ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

サマリー

口蓋扁桃腺は、Bリンパ球とTリンパ球の豊富な供給源です。ここでは、ヒト口蓋扁桃腺からBリンパ球とTリンパ球を単離するための、簡単、効率的、かつ迅速なプロトコールを提供します。記載されている方法は、扁桃炎として知られる扁桃腺炎症のウイルス病因の研究に特に適応されています。

要約

扁桃腺は、吸入された病原体に対する防御の最前線を提供する免疫系の一部を形成します。通常、「扁桃腺」という用語は、咽頭の口腔部分の側壁に位置する口蓋扁桃を指します。外科的に切除された口蓋扁桃腺は、外来病原体と宿主免疫系との間の相互作用を研究するためのBリンパ球およびTリンパ球の便利なアクセス可能な供給源を提供します。このビデオプロトコルでは、外科的に切除したヒト口蓋扁桃腺の解剖と処理、続いて同じ組織サンプルから個々のB細胞集団とT細胞集団を単離する方法について説明します。抗体依存性アフィニティープロトコルを使用して、扁桃菌のBリンパ球とTリンパ球を効率的に分離する方法を紹介します。さらに、この方法を使用して、ヒトアデノウイルスが扁桃T細胞画分に特異的に感染することを実証します。確立されたプロトコルは、一般に、扁桃菌のB細胞およびT細胞集団を効率的かつ迅速に分離し、扁桃菌の免疫応答におけるさまざまな種類の病原体の役割を研究するために適用できます。

概要

扁桃腺は、上部気道消化管の上皮の下にあり、接触している不完全にカプセル化されたリンパ組織の集まりです。通常、「扁桃腺」という用語は、咽頭の口腔部分の側壁に位置する口蓋扁桃を指します。対になった口蓋扁桃腺は、鼻咽頭扁桃腺(アデノイド)、対になった卵管扁桃腺、および舌扁桃腺とともに、いわゆる「ワルデイヤーリング」を構成します。後者は、吸入または摂取された病原体と気道消化管のリンパ組織との間の最初の接触に関与しています^1,2。実際、多くの報告により、細菌抗原とウイルス抗原の両方が口蓋扁桃腺組織サンプル^2-6で検出できることが示されています。

>jove_content<口蓋扁桃腺は、層状の扁平上皮非角化上皮によって覆われた密集したリンパ組織で構成されています。扁桃腺には多数の陰窩、上皮陥入があり、それが実質を貫通して表面積を増加させます。組織学的には、口蓋扁桃腺には、B細胞の成熟と分化の部位である胚中心を持つ多数のリンパ濾胞が含まれています(B細胞領域)。同様に、口蓋扁桃腺にはT細胞が含まれ、T細胞は主に卵胞外領域(T細胞領域)に位置しています。B細胞およびT細胞に加えて、口蓋扁桃腺^1,2でも種々の濾胞樹状細胞を検出することができる。

その解剖学的位置により、口蓋扁桃腺は外科的介入によって容易にアクセスすることができます。たとえば、扁桃摘出術として知られる扁桃腺の外科的切除は、世界中で日常的に行われています⁷。扁桃過形成の小児では、扁桃腺の部分的な外科的切除(扁桃切開術)が使用されることがあり、患者への術後の痛みが少なくなります。扁桃腺にさまざまな病原体が蓄積することを考えると、外科的に除去された扁桃腺は、扁桃リンパ球機能に対するウイルスおよび細菌剤の影響を研究するユニークな機会を提供します^2,8。さらに、一部の病原体が特定の細胞亜集団に存在することを好むかどうかを研究することが可能である⁹。さらに、扁桃腺はBリンパ球の豊富な供給源であるため、単離された扁桃Bリンパ球を効率的に使用して、さまざまなB細胞亜集団の活性を研究することができます¹⁰。ただし、口蓋扁桃腺にはさまざまな種類の細胞が混在しているため、さまざまな細胞亜集団を分離する効率的な方法が必要です。

ここでは、磁気活性化細胞分離技術を使用して、ヒト口蓋扁桃腺から扁桃体BおよびT細胞集団を効率的かつ迅速に分離するための簡単な方法について説明します（図1）。ここで説明する方法は、口蓋扁桃腺などのヒトリンパ器官におけるさまざまな感染性病原体の役割を評価したい科学者に役立ちます。

プロトコル

プロトコルは、ヒト患者材料からのリンパ球様細胞の単離を記載し、したがって、倫理的な承認を必要とします。本研究で行われた作業は、ウプサラ倫理審査委員会（DNR。387分の2013）によって付与されました。

ヒトパラティーノ扁桃腺から単核細胞（MNCを）の1の単離

注意：血液、組織または体液のようなヒト由来の全てのシールドの材料は、感染した可能性材料とみなされるべきです。したがって、ヒト組織を処理するための推奨されるバイオセーフティ慣行に従うべきです。

注：汚染を避けるために、全ての溶液及び細胞培養装置は、無菌でなければなりません。全ての緩衝液および溶液は、事前に冷却し、氷上に保持する必要があります。扁桃組織および単離した細胞を保持し、氷上で処理する必要があります。

1. 扁桃摘出やへんとう切除（図2）を受けた患者からの新鮮な扁桃腺を取得します。組織clumプランジ氷冷滅菌ハンクス平衡塩溶液を充填した50 ml遠心管（HBSS）、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、10 mMのグルタミン、0.05 mg / mlのゲンタマイシンおよび1％抗生物質 - 抗真菌ミックス（ペニシリン、にPSストレプトマイシン及びアンホテリシンB）。
2. 氷の上に常時水没扁桃組織サンプルを用いてチューブを保管してください。できるだけ早く扁桃腺を処理しようとせず、遅くとも3時間よりも外科的除去後。
3. 氷上で60ミリメートルのプラスチック細胞培養プレートに扁桃腺を置き、HBSSで湿らせたティッシュを維持します。扁桃表面からのきれいなピンセットで目に見える血液凝固、脂肪および結合組織を除去します。
4. 5ミリリットルのHBSSを含む新しい60ミリメートルの細胞培養プレートを使用してください。はさみおよび/またはメスの無菌のペアを使用して3〜10ミリメートルの断片に扁桃組織の塊をカットします。
5. HBSS 10mlのを含む新しい60ミリメートルの細胞培養プレートを準備し、HBSS溶液中に100μmのプラスチック製セルストレーナーを配置します。
6. ディス転送滅菌ピンセットを用いて細胞ストレーナーに扁桃腺フラグメントをected。プラスチックシリンジのプランジャの端を使用して、スムーズにセルストレーナーを介して組織片を絞ります。扁桃腺断片が完全にHBSS中に浸漬されていることを確認します。
7. 組織が残存して細胞ストレーナーを廃棄し、50mlプラスチック遠心管に60 mmの細胞培養プレートから得られた細胞懸濁液を移します。ステップ1.8および1.9を進めながら、氷上でチューブを残します。
8. 大きさが2cm（ 図2）よりも大きい扁桃腺の場合には、ストレーナメッシュの目詰まりを回避するために、2つのセルストレーナーで扁桃腺断片を絞ります。
9. 細胞懸濁液を35 mlの最終容積を得ます。
   注：このステップでは、凍結保存（セクション2を参照）の細胞懸濁液を調製することが可能です。
10. 新しい50ml遠心管にフィコール等密度勾配溶液10mlを加えます。静か細胞suspensをオーバーレイイオン密度勾配液の上に（ステップ1.9）。細胞懸濁液および密度勾配溶液の混合を避けます。
    注：密度勾配溶液を室温まで加温しなければなりません。
11. RTで20分間、700×gで、スイングアウトローター中で細胞懸濁液を遠心。勾配が中断される可能性があり、高速ブレーキとして遠心分離機のブレーキ機能をアクティブにしないでください。また、遠心分離器で利用可能な最低の加速関数を使用します。
    注：この遠心分離工程の後、チューブの底に沈殿物として界面でふわふわした白色層、および赤血球（RBC）、線維芽細胞および細胞残屑などのMNCを観察します。
12. 慎重に10ミリリットルピペットを用いて、多国籍企業層を収集します。新しい50ミリリットルの遠心管に細胞懸濁液を置きます。
13. 細胞懸濁液に氷冷PBS 25 mlを加え、4℃でスイングアウトローター中で5分間300×gでチューブをスピン。
14. 25ミリリットルピペットを用いて上清を削除細胞ペレットの洗浄工程をさらに2回繰り返します。最後のPBS 15mlに細胞ペレットを再懸濁します。
    注：最後の洗浄工程の後に、（セクション2を参照）の細胞懸濁液を凍結保存することが可能です。
15. 血球計数器細胞計数室に10μlの細胞懸濁液を適用し、顕微鏡下で細胞数をカウントします。後続の磁気ビーズ分離に15 mlの遠心管中の細胞の適切な量（例えば、2-3×10 ^7）を分注します。ステップ3.2まで氷上にこのアリコートを保管してください。

扁桃細胞の凍結保存2.

1. 凍結培地（90％FBSおよび10％DMSO）を準備し、氷の上に保管してください。長期保存のために-20℃で凍結メディアを保持します。
2. 血球計数器の細胞計数室（ステップ1.15）を用いて細胞の総数を決定します。希望の凍結細胞密度に応じて凍結媒体の必要量を計算する（例えば、10 ^7細胞凍結培地のS / mlで）。
3. 5分間300×gで細胞懸濁液を遠心。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、（ステップ2.1から）を氷冷凍結培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
4. 液体窒素中で長期保存のために設計され、滅菌バイアル中に細胞懸濁液1mlのアリコートを分配します。イソプロパノール室でバイアルを凍結し、-80°のCO / Nでそれらを格納します。長期保存のために貯蔵タンクまたは-140℃の細胞冷凍庫を含む液体窒素中にバイアルを転送します。
5. 凍結細胞とのバイアルを解凍し、37℃の水浴中で急速にそれらを暖めます。解凍した直後と、15mlの遠心管中で（サプリメント、ステップ1.1）、予め温めておいたHBSS 10mlの中に細胞懸濁液を分散させます。 、5分間300×gでチューブをスピンHBSSを除去し、（サプリメントと、ステップ1.1）HBSS中の所望の細胞密度で細胞ペレットを再懸濁。
   注意：多国籍企業AFの実行可能性をター解凍は死細胞の存在は、精製されたBおよびTリンパ球の最終収率が低下するので、重要です。
   注：細胞単離の効率を低下させる、細胞生存率が80％、次に我々の経験によります。

扁桃多国籍企業からのTリンパ球の人口の3ポジティブ選択

注1：このプロトコルは、CD3抗体に結合された磁気ビーズを使用して、扁桃多国籍企業からのヒトCD3 ^{+ Tリンパ球の}正の選択に基づいています。これは、新鮮な（セクション1）又は冷凍（セクション2）多国籍企業から、このセクションを開始することが可能となります。

注2：3×10 ⁷の多国籍企業から開始します。分離カラムが詰まることがあり、これは、分離効率が低下するので、この細胞数を超えないようにしてください。より多くの細胞が処理される場合は、より大きな列を使用します。このプロトコルで使用されるボリュームは、実験的に細胞たちの数のために最適化されています私たちの実験で編。

1. 分離緩衝液[PBS（pH7.2）中、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA]を準備します。 4℃で0.45μmフィルターとストアを介して分離バッファをフィルタリングします。
2. 4℃で5分間、300×gでのMNC懸濁液（ステップ1.14）をスピン。氷冷分離緩衝液の240μlの（10 ⁷個の細胞あたり80μl）をで得られた細胞ペレットを再懸濁します。無菌の2mlチューブに細胞懸濁液を転送します。
3. 細胞溶液にCD3磁気抗体20μlのを追加します。懸濁液中の細胞を維持するために連続的に穏やかに混合しながら4℃で1時間、チューブをインキュベートします。
4. 細胞を洗浄し、5 mlの氷冷分離緩衝液を含む15 mlのチューブに細胞懸濁液の全てを転送します。
5. スイングアウトローターで4℃で10分間300×gでチューブを遠心。
6. 一方、磁気分離と列を設定します。スタンドに磁気分離器を取り付け、SEPARで列を配置レータ。氷冷分離緩衝液500μlを適用することにより、カラムを洗浄。フロースルーを捨てます。
7. 列の下に新しい15ミリリットルのコレクションチューブを置きます。氷の上にコレクションチューブを保管してください。
8. ピペットで上清（ステップ3.5）を破棄し、ゆっくりと500μlの分離バッファで細胞ペレットを再懸濁します。予め洗浄したカラムの上に細胞懸濁液を適用し、それを介して、実行してみましょう。
   注：細胞塊は、カラムを詰まらせるので、流量を減少させることができます。この問題を回避するには、列の上に40μmのプラスチック製セルストレーナーを配置します。このメッシュを通して細胞を渡すと、非常にこの方法の効率を改善します。
9. 分離緩衝液1.5mlの（10 ^{7個の細胞}のための500μl）を用いてカラムを4回洗浄します。次の洗浄工程を適用する前に、（液体が列で観察されるべきではない）空に列リザーバのを待ちます。
   注：Bリンパ球画分としてみなさCD3非標識細胞を得る、そのままコレクションチューブに溶出しました。
10. 新しい15ミリリットルのコレクションチューブにセパレーターと場所から列を削除します。ピペットカラムに分離緩衝液2mlの。 Tリンパ球画分としてみなされる正に選択されたTリンパ球を、溶出カラム付属のプランジャーを使用して。
11. 必要に応じて精製された細胞（ステップ1.15）の数を決定します。細胞懸濁液は現在、下流の実験の準備ができています。

単離した扁桃BおよびTリンパ球の4フローサイトメトリー分析

注意：パラホルムアルデヒドソリューションは、刺激物と疑われる発がん性物質です。適切な保護衣、手袋、眼/顔面用の保護具を着用します。

注1：このプロトコルは、（FACS）分析を蛍光活性化細胞選別によって分離されたB細胞およびT細胞を直接染色する方法が記載されています。この工程の主な目的は、単離された細胞集団のAFの純度を評価することですターCD3抗体磁気分離。 BおよびT細胞マーカー、フルオロフォア結合モノクローナル抗体CD20-FITCおよびCD2-APC確立し、この目的のために、使用されています。また、アイソタイプコントロール抗体を含めることが非常にCD2とCD20抗体（ステップ4.8を参照）の非特異的結合 "背景"を区別することをお勧めします。

注2：これは、染色時まで4℃で暗所で1％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液に精製された細胞画分を維持することが可能である（例えば、次の日。）が。染色およびFACS分析の間の時間間隔がある場合にも同じ手順が適用可能です。どちらの場合も、細胞が染色前またはFACS分析にPBSA（0.2％BSAを含有するPBS）緩衝液で適切に洗浄する必要があることを覚えておいてください。

1. ステップ1.15からの多国籍企業の6×10 ^{6個の細胞} （前の列に適用する）、ステップ3.9およびステップ3.10からのTリンパ球画分からのBリンパ球画分を取り出し。
2. 細胞をスピンスイングアウトローターを用いて4℃で5分間、300×gで懸濁液。
3. ピペットで上清を除去し、氷冷PBSA 1mlで一度細胞ペレットを洗浄します。 4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液をスピン。ピペットで上清を除去し、再懸濁 氷冷PBSAバッファー600μlの細胞。
4. FACSチューブの底に100μlの細胞懸濁液を追加します。
5. 各チューブに、10％の熱不活性化ヒト血清を含む100μlのPBSを加え、よく混ぜ、氷上に〜RTで1分または20分間インキュベートします。
   注：Bリンパ球は、Fc受容体を運びます。 Fcをブロックするために精製された細胞画分を、10％熱不活性化ヒト血清と共にインキュベートした受容体。ヒト血清を1時間56℃でインキュベーションすることにより熱不活性化です。 -20℃で凍結小分けとストアへの熱不活性化血清を分割します。
6. SWで4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心るアウトローター。
7. ピペットで上清を除去し、1mlのPBSAで細胞ペレットを洗浄します。遠心分離（4℃で5分間、300×gで）を繰り返します。
8. 氷の上に各チューブに100μlのPBSAを追加します。製造業者の推奨に従って、フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体の適切な量を追加します（例えば、抗CD2020μlのおよび/ ​​またはPBSA100μlの抗CD2抗体を5μl）。注意：FACS分析のために十分な制御管を割り当てることを忘れないでください。このプロトコルでは、次のコントロールが含まれるべきである：1）細胞は、個々に、抗CD2および抗CD20抗体で染色し、抗CD2で染色した2）細胞と抗CD20アイソタイプ対照抗体単独で及び、3）細胞を添加していません抗体の。
9. 簡単に説明すると、チューブをボルテックスし、暗所で4℃で30分間インキュベートします。
10. PBSAで2回洗浄します。サンプルに1％PFA溶液2mlを追加します。細胞は4でPFA溶液中に残ってみよう76; C暗所でのFACS分析時まで。
11. 直ちにFACS機でサンプルを実行する前に、（4℃で5分間、300×gで）をPBSAで細胞を2回洗浄します。 1mlのPBSと再懸濁サンプルを前に、フローサイトメーター上で分離し、光から保護し、4℃（または氷上）で保ちます。
12. メーカーフローサイトメーターからのプロトコルに従って、FACSソーティングを行います。

単離した扁桃BおよびTリンパ球におけるアデノウイルスDNAの5 PCR検出

注1：アデノウイルスヘキソン遺伝子プライマーはAdRJC1（5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 '）及び^{AdRJC2（5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'）11}です。これらのプライマーは、139塩基対のアンプリコンを生成します。ホスト18S rRNA遺伝子を、プライマーtp206（5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 '）及びtp207（5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'）を用いて検出することができます。予想されるアンプリコンサイズは300 bpです。

注2：すべてのPCRランは、陰性対照（蒸留H _{2 O）}およびヒトアデノウイルス5型¹²に感染したヒトB細胞株（BJAB）から得られた陽性DNAコントロールを含んでいます。

1. シリカ膜ベースのカラム精製法を用いて、（少なくとも1×10 ^{6個の細胞} 、ステップ3.11から）のDNAを抽出します。フェノールとグアニジンイソチオシアネート液^13を用いてRNAを抽出します。
2. 20μlの総容量で、1×HF緩衝液を含む反応混合物にBおよびTリンパ球からの100ngのDNAを加えるデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（のdNTP）の0.2mMの各プライマーの0.25μMと高忠実度DNAポリメラーゼの1 U。
3. 以下のサイクル条件でPCR増幅を実行します。30秒、72℃10秒、67℃（ヘキソン）または58℃（18S rRNAの）98℃の30サイクル、続いて98℃で30秒の変性、 30秒間。 PCR反応は、72℃で7分間の最終伸長工程で終了しました。
4. 得られたPCR amplifを分離1×TBE中の1.5％アガロースゲル上でication製品は、緩衝液及び核酸染色で染色することによって期待されるバンドを可視化します。

結果

BおよびTリンパ球の高度に精製された亜集団における扁桃のMNC結果の効率的な分離。これは、（ 図3A）は、それぞれ、BおよびTリンパ球集団を検出するために、抗CD20および抗CD2抗体を用いたFACS分析によって確認しました。 BおよびTリンパ球の亜集団（ 図3B）の両方からの細胞の混合物である細胞画分中のMNCの結果とは対照的に、非効率的な分離。

単離された扁桃B及びTリンパ球（ 図3A）は、核酸単離のような下流の分析のために十分な品質のものです。現在のプロトコルでは、DNA及びRNAがBから抽出し、Tリンパ球は、アデノウイルスDNA及び細胞RNAを検出するために利用されます。結果は扁桃Tリンパ球におけるアデノウイルスのDNAを特異的に検出する（ 図4）を示します。また、扁桃BおよびTリンパ球から単離されたRNAはdownstreaのための十分な質と量であります m個のアプリケーション（ 図5）。

ディスカッション

このプロトコルの結果に影響を与える最も重要な要因の一つは、出発原料として、新鮮な扁桃体の使用です。したがって、扁桃サンプルは手術後3時間以内に処理しなければなりません。扁桃腺は、大人と子供の両方から得ることができました。子供から扁桃物質が原因で扁桃腺（へんとう切除）の部分的な外科的除去に通常小さいです。そのため、多国籍企業の数が少ない扁桃摘出サンプル（1×10 ⁸ -2×10 ^9）と比較されるへんとう切除サンプル（1×10 ⁷ -1×10 ^8）から得られます。しかし、細胞単離工程にかかわらず、手術のタイプと同じであろう。

磁気活性化細胞選別法から得られた細胞の亜集団の純度を最大化することは、いくつかの最適化が必要になります。 CD3抗体と磁気量およびインキュベーション時間、カラムに適用される多国籍企業の数は、オプトインする必要があります主な要因でありますimized。あまりにも多くの細胞を適用すると、カラムの目詰まりや細胞亜集団の非効率的な濃縮になります。このプロトコルの最適化の中、当社は、分離...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	Gibco	14175-053	5% ウシ胎児血清 (FBS)、10 mM グルタミンを含む    0.05 mg / mlゲンタマイシンと1%抗生物質-抗真菌剤混合物
培地			90%FBSおよび10%DMSO
MACS緩衝液			PBS(pH 7.2)、0.5%BSAおよび2mM EDTA
PBSA			0.2% BSA
PFA			PBS 1% パラホルムアルデヒド (PFA) を含む PBS。新鮮に作る。PFAは発がん性が疑われています。手袋とゴーグルを着用してください。
抗生物質と抗真菌剤の混合物	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris はさみ	フィッシャーサイエンティフィ
使い捨てメス	Swann-Morton	REF 0501
100 μm プラスチックセルストレーナー	Corning Life Sciences	352360
40 μm プラスチックセルストレーナー	Corning Life Sciences	352340
2 mlプラスチックシリンジ	BD Biosciences
15 ml 円錐形遠心分離管	SARSTEDT	62554502
50 ml 円錐形遠心分離管	SARSTEDT	62547254
固定角度またはスイングバケットローター付き低速遠心分離機	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll溶液
子牛胎児血清	バイオロジカルインダストリー	ズ 040071A
ジメチルスルホキシド (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS ヒト CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS セパレーター (オクト MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
ウシ血清アルブミン (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 アロフィコシアニン (CD2-APC)	BDバイオサイエンス
560642 CD20をフルオレセインイソチオシアネート(CD20-FITC)に結合させたもの	BDバイオサイエンス
ヒト血清	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ	Thermo Scientific	F-530L
FACS チューブ	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII フローサイトメーター	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1ソフトウェア	BD Biosciences
ヌクレオスピン血液	Macherey-Nagel	740951.50	DNA分離キット
TRIzol  試薬	Life technologies	15596	RNA単離試薬
血球計算盤	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030 cell	counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain