光遺伝学機能MRI

Summary

このプロトコルは、光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を成功させるために必要なステップとデータ分析を説明しています。ofMRIは、高磁場fMRIの読み出しと光遺伝学的刺激を組み合わせた新しい技術であり、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きた脳全体にわたって細胞タイプ特異的にマッピングすることを可能にします。

Abstract

全脳にわたる精密な神経回路の機能的結合性の調査は、高磁場fMRIの比較的高い空間分解能と光遺伝学的刺激の精度を組み合わせた新しい技術である光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を通じて達成することができます。in vivoで脳の深部に特定の波長の光を送達することを可能にする光ファイバーは、オプシンと呼ばれる光感受性膜貫通コンダクタンスチャネルを発現するように遺伝的に誘導された標的細胞タイプを特異的に刺激するために、関心領域に埋め込まれます。fMRIは、神経細胞の活動を間接的に測定するBOLD(Blood-Oxygen-Level-Dependent)信号の測定を通じて、特定の神経回路の光遺伝学的刺激に対する脳の全体的な動的応答を決定する非侵襲的な方法を提供するために使用されます。このプロトコルは、光ファイバーインプラントの構築、移植手術、光刺激によるイメージング、およびMRIを正常に実行するために必要なデータ分析について説明しています。要約すると、ofMRIの正確な刺激と全脳モニタリング能力は、ofMRIを健康な状態と病気の状態の両方で脳のコネクトミクスを研究するための強力なツールにする重要な要素です。

Introduction

光遺伝学機能的磁気共鳴イメージング（ofMRI）は、細胞型特異的な機能の神経回路のマッピング全体を横切ってそのダイナミクスを可能にする光遺伝学刺激^1-11,38の精度で高磁場のfMRIの空間分解能を組み合わせた新規な技術であります脳。光遺伝学は、オプシンと呼ばれる感光性膜貫通コンダクタンスチャネルの導入によって、刺激のために標的とされる特定の細胞タイプを可能にします。神経回路の具体的な要素は、遺伝学的に無傷の脳^1-15活動のミリ秒タイムスケール変調を可能にする、これらのチャネルを発現するように改変されます。 fMRIのは、神経活動の間接的な測定を提供する血液酸素レベル依存（BOLD）信号^16-18、を測定することにより、特定の神経回路の光遺伝学的刺激に対する脳のグローバルな動的応答を決定するための非侵襲的方法を提供します。

それは比較的高い空間分解能で脳全体のビューを提供することができるので、これら二つの技術の組み合わせは、光遺伝学機能的磁気共鳴イメージング（ofMRI）と呼ばれる、そのような電気生理学などの刺激の間に脳活動を記録する他の方法よりも有利です。これは、侵襲的記録電極^1-11の注入を必要とせずに刺激のサイトからの偉大な距離で標的刺激に応答した神経活動を検出することができます。 ofMRIは、電極近傍の異なる種類の細胞を動員し、したがって、各集団¹⁹の因果影響を混乱することができfMRIの中に電気刺激を行うのより伝統的な方法で、より有利で ​​す。また、電極は、電気刺激のために使用され、生成された電流は、MRイメージング²⁰中にアーチファクトを生成することができます。実際、ofMRIは、特定のmodulatiからグローバル脳活動への影響の観察が可能そのようなトランスジェニック動物でのCre-Lox系またはプロモーターの使用などの高度な遺伝子標的化技術の使用を介して様々な細胞型の上に。全脳モニタリングとコンビナトリアル光制御は、特定の細胞型を励起するために阻害しにChR2する両方NpHRの使用を通じてofMRIで可能です。 ofMRIで使用可能な光遺伝学ツールキットも急速に増加し、光感度または改善されたキネティクスと、安定化ステップ関数のオプシン（SSFOs）の、または移植繊維の必要性を否定することが赤色にシフトオプシンのオプシンの導入に時間をかけて改善していますイメージング²¹中に非侵襲的刺激を可能にする光学系。これらの可能性は、電気刺激では使用できません。

しかし、脳内の光伝達のために、組織の加熱から生じる信号アーチファクトは、緩和時間の温度による変形がpseuを生成することが示された^22の報告されていますアクティベーションを行います。 ofMRIを行う研究者は、したがって、この潜在的な交絡に注意する必要があります。適切なセットアップとコントロールを使用して、問題に​​対処することができます。また、fMRIの中の血行力学的応答を測定する比較的低い時間分解能は、本技術の特定の用途を制限する要因であり得ます。

このプロトコルは、第1ディープin vivoでの脳への光の特定の波長の配信を可能にする光ファイバインプラントの構築を記載します。プロトコルは、その後、定位手術を使用して、正確な脳領域へのオプシンをコードするウイルスベクターの送達を記載します。次のプロトコルは、同時光刺激中の全脳機能的MRIのプロセスについて説明します。最後に、プロトコルは、取得したデータの基本的なデータ分析の概要を説明します。

注目すべきは、ここで説明した光遺伝学は、光配信のための慢性移植を必要とします。しかし、光ファイバインプラントは安定したバイオあります互換、縦スキャンおよび月^23,24の期間にわたって神経回路の研究を可能にします。

要約すると、正確な刺激とofMRIの全脳モニタリング能力は、脳のconnectomicsの研究のための強力なツールをofMRI作る上で重要な要因です。異なる動物モデルと結合した場合に加えて、神経疾患²⁵の機構に新たな洞察を提供することができます。実際、ofMRIは発作⁸に関連した別個の海馬の小領域のネットワーク活動を解明するために使用されています。そのため、システムレベルの神経科学の質問に答えることに興味研究所が重要なこの手法があります。

Protocol

倫理声明：ここでの実験手順は、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

1.準備パッチケーブルとフェルールインプラント

注：パッチケーブルとフェルールインプラントは生産、市販されているが、これらの中で、社内の専門の設計を可能にし、より少ない費用がかかります。

1. まず、所望の長さの光ファイバを切断し、脳内インプラントにレーザからの光を送達するための光ファイバパッチケーブルを作製しました。
   1. 繊維包丁を使用して、終端点で平坦な端を生成するために光ファイバを終了します。繊維ジャケットで被覆されている場合は、事前にファイバーストリッパでジャケットを取り除きます。
   2. ケーブルはの穴の内側に動物に光源から延長するのに十分な長さであることを確認して、ケーブルのための所望の長さを生成するために、光ファイバのもう一方の端を切断スキャナ。
2. エポキシ接着剤を混合した後に使用する5分間すぎる粘性になるよう、まもなく次のステップの前に、アルミニウム箔片の上に1：1の比率でエポキシ接着剤の少量を混ぜます。
3. 小さな木の棒を使用して、静かにセラミックフェルールの凹面側の内部に配置した後、フェルールの平らな側の表面上に小滴を適用される繊維の一部にエポキシ接着剤を適用します。フェルールに挿入した後、繊維の小さな長さ（<0.5 mm）は、セラミックフェルールの平らな面から突出することを確認してください。エポキシ接着剤は、最適な結果を得るために、O / Nを強化することができます。
4. レーザ光源に接続する光ファイバパッチケーブルの側に、穏やかにFC / PCコネクタのフェルールの凹面側の内部に配置されるファイバーの部分にエポキシ接着剤を適用し、小さなを適用フェルールの平らな側の表面上にドロップします。フェルールに挿入した後、確実に繊維の小さな長さ（<0.5 mm）はフェルールの平らな面から突出しています。エポキシ接着剤は、最適な結果を得るために、O / Nを強化することができます。
5. 3以上1μm以下ミクロングリット0.3から酸化アルミニウムラッピングシート（上図-8回転しながらフェルールにやさしい下方圧力を適用するためにピンセットを使用して研磨ディスクを使用して、ケーブルの両側のためのフェルールの平らな端を磨きます）。
6. 100Xの倍率で顕微鏡で、フェルールの平坦な端を調べます。光ファイバ表面自体を含む平坦な端の表面は、任意のエポキシ接着剤を含まないことを確認してください。エポキシ接着剤が表面に残っている場合に研磨続けます。光ファイバ表面が折れたり欠けていないことを確認してください。
   注意：担当者が適切なレーザー安全トレーニングクラスを取ることを確認し、レーザー装置を取り扱う前に、レーザー安全ゴーグルを着用してください。
7. FC / PCコネクタを介してレーザ光源に光ファイバパッチケーブルを接続し、Fを揃えますカプラの焦点にiber先端。十分な光出力を確保するために、パワーメータと光ファイバの光送信電力を測定します。
   注：次の手順は、脳への慢性移植のための光ファイバを有するセラミックフェルールを準備するためのものです。セラミックフェルールは、中央に中空であり、脳内の関心領域（ROI）にパッチケーブルからの光を送達するために光ファイバを運びます。
8. 繊維包丁を使用して、終端点で平坦な端を生成するために光ファイバを終了します。繊維ジャケットで被覆されている場合は、事前にファイバーストリッパでジャケットを取り除きます。
9. 脳内に移植するための所望の長さを生成するために、光ファイバのもう一方の端を切断します。脳内のROIを標的とするために、定位アトラスを用いた繊維の長さを決定します。
   1. 例えば：ブレグマ以下3.5ミリメートルであるラットにおける背側海馬を対象とする、繊維の長さはferrulから突出していることを確認eは頭蓋骨の厚さを占め、エラーのマージンを考慮して、+ 0.25ミリメートル3.5ミリメートルです。したがって、繊維の最終的な長さが3.5ミリメートル+ 0.25ミリメートル+ 10.5ミリメートル（フェルールの長さ）= 14.25ミリメートルであることを確認してください。
10. まもなく次のステップ（エポキシ接着剤を混合した後に使用する5分間すぎる粘性になる）前に、アルミホイルの一片上に1：1の比率でエポキシ接着剤の少量を混ぜます。
11. 小さな木の棒を使用して、静かにセラミックフェルールの凹面側の内部に配置した後、フェルールの平らな側の表面上に小滴を適用される繊維の一部にエポキシ接着剤を適用します。フェルールに挿入した後、繊維の小さな長さ（<0.5 mm）は、セラミックフェルールの平らな面から突出することを確認してください。エポキシ接着剤は、最適な結果を得るために、O / Nを強化することができます。
12. 8の字回転しながら、フェルールに穏やかな下方圧力を適用するためにピンセットを使用して研磨ディスクを使用して、フェルールの平らな端を磨きます酸化アルミニウムラッピングシート上のS（〜3μmで1〜0.3μmとグリットへ）。
13. 100Xの倍率で顕微鏡で、フェルールの平坦な端を調べます。光ファイバ表面自体を含む平坦な端の表面は、任意のエポキシ接着剤を含まないことを確認してください。エポキシ接着剤が表面に残っている場合に研磨続けます。光ファイバ表面が折れたり欠けていないことを確認してください。
14. カップルフェルールスリーブ付き光ファイバパッチケーブルに研磨フェルールおよびレーザ光源にパッチケーブルを接続します。適切な効率を保証するために、パワーメータを有するファイバの先端の光送信電力を測定します。
15. 出力に光ファイバ（このプロトコルで2.5ミリワット）の先端に所望の電力レベルを各フェルールインプラント用のパッチケーブルのフェルールから必要な電力出力のログを保管してください。 50％以上の減衰率とし、非円形の出力パターンとフェルールを捨てます。

2.定位インプlantation手術やウイルス注入

1. 動物の使用を含む任意の実験手順は、ローカルIACUCによって承認されていることを確認。滅菌手袋、滅菌マスク、滅菌外科用ドレープ、滅菌手術器具の使用を含む、無菌手順を実行することで、生存手術中の無菌状態を維持します。
   注意：外科医は、手順を開始する前に、安全ゴーグルを含む適切な個人用保護具（P​​PE）を着用していることを確認してください。飛散しないように注意しながら、アデノ随伴ベクター（AAV）で作業する場合、標準的なバイオ安全手順に従ってください。バイオハザード容器にAAVの廃棄物を処分。
2. 使用前に氷の上に注射器を保ち、潜在的なボリュームの損失（動物当たり4マイクロリットルの合計）を説明するために動物プラス余分に注入するために十分なAAVとマイクロリットル注射器をロードします。このプロトコルでは、4×10 ¹² VG / mlの力価でAAV5-CaMKIIa-hChR2（H134R）-EYFPが使用されます。イソフルランの下で動物を置きます酸素ガス源と4％ - 3に設定精密イソフルラン気化器に接続された誘導室付きの電子麻酔、。
3. 電気かみそりで頭を剃るとベタジンおよび70％エタノールリンスを使用して皮膚にトリプル手術用スクラブを行います。
4. 動物は深い麻酔（つま先の反射や呼吸数を確認してください）​​になると、イントラ聴覚位置決めスタッドと歯のバーと定位固定装置に動物の頭蓋骨を固定。
   注： - 麻酔導入からの回復に、2時間全体の手順は、1になります。
5. 適切なレベルに麻酔を設定します（1 - 気化器に3％イソフルラン）と継続的に動物のバイタルサインを監視し、〜40呼吸/分の呼吸速度を維持するために必要に応じて麻酔を調整します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、動物の眼に眼軟膏を管理します。
6. Aメスで20ミリメートル正中頭皮切開手術用止血剤を使用して頭皮を撤回 - 15を作ります骨膜にttached。 ROIの座標上でドリルビットを位置を基準ラムダとブレグマ。
7. 脳を穿刺しないように注意しながら、歯科用ドリルでROIを超える - （3ミリメートル2）小開頭術を開けます。ゆっくりと脳内のROIに開頭を介してマイクロシリンジに取り付けられた針を挿入します。
8. マイクロシリンジポンプコントローラでは、ROIへのベクター溶液2μLを注入します。組織損傷を避​​けるために、150ナノリットル/分の流量を使用。注入が完了した後、0.5ミリメートル/分の速度で、ゆっくりと注射器を取り外す前に10分を待ちます。
9. 注入後、頭蓋骨の表面を乾燥させます。参考ラムダとブレグマは、座標を確認した後、目標深さにフェルールインプラントを挿入するには：約0.5mm /分の速度で（例えば背側海馬のためのブレグマ以下3.5ミリメートル）。歯科用セメントを用いて頭蓋骨にフェルールインプラントをマウントします。歯科用セメントが固化した後、縫合糸で切開部をシール（SI歯科用セメントキャップの周りのラットのためZE 5-0）。
10. 手術後、単独で麻酔回復のため、ヒーターの上にケージの半分に収容され、そのケージに動物を配置します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで他の動物の会社に動物を置かないでください。
11. 痛みの手術後の管理、24時間0.05 10mg / kgの用量での管理ブプレノルフィン皮下ごとに12時間のために。 3日間の切開部位を介して、毎日抗生物質粉末を管理します。
12. 痂皮形成を防止するために、約2週間、手術後の縫合糸を外します。
13. 実験を行う前に、光遺伝学の遺伝子の十分な発現のためのウイルス注射後6週間 - 4待ってください。

3.光遺伝学機能MRI

注意：MRIスキャナの永久磁場の周りには注意してください。セキュアな設備を導入関数発生器、光源、人工呼吸器、カプノグラフとガスのタンクを含む耳鼻咽喉科、十分に離れ（少なくとも5ガウス制限を超えました）。

1. 酸素ガス源で5％に設定精密イソフルラン気化器に接続された誘導室でガス麻酔下で動物を置きます。
2. 動物は深い麻酔（チェックつま先の反射および呼吸数）になると、Rivard らに詳述プロトコルに従って動物を挿管。（2006）カプノグラフィー²⁶によって二酸化炭素の監視を可能にします。注：挿管は、撮影時の呼気CO ₂の適切なレベルを維持する上で重要です。
3. スキャナクレードルに動物を固定します。
   注：このプロトコルでは、クレードルは、カスタム製造したが、このようなクレードルも市販されています。ラットクレードル機能は、麻酔、加熱された空気の送達のためと動きの制限のためにスキャナ内の動物を確保します。
4. イソフルランのミックスを配信（ranginクレードルを介してチューブを経由して約60％の亜酸化窒素と40％酸素中1.5％） - 1.2からグラム。動物の頭がしっかりモーションアーチファクトを回避するために固定されていることを確認してください。
5. クレードルに管を通して加熱された空気を提供し、体温を監視するために潤滑剤を直腸温度計を挿入します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、動物の眼に眼軟膏を管理します。
6. レーザ光源に光ファイバパッチケーブルを接続し、電源メーター付きパッチケーブルのフェルールの先端の出力を測定します。
7. 脳の内部に注入された光ファイバの先端に所望の出力（このプロトコルで2.5ミリワット）を生成する（ステップ1.15で、以前に決定された）適切な電力レベルに調整します。光ファイバからの過度の電力出力は、潜在的に、脳の内部組織の損傷を引き起こすまたは信号アーチファクトを生じる組織加熱を引き起こすことができるので、大幅にレーザのパワー出力を増加させません意図した出力を超えました。
8. 黒電気テープのコーンを有するインプラントからの光漏れを防止し、動物の目をカバーしています。カップルフェルールスリーブを動物にフェルールインプラントへの光ファイバケーブル。
9. 動物の頭の上にコイルを配置します。スキャナのボア内に動物とクレードルを挿入します。
   注意：このプロトコルでは、シングルループ送受信コイルは、カスタム製造された脳組織から最適な無線周波数を受信するように事前に調整されました。
10. 、このプロセスを通じて呼吸数および体温をモニター限度内で生理的な値を維持するために、必要に応じて人工呼吸器やヒーターを調整する（つまり呼気CO _2が 3であることを確認-ストロークの周波数と音量を調整するために人工呼吸器のノブを回転させることにより、その4％温度）が温度設定のための矢印をクリックすることにより、37℃です。
11. 画像に動物の頭の位置を測位シーケンスを選択します。 Bの場合雨が動物の頭の位置を調整し、脳がアイソセンタになるまで、位置決めスキャンを繰り返し、アイソセンタではありません。線形シミングシーケンスを選択して、シーケンスの選択ウィンドウに負荷をクリックします。次に、磁場の不均一性を低減するために、開始をクリックします。
    注：シミングは直接fMRIのデータの整合性に影響を与える重要なステップです。
12. T2強調シーケンスを選択して、シーケンスの選択ウィンドウに負荷をクリックします。次に、脳の全体的な整合性をチェックするために、光ファイバのインプラントの位置を確認するために、前のfMRIにT2強調高解​​像度の冠状解剖学的画像を取得する開始]をクリックします。
    注：これらの画像はofMRIスキャンシリーズの解剖学オーバーレイとして使用することができます。
13. レーザ光源は、実験的な刺激パラダイムに応じて駆動されるように、関数発生器にMRIスキャナのトリガー・ポートからBNCケーブルを接続します。
    注：このプロトコルでは、刺激pをaradigmは6分間/ 40秒オフで20秒、続いてベースラインの30秒です。
14. グラディエントエコー（GRE）シーケンスを思い出しマルチスライスを選択して、シーケンスの選択ウィンドウに負荷をクリックします。次に、35ミリメートル×0.5ミリメートル×0.5ミリメートルの空間分解能0.5ミリメートルで、面内のx 35ミリメートル（2D FOV）冠状スライスを取得するために開始をクリックします。
    注：ここで使用されるGREシーケンスは繰り返し時間（TR）を有し、エコー時間、TR / TE = 12分の750ミリ秒の（TE）と30°のフリップ角。
15. スキャンの終了時に、スキャナから動物を削除し、それが麻酔から目覚めたと胸骨横臥位を維持できるようになるまで監視します。

4. ofMRIデータ解析

注：次の手順は、MATLABで実行されている高スループットで公開ofMRI ²⁷に記載されているように。

1. 生スキャンデータを用いて、すべてのTR画像を更新するために、スライディングウィンドウの再構成を使用して、分析のために使用されるコンピュータに転送された後4インターリーブスパイラル読み出しは、750ミリ秒TRと12ミリ秒のエコー時間は、スキャンシリーズごとに23のスライスを取得します。代わりに、すべてのインターリーブは、スライス毎に取得された後にのみ、新しいのfMRI画像が再構成され、従来の再構成、スライディングウィンドウ再構成法は^、27合、それぞれの買収後の画像を再構成します。
2. 以前²⁷に記載のように、二次元グリッド化再構成、動き補正、及び時系列の計算のための生データを処理します。
3. 以前²⁷記載されているように、刺激前に収集したベースライン期間に各ボクセルの相対BOLD信号の変調率を算出することにより活性化したボクセルを決定するために、しきい値コヒーレンスメソッドを使用します。フーリエ変換の大きさは全ての周波数成分⁸の和の二乗で割った反復刺激サイクルの周波数に変換するようにコヒーレンス値を計算します。
4. 各Vために時系列データを用いてoxel、まず同じ刺激パラダイムの連続した​​スキャンに属する平均動き補正された画像。以前に²⁷記載のように内と動物との比較のための6自由度の剛体変換に加えて、等方性のスケーリングと共通の座標フレ ​​ームに平均4D画像を整列させます。

Results

図1と図2は、20 Hzの（15ミリ秒のパルス幅、473nmで、30％のデューティサイクル）運動皮質の光遺伝学的刺激から生じる代表的なデータを示しています。 6分を使用したために、ベースラインの30秒の刺激パラダイムは/ 40秒に20秒でオフに続きます。以前の研究は、このパラダイムは、光遺伝学刺激^1,8から堅牢なBOLD信号を生成することが示されている。長距離シナプス結合の結果として、刺激（運動野）のローカルサイトのと視床の両方で検出されたボクセルを、活性化した図1図これらの領域の間。 図2は、光遺伝学刺激後の運動野の応答に比べて（下の初期勾配）視床応答が遅延しているように、時間的情報は、HRFsから収集できることを示しています。

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運動野におけるCaMKIIa発現細胞の光遺伝学刺激により誘発されるBOLD信号の 図1. アクティベーションマップ。アクティブボクセルのコヒーレンス値、大幅に繰り返し刺激に同期したものとして識別は、T2強調冠状解剖学的スライスの上に重ね表示されます。 6分、30秒の期間にわたって収集されたデータ（473 nmの光で秒/ 40に最初の30秒のベースラインと20秒の6刺激サイクルオフは、20ヘルツ、15ミリ秒のパルス幅）は1つの起動マップに凝縮されています。シーケンシャルスライスは0.5ミリメートル離れていると、光ファイバ・インプラントの位置は三角形で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

撮影時の被写体の動きは、データの破損につながる可能アーティファクトの重要な供給源です。適切イメージングクレードルに動物を確保することは、適切な麻酔レベルを維持しますのようなアーティファクトを最小限に抑えることができます。ここでは、イソフルランを使用するが、このようなメデトミジンまたはケタミンとキシラジンなどの代替麻酔薬も、考慮すべきです。しかし、麻酔のレベルと選択は、BOLD応答²⁸を含む、脳内の多くのパラメータに影響を与えることができます。イソフルランは、神経細胞の興奮²⁹の変化を引き起こす可能性があります。他の麻酔薬はまた、GABAシナプス抑制^30に影響^を与えることができます。神経活動に影響を与えるその能力与えofMRIを行う際にこのように、麻酔の選択が重要です。麻酔の不在下でofMRIは可能ですが、動物が慣れている場合低減させることができる動物、から増加した動きに挑戦することができます。このような目を覚ましofMRIの研究は、以前に行われてきましたND脳^9,10に麻酔の交絡効果を避けるだろう。後処理モーション補正アルゴリズムは、非常に動きの影響を緩和するために使用することができます。これらの方法のいくつかは、二乗和が補正下で基準画像と画像の機能をコスト最小化、このプロトコルに用いられる逆ガウス・ニュートン法、などが存在します。それは処理時間^27を減らすためにGPUの並列プラットフォームの設計を使用して、高速かつ堅牢な動き補正を可能にしますので、アルゴリズムが便利です。

このプロトコルでデータの再構築については、MATLAB環境でカスタム書かれたソフトウェアは、螺旋状のサンプルがグリッド化画像^31-33にk空間で再構成された2次元のグリッディングの再構築のために使用されました。時系列データは、刺激の前に収集し、ベースライン期間の各ボクセルに対するBOLD信号の変調率を算出することによって生成しました。その時系列のsynたボクセル活性化されたボクセルと定義した0.35以上のコヒーレンス値を持つ光遺伝学の刺激のブロックにchronized。このコヒーレンスの値が10未満^-9 P値⁸に相当します。フーリエ変換の大きさは全ての周波数成分^8,27の和の二乗で割った反復刺激サイクルの周波数に変換するようにコヒーレンス値を計算しました。 Familywise誤差は多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて制御することができます。分析の別の方法は、一般的な線形モデル（GLMS）などのパラメトリック統計検定を含め、使用することができます。コヒーレンス法は、従来の一般的な線形モデルに比べてHRFの少ない事前知識を必要とします。 ofMRIを使用してデータを探索する場合したがって、有利です。間隔刺激間固定し、他のイベントRELAでofMRIデータに使用することができないとしかしながら、コヒーレンス法は、ブロック設計または選択されたイベントに関連するデザインのデータのために使用することができますテッド・デザインまたは混合デザイン。その後、動的な因果モデル（DCM）はofMRIによって同定脳領域間の相互作用を分析するために使用することができます。 DCMは、fMRIの³⁴時の実験入力に対するシステム応答からの機能の接続性の分析のために開発ベイズ統計的手法です。

ofMRIのための追加の技術的な問題は、ここで議論されています。インプラントは、研究から影響を受けた動物の除去につながる、破損したり脱落することができます。再移植手術が原因で、元の移植手術と動物福祉の問題に起因すると同じROIを標的とする追加の不確実性には推奨されません。なぜなら、各動物の対象に投資し、時間と資源のかなりの量の、材料の強度を考慮はofMRI研究での使用に適した歯科用セメントを選択する重要な関心事です。移植手術はimplanの寿命を最大化する上で重要な要因でありますトンと動物対象。例えば、頭蓋骨は、歯科用セメントを適用し、セラミックフェルールインプラント周囲にセメントの十分な量を配置する前に乾燥していることを保証することが研究中の動物の潜在的な数ヶ月にわたるタイムライン上で安定性を確保することができます。さらに、代替ケージの設計が検討し、多くの場合、ケージに突出しており、インプラントに損傷を与える動物のための機会を提供する食料と水を保持するワイヤートップスとケージを回避するために、地元の動物保護施設で議論することができます。重要なことは、歯科用セメントは、イメージングおよび代替セメントは動物実験に使用する前にスキャナでファントムとイメージングに適用することによって試験することができる影響を及ぼすアーチファクトを低減するために慎重に選択する必要があります。様々な歯科用セメントとの試行錯誤は、このプロトコルで使用するセメントは、比較的少数の人工物を与えることが示されています。 ofMRIを行う際に他の技術的課題は、EXTR与えられ、意図したROIにおける光ファイバの配置の精度であります脳³⁵中の核の間に存在することができるemely小さな距離。移植手術を完了した後、T2強調解剖学的スキャンは脳地図上に重ね合わせて、正しい配置を決定するために使用することができます。これらの手術を行う外科医と実践のスキルが正しい配置率を向上させることができます。意図されたROIにおけるオプシンの特異性および発現は、免疫組織化学または可視化のためオプシンにタグ付けされたレポータータンパク質の内因性の蛍光を用いて、動物を灌流し、脳を固定することにより、研究の終了時に確認することができます。これらのレポータータンパク質はまた、オプシンが所望の神経細胞型^1,8,15,25において発現されることを確実にするために、他のタンパク質と共局在することができます。前述のように光による配信²²から組織加熱にofMRIを行う際に、アーチファクトが発生することがあります。組織加熱は、偽BOLD信号をもたらす、緩和時間の変更を引き起こします。その交流を確実にするために、ofMRI中に光刺激から生じるtivati​​onはこのアーティファクトによるものではない、オプシンネガティブコントロールは、（AAV-CaMKIIa-EYFPなど）の制御蛍光体ベクターを注射し、生理食塩水を注射した動物や動物そのいずれかで実行する必要がありますofMRIを受けます。また、良好な光透過効率でのみうまく構築光ファイバインプラントは、高いレーザパワーを使用する必要性を除去するために使用されるべきです。 ofMRIの研究が原因で組織加熱に偽の活性化が問題^1,6-8,10,11されていないここで行われてきました。

発現のためのニューロンに必要な光遺伝学の遺伝子を導入するためのベクターの選択については、のAAVは、ヒトの疾患を引き起こすことが知られているので、便利なオプションである、これらの薬剤（BSL-1）を使用するために必要な低いバイオセーフティレベルを与えられていません。また、ベクトル・コアの多くは、在庫の様々な光遺伝学の遺伝子とし、複数の血清型と一緒にパッケージのAAVを運びます。 AAVの血清型はBを選択されな​​ければなりません最適な発現レベル^36,37を確実にするために意図された細胞集団を対象にASED。レンチウイルスは、また使用されるが、より高いバイオセーフティーレベルを必要とすることができます。光遺伝学の遺伝子の十分な発現のために必要な時間は、使用される特定のAAVにし、具体的な実験パラダイムに、使用される特定の動物モデルに応じて可変です。このプロトコルでは、11週齢でのSprague Dawleyラットを使用し、光遺伝学研究は、4〜6週間ウイルス注射後始まります。トランスジェニックマウスはまた、光遺伝学の研究において使用され得ます。オプシンの十分な発現のために必要な時間の特定の量を決定するために予備実験を行う必要があります。刺激パラダイムは、使用される特定のオプシンに応じて変えることができます。このプロトコルでは、AAV5-CaMKIIa-hChR2（H134R）-EYFPが使用され、刺激パラダイムは/ 40秒オフで20秒です。 SSFOを使用している場合SSFOが交流する光の唯一の短いパルスを必要とするため、刺激パラダイムが変化しますtivatedし、別の波長の光の短いパルスが終了します。

実行時に追加の重大な懸念はofMRIは、動物を麻酔した場合でも、視覚刺激から生じる交絡脳の信号を防止するために、光遺伝学刺激中の光ファイバパッチケーブル付きフェルールインプラント・インターフェースからの光漏れを防止されます。黒色絶縁テープの円錐は、フェルールの光を遮断すると、動物の目をカバーするために使用することができます。重要なことは、被検者の呼気CO ₂や体温などの生理的値は、適切にイメージングの期間を通じて維持されなければなりません。 37℃で4％であり、体温-呼気CO _2を 3との間に維持されるべきです。また、シム配列の前ofMRIが大きくスキャン得BOLDデータの品質を決定開始する磁場にできるだけ不均一性を低減します。これらの要因の制御信頼性の高いofMRIデータを生成する上で重要です。このプロトコルでは、DPSSレーザは、光遺伝学刺激のための光源として使用されます。レーザ光がコヒーレントであるため、十分な電力よりも、容易に光ファイバを介して供給することができます。光ファイバに接続されたLED光源は、商業ベンダーから利用可能であるが、光の透過の減少電力の欠点を有しています。レーザ光源は、それぞれの特定の光ファイバパッチケーブルの配置を必要とするが、実際と、アラインメントは数秒〜数分以内に達成することができます。

ofMRIの将来のアプリケーションは、撮影時の非侵襲的刺激を有効にするには、赤方偏移オプシンなどの次世代のオプシンの使用を含みます。さらに、MRI対応EEGまたは光ファイバ・インプラントと一緒に同様の記録電極の注入は、MRIの高空間分解能のデータに加えて、高時間分解能データの取得を可能にすることができます。 ofMRIとelectrophysiological記録は、脳の機能的接続性に関する広範な情報を提供することができます。要約すると、遺伝的または解剖学的アイデンティティによって定義された特定の細胞集団の刺激に応答して脳全体を監視するofMRIのパワーは、神経疾患のと健康な脳のconnectomicsの研究に使用するための重要なツールをofMRIなります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7テスラスキャナー	アジレントテクノロジー	ズディスカバリーMR901システム
スプレイグドーリーラットチャー	ルズリバーCrl	:SD	11週齢
ファイバークリーバー	フジクラ	CT-05
マルチモード光ファイバー	トールラボAFS105	/ 125Y
ファイバーストリッパー	トールラボ	T08S13
セラミックスプリットスリーブ	精密繊維製品	SM-CS1140S
エポキシ接着剤	トールラボ	G14250
綿先端アプリケーター	ストール株式会社	50975
マルチモード陶磁器ジルコニアのフェルール	の精密繊維プロダクト	MM-FER2002
FC/PCのマルチモードのコネクター	トールの実験室	30128C3
繊維光学の磨くディスク	精密繊維プロダクト	M1-80754
酸化アルミニウムのラッピング シート、0.3 µm	Thor Labs	LFG03P
酸化アルミニウムラッピングシート、1 & マイクロ;m	Thor Labs	LFG1P
酸化アルミニウムラッピングシート、3 & マイクロ;m	Thor Labs	LFG3P
双眼生物顕微鏡 40X-1,000X	Amscope	B100
レーザー安全メガネ	Kentek	KXL-62W01
473 nm DPSS レーザー	Laserglow	LRS-0473
594 nm DPSS レーザー	Laserglow	LRS-0594
六角レンチセット			2.0 mm (5/64") レーザー
パワーメーター、Siセンサー、400-1,100 nm	Thor Labs	PM121D
イソフルラン (アイソセシア)	Henry Schein	50033
イソフルラン気化器(誘導室付き	VetEquip	901806
NanoFil 100 & micro;l シリンジ	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments	UMP3-1
Function Generator	A.M.P.I.	マスター8
小動物ステレオタックス	デビッド・コップフ・インスツルメンツ	モデル940
モデル683小動物用ベンチレーター	ハーバード・イスラーム	550000
タイプ340カプノグラフ	ハーバード733809
装置歯科用ドリル(ロータリーマイクロモーターキット)	Foredom Electric Co.	K.1070
眼科用軟膏(人工涙液)	ラグビー00536-6550-91
器具滅菌器	CellPointサイエンティフィック	ジェルミネーター500	ガラスビーズ滅菌器
抗生物質粉末	ファイ	ザーNEO-PREDEF	ネオマイシン硫酸塩、酢酸イソフルプレドンおよび塩酸テトラカイン
ブプレノルフィン鎮痛剤ホ	スピーラ	NDC:0409-2012	スケジュールIII規制物質 0.3mg/ml原液