、適切にロックインアンプのピクセルの取得と積分時間を選択します。例えば、励起の主変調周波数f _mが 10 kHzである場合に時間が100マイクロ秒である場合、すなわち、周期よりも少なくとも3倍長くなるように、ロックインアンプの積分時間を設定します。ガルバノミラーの動きの時間を追加、取得速度は、SAX撮像モードで毎秒1500ピクセルに設定されています。

結果

図6は、80 nmのGNSから測定されたスペクトルを示しています。 Mie理論に基づいて計算された曲線は、優れた一致を示し、同グラフに示されています。 LSPRのピークは580nmで周りです。以下の実験では、レーザー波長は、それがプラズモン効果で光散乱を強化し、飽和^21を有効にするために散乱プラズモンバンド内に位置するように選ばれた532 nmでした。

図7のプレゼントは異なる励起強度で、単一の金ナノ粒子の画像を散乱し、一番下の行は、非線形性を強調するために、各粒子のラインプロファイルを提供します。画像サイズは、600ナノメートル×600 nmであり、画素サイズは13.8 nmです。取得速度は、通常のXY撮像モードで毎秒234,000ピクセルでした。各画像は、信号対雑音比を高めるために、5以上の買収を平均しました。

励起強度がより低い場合1.5×10 ⁶ W / ^cm 2であり、散乱は励起強...

ディスカッション

プロトコルでは、いくつかの重要なステップがあります。サンプルを調製する際にまず、ナノ粒子の密度は、粒子間のプラズモンカップリングを避けるために、高すぎてはなりません。二つ以上の粒子が互いに非常に接近している場合は、LSPR波長の結合の結果、大幅非線形性を減少させる、より長い波長に向かってシフトします。しかし、このイメージング技術は、実際には代わりに粒子自体の、プラズモンモードの分布をマッピングします。したがって、適切な励起波長と、接続されたプラズモンモードはまた、強力な散乱非線形性を示すことができ、強化された解像度で画像化することができることが期待されます。第二に、それは、したがって、2つの間のAOM鼓動を使用する動機、励起ビームの中に純粋な正弦波変調を生成することが非常に重要です。非線形の場合に高解像度化は、散乱信号の変調の非線形部（高調波周波数成分）を抽出に依存しているので歪みは、励起変調中に存在する場合、抽出はより困難になります。加えて、現在の方式では、干渉計の設定は、叩解変調を生成するために使用されるので、干渉計内の2つのビームの位置合わせも可能として変調深さのような大きな達成するために重要です。第三に、信号の非線形性は（I /...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
顕微鏡本体	オリンパス、日本	BX-51
対物レンズ	リンパス、日本	UPlanSapo、100X、NA 1.4
80 nm金コロイド	BBIソリューション、英国	EM。GC80
supercontinuum laser	Fianium, United Kingdom	SC400-2-PP
broadband dielectric mirrors	Thorlabs, USA	BB1-E02
field emission SEM	JEOL, 日本	JSM-6330F	オプション
分光器	Andor Technology, 英国	Shamrock 163
電荷結合素子	Andor Technology, UK	iDusDV420A-OE
音響光学変調器	IntraAction Corp., USA	AOM-402AF1
lock-in amplifier	Stanford Research Systems, USA	SR-830
MASコーティングスライドガラス	松波ガラス, 日本,	S9215